海藻酸钠（sodium alginate）是从褐藻的细胞壁中提取的一种海洋多糖[1]，由β-D-甘露醛酸（mannuronic acid，M）和α-L-古罗糖醛酸（glucuronic acid，G）通过1，4-糖苷键连接而成的线性酸性多糖，结构独特，具有多种生物活性，然而由于分子量大、所形成的溶液黏性大、不易吸收利用等问题会影响海藻酸钠生物活性的发挥，应用范围具有一定的局限性[2-4]。但是以海藻酸钠为原料制备的海藻酸钠寡糖，分子量低、溶解度高、易于吸收，并且活性基团充分暴露，表现出更强的生物活性，如抗氧化、抗肿瘤等[5-6]。
硫酸化多糖也被称为多糖的硫酸化衍生物，是硫酸根取代了多糖结构中单糖分子的部分羟基而形成的一类具有多种功能的物质，可以通过天然提取或硫酸化的结构修饰而得到[7]，具有低细胞毒性、高生物活性的特征。近年来相关研究发现了多种具有治疗潜力的硫酸化多糖，其抗氧化、抗凝血、抗病毒和免疫炎症活性在功能性食品、药妆和制药中具有应用前景。但多糖/寡糖硫酸化修饰过程中不同反应及反应条件会影响衍生物的得率、硫酸化的取代程度、取代位置、相对分子质量和分子空间结构[8-11]，因此，多糖/寡糖硫酸化条件的优化，对制备新颖硫酸酯多糖/寡糖和产业化转化至关重要[12-14]。
鉴于硫酸化修饰可以显著改善海藻酸钠寡糖的生物活性，针对多糖/寡糖硫酸化过程存在的问题，本研究以海藻酸钠寡糖为原料，采用氯磺酸-吡啶法[15-17]对海藻酸钠寡糖（alginate oligosaccharides，AOS）进行硫酸化修饰，在保留海藻酸钠寡糖原有优良性状的基础上，将硫酸基团引入海藻酸钠寡糖的基本结构中，优化硫酸化修饰条件，制备高度硫酸化的海藻酸钠寡糖，并在此基础上对海藻酸钠寡糖硫酸化衍生物进行抗氧化活性研究，以期通过引入硫酸基团使海藻酸钠寡糖具有更强的生物活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海藻酸钠（化学纯）:国药集团化学试剂有限公司；吡啶、过硫酸钾、氯磺酸（均为分析纯）、2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]试剂:上海麦克林生化科技股份有限公司；3，5-二硝基水杨酸、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙酸（均为分析纯）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）试剂:东京化成工业株式会社。
1.2 仪器与设备
AL104 电子天平、FE20 PH 计:梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；756MC 型紫外可见光分光光度计:上海元析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 海藻酸钠寡糖的制备
称取7.5 g 海藻酸钠，加入485 mL 蒸馏水，加热至80 ℃，搅拌使其溶解。向海藻酸钠溶液加入15 mL 30% 过氧化氢使其最终浓度为0.9%，80 ℃下搅拌24 h，室温冷却。5 000 r/min 离心，取上清液进行旋蒸浓缩，以95% 乙醇沉淀后5 000 r/min 离心10 min，取沉淀，冷冻干燥得到AOS 粉末。
1.3.2 硫酸化海藻酸钠寡糖的制备
根据参考文献[18]的方法并略作修改，采用氯磺酸-吡啶法对海藻酸钠寡糖进行硫酸化修饰，取22 mL吡啶（pyridine，Pyr）于冰水浴中加入3 mL 氯磺酸，室温静置10 min 待用。称取0.5 g AOS 加入100 mL 二甲基亚砜，在80 ℃下搅拌反应30 min。取75 mL AOS溶液加入到SO3·Pyr 混合物中，40 ℃下搅拌反应3 h。冰水浴下加入2 mol/L 氢氧化钠溶液中和至中性。醇沉后离心，去除上清液，沉淀用无水乙醇洗3 次，水溶后过Sephadex G10 柱（20 cm）脱盐，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到硫酸化海藻酸钠寡糖（S-AOS）。
1.3.3 硫酸化海藻酸钠寡糖取代度（degree of substitution，DS）测定
采用氯化钡-明胶法[19]测得硫酸基团含量，以360 nm 处的吸光度对硫酸根浓度作标准曲线，根据标准曲线计算样品中硫酸基团的含量。
1.3.4 硫酸化海藻酸钠寡糖制备条件单因素试验
选取氯磺酸-吡啶体积比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、反应温度（20、40、60、80、100 ℃）、反应时间（1、2、3、4、5 h），研究不同条件对海藻酸钠寡糖硫酸化取代度的影响。
1.3.5 硫酸化海藻酸钠寡糖制备条件响应面试验
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 进行响应面试验设计。选择吡啶-氯磺酸体积比（A）、硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）对硫酸化修饰工艺参数进行优化，每组重复3 次，以海藻酸钠寡糖硫酸化取代度的平均值作为响应值。响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平-1 01因素A 氯磺酸-吡啶体积比1∶6 1∶8 1∶10 B 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比1∶2 1∶3 1∶4 C 反应时间/h 234 D 反应温度/℃20 40 60
