在世界六大蒸馏酒中，白酒酿造历史最为悠久。相比于其他蒸馏酒，白酒的生产工艺最复杂，发酵周期最长，产量最大。白酒的生产是以谷物为原料，酒曲为糖化剂、多种微生物共同发酵的过程，正是因为这种特殊的酿造工艺，使其在蒸馏酒中占据了重要的地位[1-2]。白酒口感浓郁、风味独特，是中国最受欢迎的一类酒精类饮品。目前，全国共有37 000 多家白酒生产企业，白酒的年产量达到74.1 亿L，利润收入超过1 585 亿元[3-4]。浓香型作为中国白酒四大基本香型之一，具有窖香浓郁、入口绵甜、丰满协调、回味悠长的特点，占据了中国白酒市场份额的一半以上[5-6]，且位居所有香型白酒销售额榜首。
传统的浓香型白酒发酵是一个典型的泥窖固态发酵过程[7]。窖泥作为酿酒微生物的载体，不仅为微生物提供了适宜的生存环境，而且在白酒发酵期间也发挥了非常重要的作用，被称为“微生物黄金”[8-10]。在浓香型白酒发酵的过程中，窖泥为酒醅提供了源源不断的微生物，对浓香型白酒中的主要香气成分起着至关重要的作用，窖泥的品质直接决定了浓香型白酒的品质[11-14]。
然而，采用传统泥窖生产的浓香型白酒，在入窖和起窖时极为不便，往往需要依靠大量的人力劳动，劳动强度大，机械化程度低，且依靠人力入窖起窖时，很容易破坏窖池表面的优质窖泥，对浓香型白酒的品质造成一定的影响[15]。己酸菌、乳酸菌、酪酸梭菌是窖泥中的优势菌[16]，也是浓香型白酒生产中非常重要的产酸微生物，由它们代谢产生的酸类物质与大曲发酵产生的酒精生成己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯，合称为四大酯[17-19]。其中，己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味成分，赋予了浓香型白酒独特的窖香[20]。在以往的研究中，将己酸菌与红曲霉、产酯酵母、甲烷菌等酿酒微生物复配得到复合己酸菌，研究结果表明，复合己酸菌发酵得到的酒体要优于纯种菌株发酵[21-22]，但其稳定性较差，利用微生物固定化技术可有效提高游离微生物的稳定性。微生物固定化技术是将微生物之类的生物催化剂，通过范德华力和离子型氢键的静电相互作用固定到某载体中，可以使微生物保持一定的密度和活性，比游离菌具有更好的环境耐受性。如果能够实现固定化复合己酸菌进行无窖泥发酵生产浓香型白酒，不仅可以避免入窖起窖时破坏表层优质窖泥的问题，还可以降低工人的劳动强度，减轻工人的劳动负担，且有利于实现机械化生产。
本研究采用稻壳、玉米芯、丝瓜络为固定化载体材料，对3 种材料固定复合己酸菌的固载量进行比较，选择固载量较高的载体通过单因素、响应面、神经网络结合遗传算法等试验，对载体吸附复合己酸菌的工艺条件进行优化，并将其应用于浓香型白酒发酵体系中，以期为浓香型白酒的无窖泥生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
稻壳、玉米芯、丝瓜络、高粱、浓香型大曲:市售；复合己酸菌:湖北工业大学酿酒中试基地实验室保存。
酵母浸膏（生化试剂）:北京双旋微生物培养基制品厂；乙酸钠、无水硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸钙、石蜡、无水乙醇（均为分析纯）:国药集团上海有限公司。
1.2 仪器与设备
MJP-250 恒温培养箱、PHM-9123A 电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司；DM1000 LED 生物显微镜:徕卡显微系统（上海）有限公司；HNYC-203T智能恒温振荡器:天津欧诺仪器股份有限公司；78201气相色谱仪:美国安捷伦公司。
1.3 试验方法
1.3.1 固载量的测定
以超声后的1 mL 液体中所含的细菌总数为总固载量，将固定化载体放入1 L 烧杯中，加蒸馏水500 mL，超声10 min 后用血球计数板计数，测其总固载量[23]。
单位固载量的计算公式如下。
式中:x 为单位固载量，个/g；m 为总固载量，个/mL；n 为固定化载体质量，g。
1.3.2 酒体理化指标的测定
参考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》[24]测定酒体的酒精度、总酸、总酯、酸酯总量、己酸乙酯含量等理化指标。
1.3.3 固定化载体的制备
