蜂蜜来源于植物的花内蜜腺或在外蜜腺，蜂蜜中几乎60%以上为果糖、葡萄糖等，同时还含有氨基酸、多酚类、生物碱类、蛋白质、黄酮类、维生素类、微量元素等活性成分。研究表明，蜂蜜具有美容养颜、润肠通便、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒等生物活性[1-3]。蜂蜜掺假的主要手段是向蜂蜜中添加外源性糖类（如玉米糖浆、麦芽糖浆、蔗糖糖浆等）或采用低价蜂蜜冒充高价值单一品种花蜜[4]。如何进行蜂蜜真伪鉴别是目前国内外研究的重点方向之一。
氨基酸是蜂蜜中一种小分子化合物，受花源植物和花源气候及其土壤影响较大。大量试验证明，蜂蜜的储存时间、加工方式、采源地不同，其氨基酸含量会存在一定的差异。但是影响氨基酸含量的主要因素是花源性植物[5-7]。生物碱类化合物是一类主要存在于植物中具有含氮杂环结构的碱性物，具有显著的生理作用和毒性作用[8-9]。如苦参碱和氧化苦参碱具有抗肿瘤、抗炎症、调整心律、保护心脏、提高免疫力等多种功效，同时是一类高效广谱植物源杀虫剂[10-13]。槐果碱、氧化槐果碱具有保护心、肝、肺、肾、脑、血管以及抗心律失常作用，还具有升高白细胞以及镇静、催眠等中枢神经生理作用[14]。槐定碱对多种恶性肿瘤尤其是消化道恶性肿瘤有很好的疗效，且不良反应发生率低，还可通过抗氧化、抗炎途径表现出对心脑血管、急性肝损伤的保护作用。多酚类化合物是在植物性食物中发现的、具有潜在促进健康作用的化合物，可以抗氧化，并且对于一些慢性病有很好的预防作用。多酚类化合物可以清除体内的垃圾和毒素，消灭自由基，起到抗氧化的作用，对皮肤也有一定的好处，同时还可以起到降血压、降血脂和降胆固醇的功效，所以对于一些心脑血管疾病以及动脉硬化都有预防的作用。目前已经从蜂蜜中检测出槲皮素、芦丁、原儿茶酸等多种多酚类活性物质[15-17]。
主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种通过数据降维，将多个变量通过线性变换为少数综合变量，用简化的数据反映原始数据的多元统计分析方法。分层聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）利用确定的标准（如欧氏距离或曼哈坦）聚类计算样品之间的相关性，根据相关程度将其简化合并，更直观地对相似品种及组分进行综合比较[18-22]。目前PCA 和HCA 已广泛用于农产品品质差异研究。Dong等[23]用PCA 对10 个品种香菇的游离氨基酸（free amino acids，FAAs）和5′-核苷酸进行分析综合评价，认为PCA 和HCA 为品质综合评价体系的简化提供了方便。Sun 等[24]采用PCA 和HCA 对13 种野生食用菌FAAs 进行综合评价，结果表明该方法流程简化，区分效果较好。正交偏最小二乘回归分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）是一种有监督的判别分析统计方法，其运用PLS-DA（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）建立代谢物表达量与样品之间的关系模型，可降低样品组内差异、放大组间差异，排除无关因素对试验数据造成的影响，从而实现对不同样品的有效预测，在食品领域应用广泛[25-26]。
因此本研究对13 个品种的蜂蜜中氨基酸（amino acid，AAs）、多酚类化合物（plyphenol compounds，PCs）和生物碱类化合物（alkaloid compounds，ACs）的含量进行测定，采用化学计量学的方法（PCA、HCA 和OPLSDA）对其进行综合评价分析，以期为狼牙蜜的营养价值、食用价值、特征风味研究、品种筛选及产品开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
狼牙蜜、洋槐蜜、枣花蜜、油菜蜜、椴树蜜、土蜂蜜、黄芪蜜、百花蜜、枸杞蜜、桂花蜜、茴香蜜、山花蜜、菊花蜜:市售；掺假狼牙蜜1、掺假狼牙蜜2:甘肃食品检验研究院仪器分析测试中心。
17 种氨基酸标准混合使用液（100µmol/mL）、样品稀释液、茚三酮（分析纯）、流动相（A、B、C、D、F）样品稀释液:德国曼默博尔公司；芦丁、槲皮素、山奈酚、没食子酸、咖啡酸、高良姜素、苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱（均为标准品）、乙酸铵（色谱纯）:上海安谱实验科技股份有限公司；柚皮素、阿魏酸、香草酸、反式肉桂酸、咖啡酸苯乙基酯、3，4-二甲氧基肉桂酸、丁香酸、松鼠素、异阿魏酸、桑色素、原儿茶酸、香豆酸、犀草素、对香豆酸、芹菜素、迷迭香酸、杨梅素、白杨素、槐果碱标准品:美国斯坦福分析化学公司；氨水、浓盐酸（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸（分析纯）:天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈、甲醇、三氯甲烷（均为色谱纯）:德国默克公司；甲酸（色谱纯）:赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 仪器与设备