1.3.6 海藻酸钠寡糖及其硫酸化衍生物红外光谱分析
AOS 样品放入55 ℃中烘干水分备用。取2 mgAOS 样品与150 mg 溴化钾混匀后在玛瑙钵中充分研磨后压片3 min，压好的片放入样品池内进行检测，在4 000～400 cm-1 波长范围内进行扫描。
1.3.7 硫酸化海藻酸钠寡糖抗氧化活性测定
1.3.7.1 还原力测定
还原能力的测定参考张鑫[20]的方法并略作修改。
1.3.7.2 对ABTS+自由基的清除作用
海藻酸钠寡糖及其衍生物对ABTS+自由基的清除作用参考Li[21]的方法并略作修改。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
式中:M 为海藻酸钠寡糖对ABTS+自由基清除率，%；A0 为维生素C、ABTS、过硫酸钾、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）混合液吸光度；A 为样品、维生素C、ABTS、过硫酸钾、PBS 混合液吸光度。
1.3.7.3 对羟自由基（·OH）的清除作用
海藻酸钠寡糖及其衍生物对羟自由基（·OH）的清除作用参考程浩[22]的方法并略作修改。对羟自由基（·OH）清除率计算公式如下。
式中:N 为海藻酸钠寡糖对羟自由基清除率，%；A0 为维生素C、过氧化氢、水杨酸-乙醇、硫酸亚铁混合液吸光度；A 为样品、过氧化氢、水杨酸-乙醇、硫酸亚铁混合液吸光度；A1 为样品、水、水杨酸-乙醇、硫酸亚铁混合液吸光度。
1.3.7.4 对DPPH 自由基的清除作用
海藻酸钠寡糖及其衍生物对DPPH 自由基的清除作用参考霍达[23]的方法并略作修改。
式中:D 为海藻酸钠寡糖对DPPH 自由基清除率，%；A0 为PBS、DPPH、微生素C 混合液吸光度；A 为样品、DPPH、PBS 混合液吸光度；A1 为样品、PBS、无水乙醇混合液吸光度。
1.4 统计学分析
试验结果数据用Graph-Pad Prism 分析作图。试验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。最后试验数据通过方差分析（analysis of variance，ANOVA），然后进行Tukey′s 多重比较分析。P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果及分析
2.1.1 氯磺酸与吡啶体积比对衍生物硫酸基团取代度的影响
在硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比1∶3、反应温度60 ℃、反应时间3 h 的条件下，分别采用1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 的氯磺酸-吡啶体积比对AOS 进行硫酸化反应，研究不同氯磺酸-吡啶体积比对AOS 硫酸化反应的影响，结果见图1。
图1 氯磺酸-吡啶体积比对取代度的影响
Fig.1 Effect of volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine on DS of alginate oligosaccharides
由图1 可知，不同氯磺酸-吡啶体积比对衍生物硫酸取代度影响较大。氯磺酸-吡啶体积比在1∶10～1∶8时，随着氯磺酸溶剂增多，衍生物取代度逐渐升高，并在氯磺酸-吡啶体积比1∶8 时达到最大值0.807，当氯磺酸-吡啶体积比在1∶8～1∶6 时，反应处于平衡状态，衍生物DS 趋于平缓不再增加。而当氯磺酸-吡啶体积比超过1∶6 之后，衍生物取代度反而降低，可能是吡啶被完全消耗，无法起到缚酸剂的效果，在酸催化下，磺酸基被氢原子取代的副反应增强，总体接枝硫酸根效率下降[24]。因此选择氯磺酸-吡啶体积比为1∶6、1∶8、1∶10 进行后续响应面试验。
2.1.2 硫酸化试剂与海藻酸钠寡糖溶液体积比对海藻酸钠寡糖硫酸化取代度的影响
在氯磺酸-吡啶体积比1∶6、反应温度60 ℃、反应时间3 h 的条件下，分别采用1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比对AOS 进行硫酸化反应，研究不同硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比对AOS 硫酸化反应的影响，结果见图2。
图2 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比对衍生物硫酸取代度的影响
Fig.2 Effect of volume ratio of sulfating reagent to alginate oligosaccharide on DS of alginate oligosaccharides