将所需的稻壳、玉米芯、去籽丝瓜络，放入沸水中多次煮沸以去除其他杂质。多次煮沸直至液体无颜色变化，将载体捞出，用蒸馏水清洗至无杂质（如纤维碎屑）出现即可。随后，放入105 ℃电热恒温鼓风干燥箱进行烘干，并在121 ℃灭菌20 min[25-26]。称取5 g 稻壳、玉米芯或丝瓜络加入到已培养好的250 mL 复合己酸菌中，在34 ℃恒温培养箱中固定48 h 后，捞出并沥干培养基液体成分，即为固定化载体[23]。
1.3.4 单因素试验设计
以丝瓜络为固定复合己酸菌载体，以转速180 r/min、载体装载量2 g/100 mL、固定化时间48 h、固定化温度34 ℃为基础固定化条件。其他条件固定不变，分别在转速60、100、140、180、220 r/min，载体装载量0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL，固定化时间12、24、36、48、60 h，固定化温度30、32、34、36、38 ℃的条件下进行单因素试验。每组设3 个平行，以固载量为指标考察合适的因素水平范围。
1.3.5 Box-Behnken 优化试验
以固载量为指标，根据单因素试验结果，选取转速、固定化时间、固定化温度进行三因素三水平的Box-Behnken 优化试验，Box-Behnken 试验因素与水平如表1 所示。
表1 Box-Behnken 试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
水平-1 0 1 A 转速/（r/min）100 140 180 B 固定化时间/h 36 48 60 C 固定化温度/℃32 34 36
1.3.6 神经网络结合遗传算法优化试验
通过Matlab 2017a 软件设计神经网络模型，对固载量进行预测。神经网络包含一个输入层、一个隐藏层和一个输出层。输入层有3 个神经元（转速A、固定化时间B、固定化温度C），输出层有一个神经元（固载量）。设置最大训练次数为10 000，直到预测值与实际输出结果之间的均误差小于10-3，最后再用遗传算法对神经网络分析得到的模型进行最优值求解。
1.3.7 浓香型白酒无窖泥发酵验证试验
利用神经网络得到丝瓜络固定复合己酸菌的最佳工艺参数，并按此工艺条件制备固定化载体。以高粱为原料，浸泡16～18 h、初蒸（121 ℃、40 min）、复水1 h、复蒸（121 ℃、30 min）后摊晾，加入20%（质量分数）的浓香型酒曲，拌匀后入坛发酵。试验组按粮醅的3%（质量分数）添加量放入丝瓜络载体于陶坛底部，并用高粱将其压实，以排除丝瓜络孔隙中的空气，为复合己酸菌营造无氧环境。压实后用高粱装满陶坛，液封发酵。以未添加丝瓜络载体的浓香型白酒为空白组，以传统窖泥发酵的浓香型白酒为对照组。发酵时间为30 d，进行3 次平行试验。
1.4 统计学分析
利用Microsoft Office Excel 2010、Origin 2021b、Design-Expert 13、Matlab 2017a 软件对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同载体单位固载量的比较
对稻壳、玉米芯和丝瓜络固定复合己酸菌的单位固载量进行测定，结果如图1 所示。
图1 不同固定化载体的比较
Fig.1 Comparison of different immobilization carriers
由图1 可知，稻壳、丝瓜络、玉米芯的单位固载量分别为1.02×109、1.38×109、1.21×109 个/g。丝瓜络的单位固载量最高，这可能是因为丝瓜络表面粗糙、比表面积较大、传质性能较佳，能在较短的固定化时间内达到较大的单位固载量，有利于微生物附着[27]。与丝瓜络和玉米芯相比，稻壳表面较为光滑，供菌体附着的位点较少；玉米芯结构较致密，比表面积较小，在较短的固定化时间内菌体无法大量进入玉米芯的孔隙中。蒋奇等[28]研究了玉米芯、花生壳、丝瓜络、麦秸、棉秆、稻草、稻壳、芦苇等8 种农作物废弃物的生物附着能力，结果同样表明丝瓜络是理想的生物载体。因此，后续试验选择丝瓜络作为固定化复合己酸菌的载体。
2.2 单因素试验优化丝瓜络固定复合己酸菌
2.2.1 转速对单位固载量的影响转速对丝瓜络单位固载量的影响如图2 所示。
图2 转速对单位固载量的影响
Fig.2 Effect of rotational speed on the unit immobilization amount