全自动氨基酸分析仪（XINAMINO ACID ANALYZER A300）:德国曼默博尔公司；超高效液相色谱-质谱联用仪（5500QTRAP）:美国AB Sciex 公司；电热恒温水浴锅（ICC RO 15）、涡旋混合器（VORTEX 3）:德国IKA 公司；电热恒温干燥烘箱（DHG-9145A）:甘易仪器设备（上海）有限公司；电子天平（ME303）:梅特勒托利多科技（中国）有限公司；高速冷冻离心机（Sorvall LYNX 4000）:美国Thermo 公司；超声波清洗器（S60H）:德国Elma 公司；氮吹仪（N-EVAP116）:美国Organomation 公司；微孔滤膜（0.22µm、0.45µm）:天津市津腾实验设备有限公司；水解管（25 mL）:上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水制备系统（Milli-Q IQ7000）:德国默克密理博公司；涡旋仪（VORTEX 3）:德国IKA 公司。
1.3 方法
1.3.1 AAs 分析
准确称取蜂蜜样品200 mg（精确到0.001 g）于25 mL 水解管中，加入10 mL 6 mol/L 盐酸溶液。混匀后，涡旋3 min。然后放入电热恒温干燥烘箱中110 ℃水解24 h。水解结束后，取出在氮吹仪上吹至近干。用样品稀释液定容至1 mL。20 000 r/min 离心3 min后经0.22µm 微孔滤膜过滤，采用全自动氨基酸分析仪测定。
1.3.2 PCs 分析
蜂蜜样品放置于室温，称取5 g（精确至0.001 g）蜂蜜样品于50 mL 离心管中，加入4 mL 超纯水，涡旋混匀5 min，使蜂蜜全部溶解，置于超声波清洗器中超声辅助提取10 min，用超纯水定容至10 mL，过0.22µm 微孔滤膜后上机测定。
1.3.3 ACs 分析
称取搅匀的蜂蜜样品2 g（准确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入3 mL 氨水使样品溶解，再加入10 mL三氯甲烷，涡旋3 min，超声30 min，8 000 r/min 离心5 min，用吸管将下层三氯甲烷层转移至新的50 mL 离心管中，用10 mL 三氯甲烷，反复洗涤吸管，洗涤液转移至残渣中经上述相同操作进行提取。重复此过程3 次，合并提取液于40 ℃氮气吹干。残留物以初始流动相溶解并定容至1 mL。经0.22µm 微孔滤膜过滤后，待测。
1.4 标准曲线制作
1.4.1 AAs 标准溶液的配制
1.4.1.1 混合标准中间液的配制准确吸取混合标准使用液1 mL 于100 mL 容量瓶中，用样品稀释液定容至，此浓度为1µmol/mL。
1.4.1.2 混合标准溶液的配制
准确吸取适量混合标准中间液（1µmol/mL）于10 mL 容量瓶中，用样品稀释液定容至刻度。此标准溶液浓度分别为25、50、60、80、100、200、250 nmol/mL。
1.4.2 PCs 标准溶液的配制
1.4.2.1 单一标准储备溶液的配制
称取适量标准品，分别溶于甲醇，配制成质量浓度为1.0 mg/mL 的单一标准储备液，-20 ℃保存。
1.4.2.2 混合标准中间溶液的配制
吸取各单一标准储备溶液100µL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，配制成1µg/mL 混合标准溶液，-20 ℃保存备用。
1.4.2.3 混合标准溶液的配制
用初始流动相作为溶剂配制浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 的混合标准溶液。
1.4.3 ACs 标准溶液的配制
1.4.3.1 混合标准储备液
准确称取适量苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱标准物质于100 mL 容量瓶，用乙腈溶解并定容。配制成浓度为100µg/mL 的标准储备溶液，4 ℃储存备用。
1.4.3.2 混合标准中间液
准确量取苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱混合标准储备溶液100µL，用乙腈定容至10 mL，配制成浓度为1µg/mL 的混合标准中间液。
1.4.3.3 基质标准系列工作液
取配制的混合标准中间液适量，用空白基质溶液稀释制成含苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 的标准系列工作液。
1.5 仪器条件
1.5.1 AAs 分析
AAs 分析检测器为二极管光度计；检测波长570、440 nm；色谱柱为阳离子交换柱；柱温40～70 ℃；进样体积20µL；流动相A、B、C、D、F；流速0.4 mL/min；柱后反应池温度115 ℃。
1.5.2 PCs 分析
PCs 分析色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD柱（1.9µm、2.1 mm×100 mm）；柱 温30 ℃；进 样 量5µL；流动相5 mmol/L 乙酸铵0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；流速0.25 mL/min；梯度洗脱:0～1.0 min，95%A；1.0～10.0 min，95%～10% A；10.0～12.0 min，5% A；12.0～12.1 min，5%～95%A；12.1～15.0 min，95%A。
