近年来，因动物蛋白需求增加导致的环境压力及供给压力均增大，使得植物蛋白肉受到研究者的广泛关注[1]。植物蛋白肉是利用植物蛋白、脂肪等原料，并添加功能性成分，经过挤压、成丝等加工技术，将其做成具有纤维结构，类似传统动物肉质构、风味和口感的素食产品[2]。其原辅料组成一般包括植物蛋白、水、油脂、黏合剂、调味剂、着色剂、保鲜剂、护色剂等[3-4]。许多学者认为，高品质的植物蛋白肉可以部分替代传统的肉制品[5]。因此，采用不同来源的优质植物蛋白开发素肉类产品具有重要意义。
目前，已有多种植物蛋白肉制品得到了开发。如肖志刚等[6]以大豆分离蛋白和谷朊粉为主要原料，经双螺杆挤压机高湿挤压、调味、煎烤等工艺制得了素肉饼；李翠芳等[7]研究大豆拉丝蛋白和大豆分离蛋白的功能特性对素肉饼品质的影响，结果表明大豆拉丝蛋白的蛋白含量越高，素肉饼的品质越高。此外，因食用菌具有丰富的营养物质及功能成分，亦成为开发为素肉类制品的良好来源。韩爽等[8]制备得到了猴头菇素肉干，其组织状态均匀一致、香浓爽口、甜咸适中，具有独特风味；陈浩等[9]制备得到的休闲竹荪素肉，产品油润有光泽、咸辣适度、弹性较好、有嚼劲、风味较为浓郁。香菇是世界上第二大食用菌，不仅富含蛋白质、膳食纤维、维生素、矿物质等营养物质，还含有多糖、麦角甾醇等活性物质，具有抗菌消炎、降胆固醇、提升免疫力等活性[10-12]。香菇具有蛋白质含量高以及风味特殊等特点，以其作为原料开发植物蛋白肉的研究鲜见。
基于此，本研究将香菇粉添加到植物蛋白肉中制备香菇素肉，并对其风味及保质期进行分析，以期为延长香菇产业链提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菇粉（过400 目筛）:山西农业大学食用菌中心；拉丝蛋白、大豆油、调味料、碳酸钠（食品级）:市售。
卡拉胶、谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）（124 U/g）、刺槐豆胶、微晶纤维素（microcrystalline cellulose，MCC）（均为食品级）:河南万邦实业有限公司；无水乙醚、无水乙醇、氢氧化钠、冰乙酸、石油醚（沸程为30～60 ℃）、盐酸、碘化钾、三氯甲烷、硫代硫酸钠、异丙醇、甲基叔丁基醚、三氯乙酸、无水硫酸钠（均为分析纯）:国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
烤箱（OD42AK815）:浙江绍兴苏泊尔家居用品有限公司；粉碎机（800Y 型）:永康市铂欧五金制品有限公司；旋转蒸发仪（Buchi R-100）:瑞士步琦公司；超微粉碎振荡磨（WFM-10）:江阴市祥达机械制造有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（HGZF-101-2）:上海跃进医疗器械有限公司；气相色谱-质谱联用仪（GCMS-QP 2010 Plus）:日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 香菇素肉的制备
制备工艺:将拉丝蛋白进行复水，加入0.25%碳酸钠，复水时间为15～20 min，至拉丝蛋白无内芯；初步沥干后，以1 000 r/min 离心15 min，将脱水后的拉丝蛋白绞碎，使其成丝状；将其与香菇粉、TG、MCC、食用油、卡拉胶、刺槐豆胶及调味料充分混合，揉制3～5 min，充分混匀后置于平皿定型（每个素肉质量为30 g，直径为60 cm，厚度为1.0 cm）；在4 ℃的条件下，冷藏静置12 h 后，于160 ℃的条件下，两面各烘烤4 min。
香菇素肉制备配方:水分55 g、拉丝蛋白24 g、香菇粉9 g、食用油9 g、调味料5 g、MCC 1.5 g、卡拉胶0.5 g、TG 0.25 g、刺槐豆胶0.1 g。
1.3.2 香菇素肉风味物质的测定
参考文献[13-14]的方法，分别选取香菇粉、未添加香菇粉的素肉、烤前和烤后香菇素肉，利用顶空固相微萃取联合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪进行风味测定。
1.3.3 香菇素肉保质期预测模型的建立