由图2 可知，当硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比小于1∶3 时，取代度随着硫酸化试剂体积的增加而增加，当体积比达到1∶3 时，取代度达到最大值0.853；继续升高硫酸化试剂所占体积，取代度有所下降。这可能是因为反应体系酸性太强，反应剧烈，导致部分AOS 分解[24]。因此选择硫酸化试剂与海藻酸钠寡糖溶液体积比为1∶2、1∶3、1∶4 进行后续响应面试验。
2.1.3 反应温度对海藻酸钠寡糖硫酸化取代度的影响
在氯磺酸-吡啶体积比1∶6、硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比1∶3、反应时间3 h 的条件下，分别采用20、40、60、80、100 ℃的反应温度对AOS 进行硫酸化反应，研究不同反应温度对AOS 硫酸化反应的影响，结果见图3。
图3 反应温度对海藻酸钠寡糖硫酸化取代度的影响
Fig.3 Effect of reaction temperature on DS of alginate oligosaccharides
由图3 可知，在反应温度低于40 ℃时，随着反应温度升高，取代度逐渐升高；在40 ℃时，取代度达到最大值0.792，但当温度继续升高时，取代度下降。原因可能是S-AOS 在强酸、高温条件下发生降解，导致硫酸根分离，取代度呈现先升后降的现象[25]。因此，选择反应温度为20、40、60 ℃进行后续响应面试验。
2.1.4 反应时间对海藻酸钠寡糖硫酸化取代度的影响
在氯磺酸-吡啶体积比1∶6、硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比1∶3、反应温度60 ℃的条件下，分别采用1、2、3、4、5 h 的反应时间对AOS 进行硫酸化反应，研究不同反应时间对AOS 硫酸化反应的影响，结果见图4。
图4 反应时间对硫酸化海藻酸钠寡糖取代度的影响
Fig.4 Effect of reaction time on DS of alginate oligosaccharides
由图4 可知，当反应时间在3 h 内时，随反应时间延长，AOS 硫酸化取代度逐渐升高，最大的取代度为0.792。3 h 后取代度开始下降，特别是4 h 之后下降明显，原因可能是反应体系中产生大量的副产物HCl，在长时间的反应过程中，酸性体系对衍生物的降解作用增强，硫酸根从糖链上解离下来，导致取代度下降[26]。因此，选择反应时间为2、3、4 h 进行后续响应面试验。
2.2 响应面回归模型的建立及方差分析
2.2.1 响应面优化试验
响应面试验设计分析结果见表2。
表2 响应面优化试验结果
Table 2 Response surface optimization test results
序列1234567891 0 11 12 13 14 A 氯磺酸-吡啶体积比1∶8 1∶6 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶6 1∶8 1∶10 1∶10 B 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比1∶4 1∶3 1∶3 1∶2 1∶3 1∶3 1∶2 1∶3 1∶4 1∶2 1∶3 1∶3 1∶4 1∶3 C 反应时间/h 43323334234333 D 反应温度/℃40 20 40 40 40 40 20 20 40 60 40 40 40 20取代度0.711 0.603 0.896 0.799 0.930 0.930 0.539 0.397 0.747 0.580 0.797 0.891 0.700 0.276
续表2 响应面优化试验结果
Continue table 2 Response surface optimization test results
序列15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A 氯磺酸-吡啶体积比1∶10 1∶10 1∶8 1∶6 1∶8 1∶8 1∶6 1∶8 1∶6 1∶10 1∶8 1∶8 1∶8 1∶6 1∶10 B 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比1∶3 1∶2 1∶4 1∶4 1∶3 1∶2 1∶3 1∶3 1∶2 1∶3 1∶4 1∶3 1∶3 1∶3 1∶3 C 反应时间/h 433334223234233 D 反应温度/℃40 40 20 40 40 40 40 60 40 40 60 60 20 60 60取代度0.642 0.676 0.350 0.789 0.930 0.794 0.813 0.505 0.853 0.668 0.514 0.572 0.443 0.518 0.562
对表2 中的数据进行回归分析处理，结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Regression model variance analysis
注:*表示影响显著，P<0.05；**表示影响极显著，P<0.01。