离子源为电喷雾电离源（electron spray ionization，ESI）；离子化电压（ionspray voitage，IS）-4 000 V；喷雾气压力（ion source gas1，GS1）50 psi（1 psi=6.895 kPa）；辅助加热气压力（ion source gas 2，GS2）55 psi；辅助加热气温度（temperature，TEM）500 ℃；扫描方式为动态多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）；电离方式为负模式；气帘气压力（curtain gas，CUR）为35 psi。24 种多酚类化合物的质谱参数见表1。
表1 24 种多酚类化合物的质谱参数
Table 1 Mass spectrum parameters of 24 kinds of PCs
注:*为定量离子。
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24化合物没食子酸香豆酸原儿茶酸咖啡酸香草酸丁香酸杨梅酸芦丁对香豆酸异阿魏酸阿魏酸迷迭香酸3/4-二甲基肉桂酸犀草酸槲皮素桑色素反式肉桂酸芹菜素柚皮素山奈酚白杨素松鼠素高良姜素咖啡酸苯乙基酯保留时间/min 2.25 2.87 3.68 4.56 4.58 4.61 4.78 4.84 5.07 5.21 5.21 5.32 5.93 6.02 6.06 6.06 6.49 6.49 6.55 6.58 7.65 7.75 7.77 7.81母离子（m/z）169.0 139.1 153.0 178.7 167.2 197.2 317.2 609.3 163.0 193.3 194.1 359.3 207.3 285.3 301.2 301.3 147.3 268.9 271.1 285.1 253.2 255.0 269.0 283.4子离子（m/z）125.0*/79.0 94.8*/50.9 109.3*/91.0 135.1*/106.9 123.0*/108.3 121.1*/152.9 150.9*/137.0 300.0*/178.7 119.0*/147.2 134.1*/177.8 135.1*/178.9 161.1*/197.0 162.7*/102.7 132.8*/150.9 179.0*/150.7 151.0*/179.0 102.6*/119.1 117.0*/107.0 150.8*/119.1 158.9*/186.8 143.2*/208.8 106.8*/145.0 143.0*/195.0 134.7*/179.4去簇电压/V-90-55-66-90-77-85-70-150-80-70-133-85-77-134-70-105-74-100-100-130-150-130-77-128碰撞电压/V-18/-30-12/-22-18/-30-19/-30-16/-24-20/-16-30/-32-49/-51-17/-20-21/-16-21/-16-18/-18-13/-19-42/-35-23/-30-28/-24-15/-13-40/-40-25/-32-40/-40-38/-30-33/-32-45/-40-32/-23
1.5.3 ACs 分析
ACs 分析色谱柱为Waters ACQUITY UPLC®BEH C18（50 mm×2.1 mm、1.7 µm）；柱温30 ℃；进样体积10.0µL；流动相:A 为2 mmol 乙酸铵-0.1% 甲酸水溶液，B 为2 mmol 乙酸铵-0.1% 甲酸乙腈溶液；流速0.25 mL/min；梯度程序0～1.0 min，95%A；1.0～4.0 min，95%～10% A；4.0～6.0 min，10% A；6.0～6.1 min，10%～95%A；6.1～8.0 min，95%A。
离子源为电喷雾离子源；离子化电压+5 500 V；喷雾气压力50 psi；辅助加热气压力55 psi；辅助加热气温度500 ℃；扫描方式为动态多反应监测模式；电离方式为正模式。5 种苦参类生物碱的质谱参数见表2。
表2 5 种生物碱类化合物的质谱参数
Table 2 Mass spectrum parameters of five kinds of ACs
注:*为定量离子。
序号1 2 3 4 5化合物苦参碱槐定碱槐果碱氧化苦参碱氧化槐果碱保留时间/min 3.27 3.28 3.29 3.33 3.34母离子（m/z）249.3 249.2 247.3 265.3 263.2子离子（m/z）+80+80+60+105+70去簇电压/V 148.0*/176.1 120.1*/148.0 136.1*/179.3 205.2*/148.2 245.1*/203.2碰撞电压/V+42/+44+54/+44+42/+38+40/+39+35/+36
1.6 数据处理
将获得的AAs 数据采用amino Peak 软件进行数据处理，以各目标物的保留时间进行定性判断，同时绘制标准曲线对样品中的各目标物进行定量。将获得的PCs、ACs 数据分别采用AB Sciex MultiQuantTM 软件进行数据处理，以各目标物的保留时间作为筛查依据，以离子峰度比作为确证依据，进行定性分析。
2 结果与分析
