蔗糖作为人类社会生活中不可或缺的必需品与至关重要的工业原料[1],其市场现状却面临产品种类单一的挑战[2-3],随着现代生活品质的不断提升,消费者对蔗糖产品的需求已超越基本的甜味享受,转而追求多元化风味与营养的双重价值[4-5]。与此同时,云南凭借其得天独厚的动植物资源宝库,为将药食同源的天然元素融入现代蔗糖加工工艺,以丰富产品种类提供了广阔的可能性。
葛根(Pueraria)作为一种豆科葛属的多年生落叶藤本植物,特指野葛或甘葛藤的干燥根部。云南葛根资源丰富,其中常见的品种如野葛、粉葛及食用葛等均在云南广泛分布[6]。在我国,葛根在解酒方面的应用拥有着悠久的历史背景[7-8],葛根及其黄酮成分在多种动物模型,如小鼠和斑马鱼中,对抗慢性酒精肝损伤的重要作用已得到广泛研究证实[9-10]。此外,还有研究表明,葛根黄酮的主要活性成分为葛根素,它主要通过调节GSK-3β/NF-κB 通路,有效抵御由慢性饮酒引起的大鼠肝损伤,从而发挥其护肝功效[11]。然而,传统葛根或葛根粉产品在口感和溶解性方面常常难以获得消费者的青睐,这在一定程度上限制了葛根产业的进一步发展。共结晶技术为解决这一问题提供了有效手段,有望为葛根的应用创造更广阔的前景,或进一步拓展其现有应用领域。
同时,以蔗糖为载体的共结晶技术研究已久[12-13],蔗糖具有溶解度高、储存稳定、结晶潜热大、成本适中等优点,是理想的共结晶载体。共结晶技术广泛应用于食品加工行业,国外早在1993 年就把共结晶产品定位新一代创新产品[14],并随之展开了对共结晶技术工艺、新产品研发及其特性的深入探究[15-17],但以蔗糖为载体添加葛根提取物的共结晶技术工艺、结构变化和微观特性的研究鲜见报道。蔗糖为载体的共结晶基本原理是添加的物料与蔗糖同步结晶,形成稳定共结晶体,在不断搅拌过程中使添加物中的活性成分无序地吸附或沉积于蔗糖微晶表面[18],从而实现具有新型功能特性的凝聚态融合。这一过程显著优化了特定化合物的溶解性与均一性,拓宽了其在食品工业与药物制备中的适用性,为生产满足多元化市场需求的功能性产品奠定了基础。本文以蔗糖为载体、葛根提取物为辅助成分,制备高附加值葛根共结晶糖,并对其产品的主要成分、产品特性、结构变化和形态特征进行分析,以期为药食同源类新型产品的研发与应用提供参考。
一级白砂糖:云南省耿马南华糖业有限公司;葛根:云南省开远市,从当地种植一年以上的田间收获,干燥后用超细粉碎机粉碎,备用。
葛根素标准品(纯度95.5%):中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈(均为色谱纯):美国Fisher Scientific 公司;纯净水:娃哈哈集团有限公司;无水乙醇、95%乙醇、硫酸铜(均为分析纯):天津市优谱化学试剂有限公司;氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、草酸钾、硫酸钾、纯蔗糖(均为分析纯):天津市风船化学试剂科技有限公司;浓硫酸、浓盐酸、硼酸(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;酒石酸钾钠(分析纯):上海源叶生物科技有限公司;冰乙酸(分析纯):山东西亚化学工业有限公司;碱性醋酸铅(分析纯):云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司;溴化钾、亚甲基蓝(均为分析纯):上海麦克林生化科技股份有限公司;溴甲酚绿(分析纯):上海三爱思试剂有限公司;甲基红(分析纯):北京化学试剂公司。
超细粉碎机(FDV):北京兴时利和科技发展有限公司;电热恒温水浴锅(HWS-24):上海一恒科学仪器有限公司;旋转蒸发仪(RE-3000B):上海亚荣生化仪器厂;多功能提取浓缩机组(DC-NSG-20):上海达程实验设备有限公司;紫外可见分光光度计(UV-5800PC):上海元析仪器有限公司;单冲压片机(TDP-5T):泰州市天泰制药机械厂;高效液相色谱仪(E2695+2489UV)、色谱柱(SunFireTM-C18,4.6 mm×250 mm×5µm):美国Waters 公司;大功率电热板(EH45B):北京莱伯泰科仪器股份有限公司;磁力搅拌器(MS7-H550-Pro):京君龙实验仪器(北京)有限公司;X 射线衍射仪(X′Pert³powder):荷兰Panalytical 公司;傅里叶变换红外光谱仪(TENSOR27):德国Bruker 公司;扫描电子显微镜(VEGA3):泰思肯贸易(上海)有限公司。