1.3.3.1 香菇素肉指标的测定
将产品进行真空包装，在4、15、25、35 ℃条件下贮藏产品，以感官评价、酸价、过氧化值及菌落总数为品质评价指标，随机取出各贮藏温度下的3 组样品进行检测。产品感官评价依据表1 从风味、口感、组织结构、弹性和色泽5 个方面对产品进行评分，60 为可接受度临界值。
表1 香菇素肉感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation table of Lentinus edodes meat
指标风味（25）口感（25）组织结构（20）弹性（20）色泽（10）评分标准味道鲜美，无腥味，香菇风味适中味道较鲜美，无明显腥味，香菇风味较为适中香菇风味过浓或无香菇味道，腥味浓无油腻感，咀嚼性强，有肉的质感稍有油腻感，咀嚼性稍差，肉的质感较差有油腻感，咀嚼性差，肉的质感差纤维状结构细腻、致密纤维状结构稍粗糙纤维状结构粗糙有一定弹性弹性稍差弹性差色泽均匀，颜色呈红棕色，表面油润有光泽色泽均匀，表面略有光泽色泽不均匀，表面干燥无光泽分数20～25 15～<20<15 20～25 15～<20<15 15～20 12～<15<12 15～20 12～<15<12 8～10 6～<8<6
参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》、GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》及GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定香菇素肉酸价、过氧化值及菌落总数。
1.3.3.2 全面稳定性指数（global stability index，GSI）计算
在计算GSI 时，首先通过式（1）计算Vij（即指标i于第j 天的变化率）。
式中:Cij 为指标i 于第j 天的测定值；Ci0 为指标i第0 天的初始值；Li 为指标i 的保质期终点临界值。
依据式（2）所示，将描述香菇素肉品质的几个指标转化为一个综合指标GSI（G）。
式中:j 为贮藏时间，d；∑为i=1～n 的相应值的总和（n 为用于香菇素肉品质评价指标数量）；ai 为指标i重要性的权重系数；∑ai=1。
通过以上公式确定香菇素肉各指标临界值和权重系数，观察香菇素肉综合品质稳定系数GSI 的变化，建立GSI 保质期预测模型[15-16]。
1.3.3.3 GSI 预测模型建立
通过零级和一级动力学模型拟合，获得最优反应级别，计算得到香菇素肉GSI 的预测值。GSI 预测值计算公式如下。
式中:[G]为t 时间时综合品质的数值；[G]0 为综合品质初始值；kθ 为速率常数；t 为贮藏时间，d[17]。
1.3.3.4 模型验证
对GSI 在不同温度下的预测值与实测值计算得到相对误差，确定GSI 模型可靠性。相对误差（P，%）计算公式如下。
式中:Cei 为指标i 的实测值；Cci 为指标i 的模型计算值。
1.4 数据处理
采用MathType 6.9 软件进行公式编辑，Simca 软件进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 香菇素肉风味物质的测定结果
采用GC-MS 共检测出100 种挥发性风味物质，主要包括10 大类:醛类（13）、醇类（16）、烷烃类（18）、酯类（11）、酸类（4）、酮类（6）、烯烃类（15）、呋喃类（1）、醚类（1）、其他类（15）。其中香菇粉、素肉、烤前香菇素肉、烤后香菇素肉分别检测到50、43、43、43 种化合物。统计各挥发性物质含量后将数据进行归一化处理，所得挥发性风味物质含量热图如图1 所示。
图1 不同样品挥发性风味物质含量热图
Fig.1 Heat map of volatile flavor substance content in different samples