2.1 AAs、PCs、ACs 标准图谱
AAs、PCs、ACs 标准图谱如图1 所示。
图1 AAs、PCs、ACs 标准图谱
Fig.1 Standard spectrogram of AAs，PCs，and ACs
由图1 可知，L-天冬氨酸（Asp）、L-苏氨酸（Thr）、L-丝氨酸（Ser）、L-谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、L-丙氨酸（Ala）、L-胱氨酸（Cys）、L-缬氨酸（Val）、L-蛋氨酸（Met）、L-异亮氨酸（Ile）、L-亮氨酸（Leu）、L-酪氨酸（Tyr）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-组氨酸（His）、L-赖氨酸（Lys）、L-精氨酸（Arg）的检测波长为570 nm，L-脯氨酸（Pro）的检测波长为440 nm。
2.2 不同品种蜂蜜的主要成分分析
对不同品种蜂蜜样品进行了多酚类、生物碱类和氨基酸总量等主要品质指标含量进行分析检测。
2.2.1 AAs 测试结果
不同种蜂蜜的氨基酸分析结果如表3 所示。
表3 蜂蜜中氨基酸含量
Table 3 Content of AAs in honey%
氨基酸种类Asp Thr Ser Glu Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys Arg Pro氨基酸总量狼牙蜜0.048 0.017 0.020 0.040 0.013 0.013 0.000 0.022 0.008 0.017 0.023 0.014 0.025 0.010 0.018 0.000 0.077 0.365洋槐蜜0.043 0.013 0.015 0.026 0.011 0.011 0.006 0.017 0.002 0.012 0.018 0.009 0.021 0.005 0.015 0.000 0.053 0.274枣花蜜0.000 0.000 0.037 0.018 0.015 0.019 0.008 0.024 0.005 0.018 0.028 0.001 0.037 0.008 0.017 0.000 0.030 0.265油菜蜜0.010 0.007 0.005 0.009 0.005 0.004 0.000 0.009 0.001 0.005 0.007 0.007 0.017 0.000 0.010 0.000 0.011 0.107椴树蜜0.000 0.000 0.000 0.000 0.010 0.009 0.010 0.000 0.006 0.013 0.014 0.000 0.019 0.000 0.012 0.000 0.015 0.107土蜂蜜0.072 0.035 0.033 0.068 0.024 0.026 0.010 0.044 0.003 0.037 0.056 0.032 0.056 0.016 0.024 0.000 0.122 0.658黄芪蜜0.042 0.013 0.013 0.025 0.011 0.010 0.008 0.018 0.003 0.012 0.018 0.013 0.037 0.007 0.012 0.000 0.023 0.266百花蜜0.104 0.016 0.023 0.053 0.014 0.016 0.007 0.022 0.004 0.017 0.023 0.011 0.032 0.008 0.017 0.000 0.054 0.420枸杞蜜0.041 0.014 0.016 0.033 0.012 0.012 0.006 0.018 0.005 0.014 0.019 0.010 0.020 0.008 0.016 0.000 0.080 0.322桂花蜜0.027 0.008 0.008 0.018 0.006 0.006 0.000 0.010 0.002 0.008 0.010 0.006 0.012 0.005 0.008 0.000 0.037 0.170茴香蜜0.149 0.057 0.051 0.160 0.039 0.052 0.024 0.053 0.001 0.057 0.114 0.025 0.059 0.013 0.076 0.000 0.197 1.126山花蜜0.050 0.018 0.020 0.039 0.016 0.014 0.007 0.024 0.007 0.017 0.027 0.013 0.026 0.010 0.018 0.000 0.065 0.369菊花蜜0.115 0.012 0.015 0.035 0.010 0.011 0.005 0.014 0.004 0.011 0.015 0.008 0.017 0.006 0.013 0.000 0.077 0.367
由表3 可知，不同品种蜂蜜中的氨基酸含量均存在差异，氨基酸总量在0.107%-1.126% 之间。茴香蜜中的氨基酸总量最高，其次为土蜂蜜，再次为山花蜜、菊花蜜和狼牙蜜，含量较低的为油菜蜜和椴树蜜。茴香蜜中的L-天冬氨酸（Asp）、L-脯氨酸（Pro）、）L-苯丙氨酸（Phe）、L-苏氨酸（Thr）、L-丝氨酸（Ser）、L-谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、L-丙氨酸（Ala）、L-胱氨酸（Cys）、L-缬氨酸（Val）、L-异亮氨酸（Ile）、L-亮氨酸（Leu）、L-赖氨酸（Lys）含量均较高，土蜂蜜中的L-组氨酸（His）、L-酪氨酸（Tyr）含量较高，狼牙蜜中的L-蛋氨酸（Met）含量较高。