葛根共结晶糖样品的制备分为两步。葛根提取物的制备:称取2.5 kg 葛根粉与7 L 95%乙醇溶液混匀,于多功能提取浓缩机组内70 ℃水浴下回流浸提3 h,静置分层后收集上清液;重复浸提一次,合并两次收集的上清液,并经抽滤装置过滤,滤液经旋转蒸发仪减压浓缩,得葛根提取物,储存在棕色密封广口瓶内,备用。共结晶糖的制备:称量1 kg 蔗糖于加热容器中,以200 mL 蒸馏水润湿,电热板上文火加热温度至114 ℃,停止加热,按照蔗糖质量的2.5% 加入葛根提取物,充分搅拌使两者达到有机融合,冷却、过筛、整粒、干燥。重复3 次,混匀储存于样品瓶内,备用。
1.4.1 提取物添加量的选择
依据《中华人民共和国药典》(2015 版)一部中葛根的用法与用量,结合葛根中总黄酮含量、微晶共结的单片质量、每日建议摄入片数,按照公式(1)计算共结晶糖中葛根提取物添加量范围。
式中:X 为葛根提取物添加量,%;m0 为葛根的用量,g;W0 为葛根中黄酮含量,%;n 为共结晶糖日摄入量,片;m1 为葛根共结晶糖单片重,g;W1 为葛根提取物中总黄酮含量,%。
根据葛根提取物的添加量计算范围制备不同葛根提取物添加量的共结晶糖,最后通过感官评价(色泽:浅黄色且不发黑;香气:有糖和葛根提取物混合香气;风味:有甜味,没有明显的苦味和药味)选择最佳葛根提取物添加量。
1.4.2 葛根共结晶糖的主要成分测定
1.4.2.1 葛根总黄酮含量的测定
葛根共结晶糖的总黄酮含量测定参考宋岩等[19]的方法,并对样品的处理方法进行适当调整,称取1 g 左右葛根共结晶糖于10 mL 容量瓶,以95% 乙醇溶解,定容混匀后经定量滤纸过滤。分别吸取0.5 mL 滤液和95%乙醇转至另外两支10 mL 容量瓶中,用蒸馏水定容,以不加滤液为空白对照,于250 nm 测定吸光度,吸光度代入标准曲线方程即可得出滤液中总黄酮含量,并根据公式(2)计算出样品中总黄酮的含量。
式中:M 为样品总黄酮含量,%;C 为由标准曲线换算出的滤液中总黄酮含量,mg/mL;20 为样品稀释倍数;10 为溶液定容体积,mL;1 000 为质量换算倍数;m为样品质量,g。
1.4.2.2 其他成分测定
葛根素含量的测定参照GB/T 22251—2008《保健食品中葛根素的测定》的方法;蔗糖、还原糖含量的测定参照QB/T 2343.2—2013《赤砂糖试验方法》的方法;水分含量的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》的方法;蛋白质含量的测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的方法。
1.4.3 葛根共结晶糖的理化性质分析
1.4.3.1 包埋率测定
以蔗糖质量的1%~5%添加量加入提取物制备葛根共结晶糖,测定不同样品中总黄酮含量,以提取物添加量为横坐标,样品中总黄酮含量为纵坐标制作标准曲线,通过公式(3)计算样品中总黄酮的包埋率。
式中:N 为样品中总黄酮的包埋率,%;M1 为样品中总黄酮含量,%;M0 为理论中样品总黄酮含量,%。
1.4.3.2 均一性测定
同一批次的葛根共结晶糖,随机取样5 个测定总黄酮含量;同时取不同批次的混合样品进行筛分,得到20、40、60、80 目4 个粒径的样品,分别测定其总黄酮含量。通过不同取样方式和样品间的总黄酮含量差异来评估葛根共结晶糖的均一性。
1.4.3.3 溶解速率测定