由图1 可知，烤后香菇素肉与香菇粉比较，醛类、烯烃类、呋喃类及其他类化合物含量增多，醇类、酯类、烷烃类、酸类、酮类及醚类化合物含量减少，主要是因为香菇粉添加到素肉中，在赋予香菇素肉许多特有风味的同时，亦会导致有很多风味物质流失。烤后香菇素肉与素肉相比，烷烃类、呋喃类及其他类化合物含量增多，酸类、醛类、醇类、酯类、烯烃类及酮类化合物含量减少，主要是因为香菇粉的加入赋予了香菇素肉一些独特的风味。烤后的香菇素肉与烤前进行比较，醇类、烯烃类、烷烃类、酮类、呋喃类及其他类化合物含量增多，醛类化合物含量减少。主要是因为在烤后，脂质氧化降解反应生成了很多挥发性风味化合物，主要包括醛类、酮类、烃类、乙醇类和内酯类等化合物。
不同样品挥发性物质主成分分析（principal components analysis，PCA）见图2。
图2 不同样品挥发性物质PCA
Fig.2 PCA of volatile substances in different samples
由图2 可知，以Simca 软件对挥发性物质的成分与含量进行主成分分析（PCA），各点之间的距离远近表示差异的大小，其中PC1 为62.4%，PC2 为15.7%，累计贡献率为78.1% 且样品在95% Hotelling T2 的置信区间内，表明该模型可靠，预测能力强，可反映整体样本信息[18]。
烤前与烤后香菇素肉有明显的区域分布区别，烤前的香菇素肉位于第三象限，烤后的香菇素肉位于第二象限；烤前样品与烤后样品的主要差异表现在PC2主成分方向上，呈负相关，表明香菇素肉烤前后影响挥发性物质的因素主要在PC2 主成分上。香菇粉与烤后香菇素肉有明显的区域分布区别，香菇粉位于一、四象限，烤后的香菇素肉位于第二象限；香菇粉样品与烤后样品的主要差异表现在PC1 主成分方向上，呈负相关，表明香菇粉与烤后的香菇素肉影响挥发性物质的因素主要在PC1 主成分上。
因PCA 是无监督分析模型，因此本研究绘制双标图（Biplot 图）以更好地分析各挥发性成分对于香菇素肉的贡献率，结果见图3。
图3 不同样品挥发性物质Biplot 图
Fig.3 Biplot of volatile substances in different samples
在Biplot 图中，挥发性风味物质分布于各象限的绝对值越大，表明在主成分中其对样品的影响越大。由图3 可知，香菇粉中主要风味成分为醇类（B）和烷烃类（C），主要分布在PC1 正方向上，结合GC-MC 测定结果可知，其中贡献率较高的有己醇（B2）、桉树醇（B3）、1-辛烯-3-醇（B6）、异戊醇（B9）、邻异丙基苯甲烷（C1）、2，6，10-三甲基十二烷（C6）、5-甲基四烷（C8），这些物质均为香菇的主要风味特征物质。素肉中主要的风味成分为醛类（A）和烯烃类（G），主要分布在PCA负方向上，结合GC-MS 测定结果可知，其中贡献率较高的有对异丙基苯甲醛（A13）、右旋萜二烯（G1）、1-甲基-4（1-甲基乙基）-1，4-环己二烯（G2）。烤后的香菇素肉与烤前的香菇素肉相比，其中的主要风味物质含量变化不明显，但是有新物质2-戊基呋喃（H1）产生，该物质呈现肉香味。结合GC-MS 测定结果可知，烤后的香菇素肉中含量比较高的有正己醛、对异丙基苯甲醛、1-辛烯-3-醇、1，2，4-三硫烷、1-甲基-4（1-甲基乙基）-1，4-环己二烯、2-戊基呋喃，说明烤后的香菇素肉风味丰富，且1-辛烯-3-醇与1，2，4-三硫烷为香菇特征风味物质。
2.2 香菇素肉GSI 保质期预测模型建立
2.2.1 香菇素肉贮藏期间品质指标的变化
香菇素肉贮藏期间品质指标变化结果见表2。
表2 香菇素肉品质评价指标随贮藏温度变化结果
Table 2 Changes in quality evaluation indicators of Lentinus edodes vegan meat with storage temperature
贮藏温度/℃4 15 25 35贮藏时间/d 01357013570123401234感官评分9.0 8.8 8.5 8.2 7.8 9.0 8.6 8.0 7.7 7.3 9.0 8.6 8.2 7.9 7.5 9.0 8.4 7.8 7.5 6.5酸价/（mg/g）2.2 2.3 2.7 2.9 3.0 2.1 2.4 3.0 3.3 3.7 2.2 2.4 2.8 3.2 3.6 2.2 2.7 3.0 3.5 3.8过氧化值/（g/100 g）0.08 0.10 0.13 0.16 0.20 0.10 0.12 0.15 0.18 0.25 0.08 0.11 0.14 0.16 0.22 0.11 0.15 0.17 0.20 0.23菌落总数/[lg（CFU/g）]0 1.2 1.8 2.2 2.6 0 1.4 2.3 2.7 3.2 0.4 1.8 2.1 2.6 2.9 0 1.8 2.4 2.9 3.5