2.2.2 PCs 测试结果
不同种蜂蜜多酚类化合物分析结果如表4 所示。由表4 可知，不同品种蜂蜜中的多酚类化合物含量均存在明显的差异，总多酚类化合物的含量为16.514～175.952 µg/kg。狼牙蜜中多酚类化合物的含量最高，其次为枣花蜜，再次为土蜂蜜和黄芪蜜，含量较低的为山花蜜和椴树蜜。狼牙蜜中的白杨素、没食子酸、高良姜素、杨梅酸、迷迭香酸、桑色素、原儿茶素、松鼠素、阿魏酸、山奈酚、犀草酸、异阿魏酸含量均较高，黄芪蜜中的咖啡酸、芹菜素、香豆酸、柚皮素、3，4-二甲基肉桂酸含量较高，茴香蜜中的对香豆酸含量较高，枣花蜜中的芦丁含量较高，土蜂蜜中的槲皮素含量较高，枣花蜜的丁香酸、香草酸含量较高，枸杞蜜中的反式肉桂酸含量较高。
表4 蜂蜜中多酚类化合物含量
Table 4 Content of PCs in honeyµg/kg
多酚化合物白杨素没食子酸高良姜素咖啡酸对香豆酸芹菜素迷迭香酸芦丁杨梅酸槲皮素香豆酸丁香酸柚皮素桑色素原儿茶酸松鼠素阿魏酸香草酸反式肉桂酸3，4-二甲基肉桂酸咖啡酸苯乙基酯山奈酚犀草酸异阿魏酸总多酚类化合物狼牙蜜1.972 18.684 1.102 4.548 6.719 0.929 3.121 2.483 3.065 8.389 35.595 4.811 1.653 9.368 12.805 13.817 6.533 6.970 1.703 2.293 0.000 19.819 5.816 3.757 175.952洋槐蜜0.000 0.928 0.000 3.468 12.951 0.775 1.659 2.479 0.000 2.142 4.670 1.871 0.167 2.345 9.424 4.540 5.071 3.303 0.393 5.727 0.000 2.742 0.419 2.657 67.730枣花蜜0.000 0.496 0.000 6.414 52.638 0.332 1.166 0.692 0.000 6.161 2.388 35.104 0.000 6.443 4.388 0.337 6.255 27.712 0.564 0.832 0.000 13.074 0.000 2.167 167.161油菜蜜0.000 0.824 0.000 7.060 0.839 1.445 2.541 0.714 0.000 0.000 0.000 0.399 0.000 0.000 1.760 0.352 1.631 1.156 0.170 0.894 0.000 0.960 0.362 0.848 21.954椴树蜜0.000 0.445 0.000 1.055 0.519 0.216 2.528 0.527 0.000 0.000 0.378 0.266 0.000 0.000 4.722 0.000 2.250 1.282 0.177 2.684 0.000 0.000 0.000 1.172 18.222土蜂蜜0.276 0.322 0.103 7.682 40.986 1.501 1.146 1.777 0.000 9.523 3.080 4.671 0.000 10.102 7.163 4.334 2.683 7.932 0.743 1.693 0.000 33.755 0.156 1.145 140.773黄芪蜜0.962 1.097 0.913 15.802 10.784 1.959 1.703 0.892 0.000 5.133 37.933 3.296 1.944 5.272 10.527 13.579 3.879 6.392 0.646 7.049 0.000 3.458 0.000 2.390 135.610百花蜜0.000 0.918 0.000 0.000 1.053 0.307 0.918 0.666 0.000 0.253 7.765 1.592 0.000 0.642 6.660 0.000 0.644 3.698 0.343 0.306 0.000 1.639 0.000 0.245 27.649枸杞蜜0.000 4.156 0.000 2.268 2.718 0.481 1.118 0.571 0.000 6.435 11.717 3.299 0.000 6.346 5.273 0.908 2.640 11.332 3.691 1.091 0.000 14.981 0.000 1.452 80.477桂花蜜0.000 0.983 0.000 3.084 1.084 0.532 1.236 0.746 0.000 0.607 4.898 1.473 0.000 0.910 1.905 2.856 3.350 2.820 0.821 0.870 0.000 5.440 0.016 1.830 35.461茴香蜜0.000 0.409 0.000 0.000 58.286 0.149 0.836 0.246 0.000 0.000 0.184 33.450 0.000 0.000 5.004 0.000 1.980 8.326 0.518 0.611 0.000 1.502 0.000 2.620 114.122山花蜜0.000 0.338 0.000 0.000 0.223 0.159 1.099 0.521 0.000 0.000 4.661 3.845 0.000 0.000 0.857 0.000 0.391 2.810 0.034 0.456 0.000 0.946 0.000 0.174 16.514菊花蜜0.000 0.307 0.000 3.501 2.737 0.266 0.955 0.514 0.000 1.662 0.254 5.600 0.000 1.759 6.694 0.087 4.063 16.292 0.491 1.067 0.000 4.254 0.000 1.468 51.972