由图2 可知，随着转速的增加载体单位固载量呈现先升高后降低的趋势。当转速低于140 r/min 时，不利于菌体的吸附，这可能是因为菌体自身的下沉作用远远大于横向吸附的作用。载体对微生物的吸附主要是细胞表面与载体表面间的范德华力和离子型氢键的静电相互作用的结果，这种作用力相对较弱[29-30]。当转速为140 r/min，此时的单位固载量最高，丝瓜络的单位固载量达到2.41×109 个/g。当转速高于140 r/min时，载体单位固载量反而降低，故转速过高也不利于菌体的吸附。因此，后续选择转速100、140、180 r/min 进行Box-Behnkn 优化试验。
2.2.2 载体装载量对固载量的影响
载体装载量对丝瓜络固载量的影响如图3 所示。
图3 载体装载量对固载量的影响
Fig.3 Effect of carrier load on the immobilization amount
由图3 可知，随着载体装载量的增加，丝瓜络单位固载量呈现降低的趋势。这可能是因为载体添加过多，使菌体运动受阻，从而导致单位固载量降低[31]。而总固载量逐渐升高，是因为随着载体的增多，载体为复合己酸菌提供的可附着点也相应增加。当载体装载量为0.5 g/100 mL 时，单位固载量较高，而总固载量较低，这意味着在后续的白酒发酵试验中需要制备更多的培养基，造成操作成本的上升。而载体装载量为2.5 g/100 mL 时，总固载量较高，单位固载量却较低，意味着后续的发酵试验中需要添加更多的载体，也会造成操作成本的上升。因此，综合考虑选择载体装载量为1.5 g/100 mL 进行后续试验。
2.2.3 固定化时间对单位固载量的影响
固定化时间对丝瓜络单位固载量的影响如图4 所示。
图4 固定化时间对单位固载量的影响
Fig.4 Effect of immobilization time on the unit immobilization amount
由图4 可知，随着固定化时间的延长，单位固载量呈现先增加后降低的变化趋势，并在48 h 时单位固载量达到最高，为2.33×109 个/g。这是因为丝瓜络上具有较多的可供复合己酸菌附着的位点，固定化时间较短时，固定在丝瓜络载体上的生物量随固定化时间的延长而增加；但丝瓜络载体上可附着的菌体是一定的，当固定化时间超过48 h，营养物质不足导致菌体之间出现竞争，抑制了复合己酸菌的生长[32]。因此，后续选择 固 定 化 时 间36、48、60 h 进 行Box-Behnkn 优 化试验。
2.2.4 固定化温度对单位固载量的影响
固定化温度对丝瓜络单位固载量的影响如图5所示。
图5 固定化温度对单位固载量的影响
Fig.5 Effect of immobilization temperature on the unit immobilization amount
由图5 可知，随着固定化温度的升高，单位固载量呈现出先升高后降低的趋势。这可能是因为随着固定化温度的升高，复合己酸菌的活力和体内的酶活性也相应提高，进而加快菌体的生长繁殖速度，使单位固载量也相应提高，并在34 ℃时达到最大值。当固定化温度过高时，己酸菌的活力及酶活性降低甚至失活，从而使己酸菌的生长代谢受到抑制[33]，导致单位固载量也相应降低。因此，后续选择固定化温度32、34、36 ℃进行Box-Behnken 优化试验。
2.3 Box-Behnken 试验结果分析
为进一步确定丝瓜络固定复合己酸菌的最佳工艺参数，在单因素试验结果的基础上，以转速（A）、固定化时间（B）和固定化温度（C）为考察指标，丝瓜络单位固载量（Y）为响应值，根据Box-Behnken 试验设计原理，研究不同固定化参数之间的相互作用对丝瓜络单位固载量的影响，结果如表2 所示。
表2 Box-Behnken 试验结果
Table 2 Results of Box-Behnken experiment