葛根共结晶糖的溶解速率测定参考Sardar 等[20]的研究方法,葛根共结晶糖和白砂糖均经40、60 目筛网过筛作为样品,分别准确称取10 g 样品待用。取两个200 mL 烧杯分别加入100 mL、水温25 ℃的蒸馏水,将磁力搅拌器转子放入烧杯内,调整转速400 r/min,把称好的样品倒入烧杯内,样品倒入时以秒表开始计时,观察并记录样品完全溶解所需要的时间。
1.4.4 X 射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析
使用X 射线衍射仪和Cu-Kα 辐射(λ=1.54 Å)在40 kV 和40 mA 下表征葛根共结晶糖和白砂糖的晶相。从5°~90°扫描样本,扫描步长为0.02,分析二者峰及峰强度差异。
1.4.5 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析
使用FTIR 进行试验,通过使用溴化钾(1∶20,质量比)研磨并将处理后的样品压成薄片来分析白砂糖和葛根共结晶糖样品。样品在4 000~400 cm-1 下扫描,分辨率为4 cm-1,扫描频率为16 次。
1.4.6 扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)分析
将葛根共结晶糖、白砂糖及葛根粉过60 目筛后,60 ℃烘干1.5 h。在样品台粘上黑色导电胶,然后随机取少量烘干粉体粘在导电胶上,并用吸耳球吹去未粘在导电胶上的粉体,放入喷金仪器,喷金70 s,取出样品台,放入SEM。测试电压为20 kV,钨灯丝下放大100、300、1 000 倍下拍照并观察。
通过SPSS 19.0 软件对数据进行单因素方差分析,每组试验均重复3 次,结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2021 进行绘图。
依据《中华人民共和国药典》(2015 版)一部中葛根的用量为10~15 g,经测定试验所用葛根的黄酮含量为0.08%,确定黄酮用量为8.15~12.23 mg。葛根提取物中总黄酮含量为33.17%,与范琳等[21]研究得到的95% 乙醇葛根提取物总黄酮含量31.06% 相近,葛根共结晶糖单片重为(1.20±0.05)g,建议日摄入量为1~4 片,可由黄酮含量按公式(1)计算出提取物添加量在0.51%~3.07%。试验结果表明,提取物添加量超过3%时色泽较深,不容易被消费者接受,提取物添加量在2%以下则葛根香气很淡,结合葛根共结晶糖的风味及口感,故选择葛根提取物添加量为2.5%。
2.2.1 葛根素含量分析
以葛根素为标准品,通过液相色谱分析测定葛根超细粉、葛根提取物及葛根共结晶糖3 种样品中葛根素的含量,结果如表1 所示。
表1 样品中的葛根素含量
Table 1 Content of puerarin in different samples
样品名称葛根超细粉葛根提取物葛根共结晶糖质量/g 0.83 0.85 0.88稀释倍数1 10 1 10µL 葛根素含量/ng 367.65 13 832.91 3 067.27葛根素含量/%0.04 16.27 0.35
由表1 可知,本试验所用的葛根粉中葛根素含量为0.04%,即440 mg/kg,在任少伟等[22]采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定的葛根超细粉中葛根素含量386.10 mg/kg 及杨树平等[23]采用HPLC 法测定产自云台山的葛粉中葛根素含量320 mg/kg 之间。而葛根提取物中葛根素含量为16.27%,按2.5%的添加量生产葛根共结晶糖,共结晶糖中葛根素的理论值应为0.41%,实际测得0.35%,葛根共结晶糖中葛根素的加工得率为85.37%。综上,葛根共结晶糖中葛根素含量约为相同质量葛根超细粉中葛根素含量的8 倍以上。
2.2.2 葛根共结晶糖的基本成分含量分析
对葛根共结晶糖中的主要成分含量测定,结果如表2 所示。
表2 葛根共结晶糖基本成分含量
Table 2 Main ingredients of Pueraria co-crystallized sugar