2.2.3 ACs 测试结果
不同种蜂蜜生物碱类化合物分析结果如表5所示。
表5 蜂蜜中生物碱类化合物含量
Table 5 Content of ACs in honeyµg/kg
生物碱苦参碱槐定碱氧化槐果碱氧化苦参碱槐果碱总生物碱狼牙蜜0.769 0.882 5.987 1.915 2.247 11.800洋槐蜜0.035 0.030 0.370 0.308 0.046 0.788枣花蜜0.109 0.000 0.336 0.218 0.151 0.814油菜蜜0.000 0.000 0.071 0.008 0.013 0.092椴树蜜0.082 0.078 0.193 0.083 0.082 0.518土蜂蜜0.091 0.000 0.535 0.199 0.108 0.932黄芪蜜0.029 0.160 0.814 0.162 0.061 1.226百花蜜0.111 0.000 0.257 0.206 0.083 0.657枸杞蜜0.161 0.329 0.317 0.159 0.215 1.182桂花蜜0.275 0.391 0.396 0.187 0.439 1.689茴香蜜0.043 0.100 0.053 0.030 0.076 0.303山花蜜0.126 0.177 0.928 0.505 0.164 1.900菊花蜜0.012 0.000 0.036 0.193 0.009 0.250
由表5 可知，不同品种蜂蜜中的生物碱类化合物含量均存在较大的差异，总生物碱类化合物含量在0.092～11.800 µg/kg 之间。狼牙蜜中生物碱类化合物含量最高，其次为山花蜜，再次为桂花蜜，含量最低的为油菜蜜。狼牙蜜中的苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、槐果碱含量均为最高。
2.3 不同品种蜂蜜多元统计分析
2.3.1 PCA 分析
2.3.1.1 不同品种蜂蜜间的相关性分析
蜂蜜品质指标之间并非完全独立，而是具有一定相关性，相关性分析是衡量变量因素的相关密切程度。对蜂蜜品质指标进行相关性分析，可明确各指标间的关系。对15 份蜂蜜中的AAs、PCs 和ACs 含量进行相关性分析，具体见表6。
表6 蜂蜜18 个品质指标间的相关性
Table 6 Correlation among 18 quality indexes of honey
注:*表示相关性显著（P<0.05）；**表示相关性极显著（P<0.01）。
指标Asp Thr Ser Glu Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys Pro总生物碱总多酚Asp 1 0.790**0.618*0.814**0.696**0.702**0.560*0.675**-0.154 0.677**0.684**0.631*0.552*0.588*0.705**0.812**-0.191 0.128 Thr 1 0.751**0.960**0.907**0.890**0.720**0.906**-0.254 0.917**0.925**0.885**0.779**0.756**0.889**0.945**-0.079 0.318 Ser 1 0.816**0.897**0.909**0.696**0.929**-0.044 0.873**0.866**0.625*0.863**0.812**0.815**0.799**-0.126 0.610*Glu 1 0.927**0.940**0.797**0.892**-0.239 0.924**0.949**0.756**0.762**0.713**0.938**0.931**-0.085 0.306 Gly 1 0.987**0.869**0.929**-0.074 0.990**0.983**0.743**0.896**0.763**0.943**0.909**-0.181 0.444 Ala 1 0.872**0.909**-0.158 0.982**0.990**0.680**0.865**0.708**0.966**0.900**-0.194 0.436 Cys 1 0.702**-0.160 0.846**0.859**0.492 0.768**0.484 0.838**0.695**-0.391 0.225 Val 1-0.134 0.925**0.909**0.862**0.907**0.901**0.824**0.885**-0.080 0.551*Met 1-0.129-0.211-0.172-0.094 0.144-0.207-0.104 0.451 0.202 Ile 1 0.987**0.771**0.894**0.755**0.936**0.914**-0.160 0.449 Leu 1 0.728**0.854**0.698**0.971**0.909**-0.174 0.405 Tyr 1 0.773**0.842**0.611*0.797**0.019 0.411 Phe 1 0.782**0.757**0.720**-0.231 0.611*His 1 0.572*0.780**0.122 0.604*Lys 1 0.886**-0.177 0.334 Pro 1-0.059 0.375总生物碱总多酚1 0.315 1