方差来源模型A 氯磺酸-吡啶体积比B 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比C 反应时间D 反应温度AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项决定系数校正决定系数平方和0.93 0.060 0.015 3.235×10-4 0.034 1.904×10-3 1.827×10-5 0.034 2.449×10-4 3.819×10-3 3.144×10-3 0.052 0.032 0.053 0.77 9.159×10-3 7.527×10-3 0.990 2 0.980 5自由度14 111111111111111 4 10均方0.066 0.060 0.015 3.235×10-4 0.034 1.904×10-3 1.827×10-5 0.034 2.449×10-4 3.819×10-3 3.144×10-3 0.052 0.032 0.053 0.77 6.542×10-4 7.527×10-4 F 值101.42 91.82 23.28 0.49 52.63 2.91 0.028 52.70 0.37 5.84 4.81 78.87 48.26 81.03 1 174.10 1.85 P 值<0.000 1<0.000 1 0.000 3 0.493 5<0.000 1 0.110 1 0.869 7<0.000 1 0.550 4 0.029 9 0.045 7<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.291 0显著性********************不显著
采用响应面软件Design Expert 10 进行参数最佳优化分析。以取代度为响应值，对试验结果进行回归模拟后建立数学模型，A（氯磺酸-吡啶体积比）、B（硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比）、C（反应时间）和D（反应温度）之间的回归方程为取代度=0.92-0.07A-0.04B-5.37×10-3C+0.05D+0.02AB-2.5×10-3AC+0.09AD-7.50×10-3BC+0.03BD+0.03CD-0.09A2-0.07B2-0.09C2-0.34D2。
由表3 可知，该模型具有高度显著性，因为P 值较低，F 值较高，说明方程具有很好的拟合性，可以用方程预测出较合理的结果。失拟项不显著表明在整个回归方程中不存在失拟的因素。因此，回归方程具有高度的拟合性，模型可靠，可以应用于该试验。模型决定系数（R2=0.990 2），变异系数（3.84%）较低，表明试验值的精度和可靠性较高，以P 值为依据，检验各系数的显著性，P 值越小，对应系数越显著。
2.2.2 响应面交互作用分析
通过响应面试验考察氯磺酸-吡啶体积比（A）、硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）以及各因素交互作用对AOS 硫酸化修饰的影响作用，结果见图5～图10。
图5 氯磺酸-吡啶体积比和硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比交互作用的响应面图
Fig.5 Response surface plots of the interaction of volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine and volume ratio of sulfating reagent to alginate oligosaccharide
图6 氯磺酸-吡啶体积比和反应时间交互作用的响应面图
Fig.6 Response surface plots of the interaction between volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine and reaction time
图7 氯磺酸-吡啶体积比和反应温度交互作用的响应面图
Fig.7 Response surface plots of the interaction between volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine and reaction temperature
图8 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比和反应时间交互作用的响应面图
Fig.8 Response surface plots of the interaction between volume ratio of sulfating reagent to alginate oligosaccharide and reaction time
图9 硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比和反应温度交互作用的响应面图
Fig.9 Response surface plots of the interaction between volume ratio of sulfating reagent to alginate oligosaccharide and reaction temperature