试验号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 A 转速/（r/min）140 100 140 100 140 140 140 180 140 100 140 140 140 100 180 180 180 B 固定化时间/h 36 48 48 48 60 48 36 36 48 36 48 60 48 60 48 48 60 C 固定化温度/℃36 36 34 32 32 34 32 34 34 34 34 36 34 34 32 36 34 Y 丝瓜络单位固载量/（×109 个/g）响应面预测值1.63 1.44 2.35 1.42 1.91 2.35 1.54 2.07 2.35 1.28 2.35 1.90 2.35 1.69 2.10 2.17 2.30神经网络预测值1.65 1.41 2.35 1.41 1.94 2.35 1.52 2.08 2.35 1.30 2.35 1.95 2.35 1.68 2.12 2.15 2.25实际值1.63 1.41 2.33 1.42 1.92 2.38 1.51 2.07 2.37 1.32 2.37 1.93 2.33 1.69 2.13 2.17 2.27
利用Design-Expert 13 对表2 中的数据进行多元线性回归拟合，建立丝瓜络单位固载量（Y）对转速（A）、固定化时间（B）、固定化温度（C）的回归模型方程为Y=2.35+0.35A+0.16B+0.02C-0.043AB+0.013AC-0.027BC-0.24A2-0.28B2-0.33C2。
响应面作为一种统计工具，可以通过建立二次方程来评估自变量之间的相互作用对结果的影响[34]。为检验模拟方程的可行性，对丝瓜络单位固载量的模拟方程进行方差分析，结果如表3 所示。
表3 回归模型显著性分析结果
Table 3 Significance analysis results of regression model
注:**表示影响极显著，P<0.01；*表示影响显著，P<0.05。
来源模型ABCA B AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总和平方和2.34 0.980 0 0.204 8 0.003 2 0.007 2 0.000 6 0.003 0 0.244 5 0.320 6 0.461 2 0.008 7 0.006 1 0.002 5 2.35自由度91111111117341 6均方0.260 3 0.980 0 0.204 8 0.003 2 0.007 2 0.000 6 0.003 0 0.244 5 0.320 6 0.461 2 0.001 2 0.002 0 0.000 6 F 值210.25 791.49 165.41 2.58 5.84 0.504 8 2.44 197.43 258.95 372.46 3.26 P 值<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.152 0 0.046 4 0.500 4 0.162 0<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.141 9显著性*************
由表3 可知，该模型F 值为210.25，P 值<0.000 1，表示该回归模型极显著[35]；失拟项P 值0.141 9>0.05，说明模型的拟合度较好，可用该模型对丝瓜络单位固载量结果进行预测。模型决定系数R2 为0.996 3，调整决定系数R2adj 为0.991 6，说明模型试验误差小，回归拟合度高，能够准确预测各因素之间的相互作用对丝瓜络单位固载量的影响。由P 值可知，一次项A、B和二次项A2、B2、C2 对丝瓜络单位固载量的影响极显著（P<0.01）；交互项AB 对丝瓜络单位固载量的影响显著（P<0.05）；其他项对丝瓜络单位固载量的影响不显著（P>0.05）。由F 值可知，各因素对丝瓜络单位固载量的影响大小顺序依次为转速（A）>固定化时间（B）>固定化温度（C）。
对各因素之间的相互作用进行分析，绘制出响应面曲面图，如图6 所示。
图6 各因素交互作用对单位固载量的响应面图
Fig.6 Response surface diagrams of unit immobilization amount under the interaction of each two factors
在曲面图中，曲面弯曲程度越大，坡度越陡，则表示这两个因素对结果的影响越大。曲面图在底部的投影若是圆形或者近似圆形，则对结果不显著；若是椭圆形，则表示对结果的影响显著。由图6 可知，AB 交互作用的曲面弯曲程度较大，坡度较陡，说明两因素的交互作用对丝瓜络单位固载量的影响具有显著性，AC、BC 的交互作用不显著，这与方差结果一致。