由表6 可知，多个品质指标之间存在着显著的相关性。其中，总多酚与Ser、Val、Phe、His 呈显著正相关（P<0.05）；不同氨基酸之间普遍存在极显著正相关性（P<0.01）。根据各因子间相关性得出，各品质指标间存在一定的重叠，相关性较强，适合主成分分析。同时巴特利特球形度检验中显著性小于0.001，取样适切性量数（kaiser-meyer-olkin，KMO）为0.829，均表明本试验适用于主成分分析。
2.3.1.2 PCA 结果
以15 份样品的18 个主要品质指标为分析对象，利用SPSS Statistics 27.0 软件对其进行主成分分析，利用降维的原理，把原来较多的评价指标用较少的综合指标进行替代，可以保留原来的绝大多数信息，并把问题简单化，结果见表7、图2。
图2 碎石图
Fig.2 Scree plot
表7 主成分的特征值和贡献率
Table 7 Eigenvalues and contribution rates of principal components
主成分1 2特征值12.786 1.968贡献率/%71.032 13.931累计贡献率/%71.032 84.963
由表7、图2 可知，第1 主成分的贡献率为71.032%，第2 主成分的贡献率为13.931%，前2 个主成分的累计贡献率为84.963%，基本反映了所有品质指标的初始信息。因此选择前2 个主成分对不同品种蜂蜜品质进行评价和判断。
主成分的特征向量和载荷矩阵如表8 所示。
表8 主成分的特征向量和载荷矩阵
Table 8 Eigenvectors and load matrices of principal components
名称Asp Thr Ser Glu Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys Pro总生物碱总多酚PC1特征向量0.212 0.265 0.253 0.267 0.275 0.273 0.229 0.270-0.043 0.274 0.273 0.228 0.251 0.228 0.259 0.262-0.041 0.133载荷0.756 0.948 0.905 0.955 0.984 0.975 0.819 0.965-0.154 0.981 0.976 0.816 0.898 0.815 0.927 0.938-0.147 0.477 PC2特征向量-0.123-0.049 0.102-0.077-0.013-0.056-0.209 0.093 0.499-0.017-0.071 0.109 0.062 0.303-0.121 0.011 0.560 0.468载荷-0.172-0.069 0.144-0.108-0.018-0.078-0.293 0.131 0.701-0.024-0.100 0.153 0.087 0.426-0.170 0.016 0.786 0.656
由表8 所知，数值反映原始变量对因子影响的大小，正负表示影响的方向[26]。对第1 主成分贡献较大的是Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Pro；第2 主成分中Met、总生物碱、总多酚载荷系数较高，贡献较大。
2.3.1.3 不同品种蜂蜜品质的综合评价
不同品种蜂蜜品质的综合评价如表9 所示。
表9 不同品种蜂蜜品质得分和综合评估
Table 9 Quality score and comprehensive evaluation of different varieties of honey
品种狼牙蜜洋槐蜜枣花蜜油菜蜜椴树蜜土蜂蜜黄芪蜜百花蜜枸杞蜜桂花蜜茴香蜜山花蜜野菊花蜜F1 23.008 9.045 22.267 2.943 2.429 18.852 18.052 3.754 10.736 4.690 15.454 2.211 6.991 F2 88.954 32.134 78.692 10.325 8.817 66.399 64.150 13.296 38.323 17.540 53.542 8.790 24.450 F 28.70 10.89 26.75 3.52 2.95 22.61 21.73 4.51 12.95 5.77 18.41 2.79 8.36排序1721 1 12 341 06951 38
由表9 可知，主成分分析中前2 个组分反映了13 种蜂蜜品质指标中84.963% 的信息，因此利用前2 个组分进行不同蜂蜜品种的综合评价是可行的。利用PCA 得到的PC1、PC2 的2 个新的综合指标代替原来的18 个指标，得到2 个主成分线性关系如下。