组别40 目60 目平均值含量/%水分0.33 0.33 0.33还原糖0.83 0.84 0.84蔗糖97.51 97.41 97.46总黄酮0.77 0.76 0.77葛根素0.34 0.36 0.35蛋白质0.57 0.59 0.58
由表2 可知,葛根共结晶糖中含有大量的蔗糖,含量为97.46%,其余2.44%左右由水分、还原糖、总黄酮(葛根素)和蛋白质组成。其中葛根素占葛根总黄酮含量的45.45%,是葛根黄酮的主要成分。
2.3.1 包埋率分析
葛根提取物添加量对葛根共结晶糖总黄酮含量的影响如图1 所示。
图1 不同提取物添加量的葛根共结晶糖总黄酮含量
Fig.1 Total flavonoids in Pueraria co-crystallized sugar with different additions of extractive
由图1 可知,在提取物添加量为1.0%~5.0% 时,葛根共结晶糖中总黄酮含量(R2=0.984 4)与提取物添加量显著线性相关,通过共结晶工艺葛根黄酮包埋率为85.5%~93.7%,表明葛根黄酮在共结晶过程中是趋于稳定的,在共结晶工艺过程中葛根黄酮较稳定且损失率小于15%。
2.3.2 均一性分析
不同取样方式下葛根共结晶糖的总黄酮含量如图2 所示。
图2 不同取样方式下葛根共结晶糖的总黄酮含量测定
Fig.2 Determination of total flavonoids in Pueraria cocrystallized sugar under different sampling methods
由图2 可知,同一批次葛根共结晶糖随机取5 个样品以及不同批次混合样品筛分后4 个不同粒径样品的总黄酮含量均为(0.75±0.02)%,随机取样的样品平均偏差为0.56%,筛分之后的样品平均偏差0.19%。结果表明葛根提取物与白砂糖经共结晶工艺后混合较为均匀,产品均一性良好,这是因为在熔融状态下蔗糖糖浆自发结晶速度快,微聚集体比表面积大,在蔗糖结晶前添加葛根提取物,其主要成分葛根黄酮就可以通过包埋、夹带及吸附的方式进入并均匀分布在蔗糖重新形成的微晶体中[24]。
2.3.3 溶解速率分析
以对比的方式分别测定不同粒径下葛根共结晶糖和白砂糖的溶解速率,结果如图3 所示。
图3 葛根共结晶糖与白砂糖在水中溶解速率对比
Fig.3 Contrast of dissolution rate in water for white granulated sugar and Pueraria co-crystallized sugar
由图3 可知,两种糖类40 目颗粒所需溶解时间分别为32.86 s 和68.65 s,60 目颗粒样品的溶解时间分别为25.31 s 和51.92 s。而Sardar 等[20]在其研究结果中指出白砂糖的溶解时间约为85 s,小豆蔻精油共结晶糖时间约为110 s。两项研究中,造成白砂糖的溶解时间差异主要原因可能是本研究中用作对照的白砂糖进行筛分处理,经筛分后选取的白砂糖粒径与葛根共结晶糖粒径相近。对于共结晶糖的溶解时间,小豆蔻精油共结晶糖溶解时间明显高于白砂糖,而葛根共结晶糖溶解时间仅为相同粒径白砂糖溶解时间的50%左右。最大原因可能是小豆蔻精油属于疏水性物质,而葛根提取物属于亲水性物质,同时葛根提取物与白砂糖经共结晶工艺技术降低了晶体粒径,增加了晶体之间的空隙,进而增强了糖与水的接触面积,最终增加葛根共结晶糖的溶解速率。
X 射线衍射是研究晶体特性的重要方法,衍射峰越窄越高表明体系中的结晶量越多、结晶区完整度越高[25]。白砂糖有其特征衍射峰,属于较纯的物质,而葛根共结晶糖属于混合物,其特征衍射峰与白砂糖的特征峰有重叠,且峰强度发生了变化并有很多新出现的峰。当存在分子间共结晶时,就会出现一个新的特征衍射峰[26]。葛根共结晶糖与白砂糖的X 射线衍射图谱如图4 所示。
图4 葛根共结晶糖与白砂糖的X 射线衍射图谱
Fig.4 XRD of white granulated sugar and Pueraria cocrystallized sugar