由表2 可知，随着贮藏温度的增加和贮藏时间的延长，酸价、过氧化值与菌落总数都在上升，但感官评分在降低。另外，随着温度的上升，4 个指标变化率都在加速。
2.2.2 香菇素肉GSI 模型建立及验证
2.2.2.1 香菇素肉各指标临界值和权重系数的确定
本研究中，当香菇素肉的感官评分由100 降低至60 时，即认为香菇素肉达到了失效点，即感官评分的临界值为60。根据食用油的相关法规，确定香菇素肉的酸价、过氧化值和菌落总数的临界值分别为4 mg/g、0.25 g/100 g、4[lg（CFU/g）]。感官评价通常是由消费者对产品的喜爱程度来决定的，是重要的评价指标[19]。因此，本研究将4 个香菇素肉品质评价指标重要程度的权重系数ai 均设为0.25。
2.2.2.2 香菇素肉综合品质稳定性指数（GSI）变化
不同温度下香菇素肉GSI 随贮藏时间的变化曲线如图4 所示。
图4 不同温度下香菇素肉GSI 随贮藏时间的变化
Fig.4 GSI changes of Lentinus edodes vegan meat with storage time at different temperatures
由图4 可知，香菇素肉在贮藏期间GSI 由1 逐渐降低，下降速率随着温度升高而加快。由此可知，通过降低贮藏温度可以延缓香菇素肉品质劣变。Achour等[20]研究表明，当试验测定的值高于保存时间的临界值（即Cij>Li）时，对该数据进行分析毫无意义。因此，本试验仅研究了不超过保质期临界值情况下，用GSI模型所能预测的货架期。
2.2.2.3 香菇素肉GSI 保质期预测模型的建立
对不同温度条件下香菇素肉的GSI 变化进行零级和一级动力学拟合，结果见表3。
表3 香菇素肉GSI 变化的动力学模型回归系数R2 和速率常数K
Table 3 Regression coefficient R2 and rate constant K for kinetic model of GSI changes in Lentinus edodes vegan meat
贮藏温度/℃4 15 25 35零级模型拟合R2 0.994 7 0.981 9 0.992 5 0.991 6 ΣR2 3.960 7 K 0.068 0 0.092 8 0.165 5 0.186 3一级模型拟合R2 0.947 8 0.971 4 0.966 1 0.926 1 ΣR2 3.811 4 K 0.097 5 0.160 7 0.256 7 0.368 9
由表3 可知，零级和一级模型拟合结果均符合线性关系。通过比较两种模型的相关系数R2 和∑R2 发现，零级动力学模型相关系数大于一级模型，因此其能更好地描述香菇素肉的质量变化。因此，本研究采用零级反应速率常数建立香菇素肉保质期的预测模型。如式（6）所示，阿伦尼乌斯理论揭示了香菇素肉品质变化受温度影响的函数关系。
式中:K 为反应速率常数；k0 为指前因子；Ea 为反应活化能，kJ/mol；R 为摩尔气体常数，8.314 4 J/（mol·K）；T 为热力学温度，K。
将GSI 的零级动力学反应方程[式（3）]代入式（6），可推导出本研究中用于香菇素肉保质期预测的GSI 模型，如式（7）所示。
根据阿伦尼乌斯方程[见式（6）]，以T 和K 为变量进行格式转化后作线性拟合，结果如图5 所示。
图5 1/温度与香菇素肉GSI 衰减速率常数的关系
Fig.5 Relationship between 1/temperature and GSI decay rate constant of Lentinus edodes vegan meat