2 个主成分从不同方面体现了不同品种蜂蜜的品质，单独使用某一种主成分无法全面准确评价。因此，以2 个主成分对应的方差贡献率作为权重建立综合评价模型F=0.710F1+0.139F2，计算各样品的综合得分，分数高低可反映蜂蜜样品综合品质的高低。综上，2 个主成分综合得分较高的是狼牙蜜、枣花蜜、土蜂蜜、黄芪蜜，得分较低的是山花蜜、椴树蜜、油菜蜜、百花蜜。
2.3.2 HCA 分析
采用组间连接法，利用平方欧氏距离对不同品种蜂蜜品质进行分层聚类分析，相似度接近的样品会被优先聚为一类，得到不同品种蜂蜜品质的树状聚类图，结果见图3。
图3 不同品种蜂蜜品质的聚类分析图
Fig.3 Cluster analysis of different varieties of honey
由图3 可知，将15 个蜂蜜样品按其品质可划分为4 类。其中，第一类包括狼牙蜜和枣花蜜，其品质最优；第二类为土蜂蜜、黄芪蜜和茴香蜜，品质次之；第三类包括枸杞蜜、洋槐蜜和野菊花蜜；第四类为剩余蜂蜜样品。不同品种蜂蜜品质差异性受到种植地区、环境及气候等因素的影响，该聚类分析与主成分分析结果相近，可以较好地体现不同品种的差异性。因此，采用本试验进行聚类分析可行，为不同品种蜂蜜功效成分的利用及营养价值的评价提供参考。
2.3.3 OPLS-DA 分析
由于PCA 属于反映数据原始状态的无监督分析方法，只能用来观察试验样品的自然分布和组别关系，不能忽略组内误差、消除与研究目的无关的随机误差[27]。因此采用有监督模式识别的方法OPLS-DA 来确定不同品种蜂蜜间的差异化学成分。利用Simca14.1 软件进行PLS-DA 分析，OPLS-DA 运用PLSDA 建立品质指标与样品之间的关系模型，可降低样品组内差异、放大组间差异，排除无关因素对试验数据造成的影响，从而实现对不同样品的有效预测[28]。OPLSDA 模型中，R2x、R2y 分别表示模型对X 和Y 矩阵的解释率，Q2 表示所建模型的预测能力。理论上，R2、Q2 数值越接近于1 说明模型的预测能力及拟合准确性越高，通常情况下，R2、Q2 高于0.5 较好。OPLS-DA 得分散点图和200 个排列模型验证如图4 所示。
图4 OPLS-DA 得分散点图和200 个排列模型验证
Fig.4 Scatter plot of OPLS-DA and model verification of 200 permutation
由图4 可知，自变量拟合指数（R2x）为0.991，因变量拟合指数（R2y）为0.948，模型预测指数（Q2）为0.619，该模型的解释及预测能力较好，样品聚类效果明显，不同品种蜂蜜品质可进行明显区分。排列试验是一种外部模型验证方法，主要用于验证OPLS-DA 模型的拟合程度[29]。对OPLS-DA 模型进行置换检验，判别其是否发生过度拟合。经过200 次循环迭代后的置换检验，模型右侧Q2 值大于左侧任意一个y 变量随机排列模型Q2 值，且位于y 轴上的截距小于0，认为该OPLS-DA 模型较好，无过度拟合现象，可以用于后续的差异成分分析。
2.4 差异成分的筛选和分析
采用单变量分析和多变量分析相结合的方法，根据OPLS-DA 生成的变量投影重要性值（variable importance in project，VIP）来筛选组间差异成分（VIP>1）。VIP 值越大，说明该差异成分对样品组间的分类判别的影响强度和解释能力越强[30]。变量投影重要性值如图5 所示。
图5 变量投影重要性值图
Fig.5 Variable importance in project
由图5 可知，VIP 值大于1 的化合物有总多酚、Asp、总生物碱、Pro、Phe、Met。这些指标为不同品种蜂蜜的差异性判别物质，通过差异性判别物质的识别可以进一步进行模型构建，以期预测蜂蜜的品种，达到蜂蜜真实性判别的目的。
3 结论
以13 种单一品种蜂蜜为研究对象，采用主成分分析法、分层聚类分析法及正交偏最小二乘法等化学计量法综合评价不同品种蜂蜜中AAs、PCs、ACs 的品质差异。蜂蜜中的氨基酸、多酚类化合物含量丰富，均含有16 种AAs、23 种PCs 分别在0.11%～1.13%、16.51～175.95 µg/kg，生物碱类化合物含量差异较大，狼牙蜜中的含量远高于其他品种蜂蜜，总量为11.80 µg/kg。多酚类化合物、生物碱类化合物、氨基酸含量均存在差异。整体上，狼牙蜜的氨基酸总量排第3 位，多酚类及生物碱类化合物含量均排第1 位。通过主成分分析提取2 个主成分，累计方差贡献率为84.963%，能较好地体现AAs、PCs、AC 的综合信息。分层聚类分析的结果可以有效地验证主成分分析的结果，根据综合排名得出前3 位分别为两当狼牙蜜、枣花蜜、土蜂蜜。通过正交偏最小二乘判别分析，总多酚、天冬氨酸、总生物碱、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸可作为不同品种蜂蜜的差异性判别物质。
综上，两当狼牙蜜与其余单一品种蜂蜜的差异明显，通过差异性判别物质（总多酚、天冬氨酸、总生物碱、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸）的指标可以有效地鉴别甘肃省地理标志产品——两当狼牙蜜的真伪，为甘肃省地理标志产品的产业发展提供技术支持。
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