通过Design-Expert 13 对数据进行分析，丝瓜络固定化的最佳工艺参数为转速159.1 r/min、固定化时间48.9 h、固定化温度35.1 ℃，此时单位固载量的理论值为2.39×109 个/g。考虑到实际可操作性，将丝瓜络固定化的工艺参数修正为转速160 r/min、固定化时间49 h、固定化温度35 ℃。对丝瓜络固定化复合己酸菌进行3 次平行验证试验，丝瓜络单位固载量的实际值为2.41×109 个/g，与预测值相差较小，说明该模型可靠。
2.4 神经网络分析结合遗传算法的优化试验结果
神经网络作为一种非线性计算建模方法，不需要预先拟合函数。与响应面法相比，神经网络模型在数据拟合、预测和优化方面显示出高灵活性和能力[36-37]。为进一步提高丝瓜络载体的单位固载量，后续通过神经网络对丝瓜络固定复合己酸菌的工艺条件进行优化。以Box-Behnkn 试验的17 组数据作为训练组，单因素的5 组数据作为测试组，神经网络的拓扑结构采用“3-11-1”进行神经网络训练，结果见图7。
图7 神经网络训练结果
Fig.7 Neural network training results
如图7 所示，训练进行80 次，预测值与实际值之间的均误差小于10-3，R=0.999 06，说明具有良好的线性关系，神经网络训练结果良好，可用于预测最佳发酵条件。利用遗传算法对数据进行分析得到最佳固定化参数为转速156.6 r/min、固定化时间52.9 h、固定化温度34.8 ℃，此时丝瓜络单位固载量的预测值为2.56×109 个/g。结合实际操作，将丝瓜络固定化工艺参数确定为转速为160 r/min、固定化时间为53 h、固定化温度为35 ℃。在此优化条件下，初始复合己酸菌浓度为1.39×108 个/mL，经固定后培养基中复合己酸菌浓度为1.18×108 个/mL，固载量比例为14.2%，丝瓜络单位固载量的实际值为2.63×109 个/g，实际值与预测值相差不大，说明该回归模型可靠，利用神经网络优化工艺可行。与未经过优化处理的丝瓜络载体（1.38×109 个/g）相比单位固载量提高了90.6%，且高于响应面优化结果（2.41×109 个/g）。
2.5 浓香型白酒无窖泥发酵验证试验
发酵结束后，将试验组、空白组与对照组的酒精度折合到60%vol。酒体理化指标测定结果如表4 所示。
表4 酒体理化指标
Table 4 Physical and chemical indexes of baijiu body
项目空白组对照组试验组国家标准酒精度/%vol 60.0 60.0 60.0 20.0～68.0总酸/（g/L）0.19 1.35 0.41≥0.25总酯/（g/L）0.63 2.63 1.22≥1.0酸酯总量/（mmol/L）10.54 52.32 20.79≥20.0己酸乙酯含量/（mg/100 mL）0.20 95.78 47.65≥40.0
由表4 可知，试验组的总酸、总酯、酸酯总量和己酸乙酯含量明显高于空白组。其中试验组的己酸乙酯含量为47.65 mg/100 mL，空白组己酸乙酯含量为0.20 mg/100 mL，试验组比空白组提高约240 倍。而试验组的总酸、总酯、酸酯总量和己酸乙酯含量均低于对照组，其中对照组己酸乙酯含量为95.78 mg/100 mL，比试验组高约1 倍。参照GB/T 10781.1—2021《白酒质量要求第1 部分:浓香型白酒》[38]中关于浓香型白酒的感官和理化要求，试验组和对照组的各项理化指标含量均符合国家标准。对酒体进行感官品评，所得白酒均无色透明、无悬浮物、无沉淀。空白组香气较为单一，口感较辛辣，味寡淡。相对于空白组，试验组窖香突出、入口醇厚绵甜；而对照组窖香浓郁、香味协调、浓香风格较为典型。后期通过对试验组的发酵工艺、因子水平进行优化，以期达到传统窖泥发酵的水平。
3 结论
本文以丝瓜络作为固定化载体，通过单因素试验、神经网络分析与遗传算法对其固定化复合己酸菌的工艺进行优化。结果表明，当转速160 r/min、载体添加量1.5 g/100 mL、固定化时间53 h、固定化温度35 ℃时，丝瓜络固定复合己酸菌的单位固载量可以达到2.63×109 个/g。将此条件下制得的丝瓜络载体用于浓香型白酒无窖泥发酵，所得浓香型白酒的己酸乙酯含量为47.65 mg/100 mL，较空白组提高了约240 倍。该研究为浓香型白酒的无窖泥发酵提供了参考。
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