较高的拟合系数（R2=0.949 9）说明阿伦尼乌斯方程确实可以用于本研究中K-T 关系模型的建立。图5中拟合直线斜率的绝对值（3.647）和截距（10.405）分别代表阿伦尼乌斯方程中Ea/R 和lnk0，计算得到Ea 和k0分别为30.32 kJ/mol 和33 034，代入式（7）即可得到香菇素肉保质期预测方程，如式（8）所示。
贮藏初始时[GSI]0=1，当香菇素肉品质劣变到保质期终点时，[GSI]=0，由此计算得到4、15、25、35 ℃下香菇素肉的保质期分别为15.7、9.5、6.2、4.2 d。
2.2.2.4 香菇素肉GSI 保质期预测模型的验证
不同贮藏温度下香菇素肉GSI 实测值与预测值的相对误差见表4。
表4 不同贮藏温度下香菇素肉GSI 实测值与预测值的相对误差
Table 4 Relative error between experimental and predicted GSI of Lentinus edodes vegan meat at different storage temperatures
贮藏温度/℃4 15贮藏时间/d 0135701357 GSI 试验值1.000 0 0.862 5 0.702 5 0.580 0 0.450 0 1.000 0 0.807 5 0.575 0 0.449 0 0.230 0 GSI 预测值0.984 5 0.859 3 0.722 4 0.558 7 0.451 3 0.991 2 0.822 1 0.553 3 0.485 6 0.261 7相对误差值/%1.55 0.37-2.83 3.67 0.29 0.90-1.81 3.77 8.15-13.78贮藏温度/℃25 35贮藏时间/d 0123401234 GSI 试验值1.000 0 0.807 5 0.652 5 0.505 0 0.305 0 1.000 0 0.695 0 0.540 0 0.353 7 0.136 2 GSI 预测值0.945 7 0.837 7 0.687 8 0.508 0 0.279 3 0.973 8 0.627 2 0.553 7 0.384 6 0.132 4相对误差值/%5.43-3.74-5.41-0.60 8.43 2.62 6.78-2.54-8.74 2.79
由表4 可知，GSI 试验值和预测值相对误差绝对值均低于15%，说明本研究建立的基于GSI 变化动力学的香菇素肉保质期预测模型是可靠有效的。经本研究建立的保质期预测模型计算，香菇素肉在4、15、25、35 ℃存放条件下的保质期分别为15.7、9.5、6.2、4.2 d，通过试验得到的实际货架期分别为16、10、7、5 d，试验值和预测值相对误差分别为1.88%、5%、11.4%、14%，且相对误差值均小于15%，所以得到预测结果可靠。
3 讨论与结论
不同原辅料的混合使用有利于发挥不同添加物之间的协同增效作用，香菇中的蛋白在与其他辅料混合时，可以与水和油发生乳化反应，而其他辅料如水、食用油、TG、MCC 等起到了黏合、润滑以及赋予香菇素肉风味的作用，使产品体系能够稳定并获得良好的风味和口感。
本研究对香菇素肉的风味物质进行测定，结果表明其风味物质主要有醛类、醇类、烯烃类、烷烃类和呋喃类。其中含量较高的有正己醛、对异丙基苯甲醛、1-辛烯-3-醇、1，2，4-三硫烷、1-甲基-4（1-甲基乙基）-1，4-环己二烯、2-戊基呋喃。1-辛烯-3-醇作为一种主要的挥发性风味成分，主要由亚油酸和香菇粉经脂肪氧化酶催化转变形成[21]，散发出典型的蘑菇味。香菇素肉中1，2，4-三硫烷的相对含量高达8.3%，主要原因是香菇粉中的氨基化合物与素肉中的羰基化合物发生了美拉德反应。同时，含硫化合物被认为是形成肉香的关键化合物，它能够为美拉德反应产物提供基础肉香[22]。2-戊基呋喃相对含量高达5.91%，主要原因是在烤制过程中脂肪的氧化分解，具有较强的肉香味。
此外，本试验中香菇素肉GSI 预测模型，其相对误差绝对值小于15%，说明所建立的香菇素肉货架期预测模型是可靠的。由于本研究中香菇素肉是在没有添加任何保鲜剂的情况下进行货架期预测的，后期工业化生产可以添加适量的保鲜剂进一步延长香菇素肉的保质期。
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