由图4 可知,葛根共结晶糖的特征衍射强度峰峰强度减弱,即表现为微晶,表明共结晶产品中的糖是纯的晶体形式,但是粒度较白砂糖晶体小;同时,共结晶糖的X 射线衍射峰的分散度增加,表明一些成分处于无定形状态;有研究指出,加入的部分提取物可能已经渗透到蔗糖晶体的晶体细胞中[26];最后,葛根共结晶糖出现的一些新衍射峰高于白砂糖的衍射峰,原因是来自添加的提取物,还是提取物与白砂糖相互作用的结果,需要进一步研究。
图5 为白砂糖和葛根共结晶糖的红外光谱,揭示了从白砂糖到葛根共结晶糖的结构变化。
图5 葛根共结晶糖与白砂糖的红外光谱
Fig.5 FITR of white granulated sugar and Pueraria cocrystallized sugar
由图5 可知,3 600~3 000 cm-1 的峰含有N—H 键的伸缩振动,葛根共结晶糖在此区域的吸收峰强于白砂糖,可能是提取物中含有氨基酸类。3 400 cm-1 附近的吸收峰为O—H 键的伸缩振动峰[27],葛根共结晶糖在3 489 cm-1 处的吸收峰强于白砂糖,表明共结晶糖中形成了更多的O—H 键。C—H 键的伸缩振动峰值位于2 900 cm-1 附近[28],葛根共结晶糖在2 942 cm-1 处的吸收峰也是强于白砂糖,说明共结晶糖中存在更多无序、松散的糖基结构。在1 620 cm-1 附近的吸收峰是键的拉伸振动峰[29],而来自葛根共结晶糖在1 629 cm-1 处的吸收峰略弱于白砂糖的吸收峰,表明在葛根共结晶糖的形成过程中可能有更多的醛基和酮基被破坏。1 430 cm-1 附近的COO—伸缩振动峰、1 100 cm-1 和1 040 cm-1 附近的C—O—C 伸缩振动峰应为糖苷的特征吸收,910 cm-1 附近的糖苷键振动峰应为β-(1,4)-糖苷键的特征吸收[29],而葛根共结晶糖在这些位点附近的吸收峰大于白砂糖,可能是来自添加的提取物含有多糖类物质。790 cm-1 附近的C—H 属于分支链上的伸缩振动,葛根共结晶糖795 cm-1 处的峰强度小于白砂糖,可能是共结晶工艺破坏了部分支链上的C—H 结构。其他较低谱带上的谱带多而弱,难以准确识别。
为了从微观结构观察葛根共结晶糖的变化,选取葛根共结晶糖、白砂糖和葛根粉经60 目过筛后,随机取少量经扫描电子显微镜观察,结果如图6 所示。
图6 葛根共结晶糖的扫描电子显微镜分析
Fig.6 SEM analysis of Pueraria co-crystallized sugar
从图6 中可以看出,葛根粉由微管束和碎屑组成,淀粉颗粒被紧密的包裹在其中,维管束宽约100µm,长200µm 以上;白砂糖最小单位呈边长为500µm 左右、棱角分明的正多变型晶体结构,表面致密无空隙;葛根共结晶糖由边长在50µm 左右的晶体结构无序地堆积在一起,晶体之间有空隙,晶体表面及夹层之间有微小颗粒,虽然与小豆蔻精油共结晶糖[20]的制作工艺和添加物均有很大差异,但二者的形态及大小却十分相似。正是这种晶体小、空隙多且无序的堆积形态使得共结晶糖的比表面积大大增加,从而加速了葛根共结晶糖在水中的溶解速率,这也从微观结构佐证了葛根共结晶糖的溶解速率大于白砂糖溶解速率的原因,微晶结构也是共结晶产品最大的特性之一。
本研究以蔗糖为载体、葛根提取物为辅料,通过共结晶工艺生产了一种具有溶解速率快、晶体微小、具有一定解酒功效的葛根共结晶糖。通过主要成分含量的测定有助于揭示共结晶过程葛根提取物在蔗糖中的主要成分变化;其次,葛根共结晶糖对葛根提取物的包埋率高达85% 以上;均一性良好,不同取样方式下的样品中总黄酮含量偏差在0.19%~0.56%;溶解速率块,较相同粒径的白砂糖溶解速率提升1 倍左右;共结晶糖产品具有相似的微观结构,晶体尺寸小和多空隙结构是葛根共结晶糖的两个最重要的特征,通过研究共结晶糖的晶体结构、官能团变化和微观结构发现,晶体小和空隙多是导致共结晶糖产品比白砂糖更容易溶解的主要因素。通过以上研究可为新型高附加值蔗糖产品多样化开发提供理论技术依据,为蔗糖精深加工开发方向做出引导。
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