图10 反应时间和反应温度交互作用的响应面图
Fig.10 Response surface plots for the interaction of reaction time and reaction temperature
由图5～图10 可以看出，反应温度相对其他因素对AOS 硫酸化取代度影响最大；在各因素交互作用中氯磺酸-吡啶体积比和反应温度、硫酸化-海藻酸钠寡糖溶液试剂体积比和反应温度、反应时间和反应温度的相互作用对AOS 的硫酸化修饰具有显著影响。
2.2.3 AOS 硫酸化修饰最佳制备工艺条件
根据响应面软件分析得AOS 硫酸化修饰预测最佳条件为氯磺酸-吡啶体积比为1∶7，硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比为1∶3，反应时间3 h，温度40 ℃。取代度预测值为0.934。在该条件下，进行3 次重复试验，其取代度结果分别为0.931、0.949 和1.010，平均值为0.963，与预测值相近，表明最优方法组合合理可用。
2.3 海藻酸钠寡糖硫酸化衍生物红外光谱分析
未改性的AOS 和S-AOS 的红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）如图11 所示。
图11 AOS 和S-AOS 的红外光谱图
Fig.11 FTIR spectrum of AOS and S-AOS
由图11 可以看出，AOS 和S-AOS 都在3 430 cm-1和1 030 cm-1 附近有两个较强的吸收带，分别对应O—H 的拉伸振动和C—O 键的伸缩振动，2 932 cm-1附近的微弱吸收峰代表C—H 拉伸振动，证明S-AOS与AOS 基本结构相似。与未改性的AOS 相比，S-AOS在1 260.143 2 cm-1 和832.040 57 cm-1 出现了两个新的吸收峰，分别可以对应硫酸基团中不对称
拉伸振动和C—O—SO3 基团中的对称C—O—S 振动[27]，这表明硫酸基团成功连接在AOS 上。
2.4 硫酸化海藻酸钠寡糖抗氧化活性的测定结果
李瑶等[18]研究紫菜多糖硫酸化修饰后抗氧化活性，发现通过硫酸化修饰得到硫酸化紫菜多糖，抗氧化活性和取代度正相关。谢爱卿等[28]研究岩藻多糖硫酸化及其抗氧化活性，发现硫酸化取代后抗氧化活性有明显提升，且抗氧化活性和取代度正相关。
为研究硫酸化取代度与抗氧化能力的关系，根据2.2 所得到的反应条件模型，分别制备了硫酸化取代度为0.574、0.790、0.931 的3 种硫酸化海藻酸钠寡糖，标记为S-AOS-1、S-AOS-2、S-AOS-3。
2.4.1 海藻酸钠寡糖及其硫酸化衍生物还原力测定
溶液吸光度与寡糖的还原力呈正相关，吸光度越大，还原力越强，AOS 和不同取代度S-AOS 还原力测定的结果如图12 所示。
图12 AOS 与S-AOS 的还原力
Fig.12 Reducing power of AOS and S-AOS
从图12 可以看出，AOS 与不同取代度S-AOS 还原力都随浓度增大逐渐加强，且不同取代度S-AOS 还原力都高度显著高于AOS（P<0.001），说明硫酸化修饰可以显著提高AOS 的还原力。不同取代度S-AOS 之间比较，发现S-AOS 的还原力随取代度的升高而增加，S-AOS-3 的还原力最强，S-AOS 还原力与硫酸取代度密切相关，随着硫酸取代度增高，还原力逐渐增加。
2.4.2 海藻酸钠寡糖及其硫酸化衍生物对ABTS+自由基的清除作用
AOS 和不同取代度S-AOS 的清除ABTS+自由基的结果如图13 所示。
图13 AOS 与S-AOS 对ABTS+自由基的清除能力
Fig.13 ABTS+free radicals scavenging ability of AOS and S-AOS
由图13 可以看出，AOS 对ABTS+自由基清除能力较弱，而硫酸衍生化后可以显著提高寡糖清除ABTS+自由基的能力，随着S-AOS 寡糖浓度增高，清除ABTS+自由基的能力逐渐增强，呈现浓度依赖关系，在浓度为70µg/mL 时，AOS 的ABTS+自由基清除率仅为4.33%，而S-AOS-1、S-AOS-2、S-AOS-3 的ABTS+自由基清除率分别提高到53.05%、65.01%和67.20%，可见硫酸化修饰后可以显著提高AOS 的清除ABTS+自由基的能力，而且随着S-AOS 寡糖浓度的增加清除ABTS+自由基能力逐渐增强。
2.4.3 海藻酸钠寡糖及其硫酸化衍生物对羟自由基的清除作用
AOS 和不同取代度的S-AOS 清除羟自由基的结果如图14 所示。
图14 AOS 与S-AOS 对羟自由基的清除能力
Fig.14 Hydroxyl free radicals scavenging capacity of AOS and S-AOS
由图14 可以看出，AOS 和S-AOS 均具有清除羟自由基的活性，而且随浓度增高羟自由基清除率逐渐升高。然而，AOS 与S-AOS 相比，AOS 羟自由基清除率显著强于硫酸化修饰组（P<0.001），在浓度1.25µg/mL 时羟自由基清除率达到57.71%，比S-AOS-3 高11%，综上，硫酸化修饰降低了AOS 的羟自由基清除能力。
2.4.4 海藻酸钠寡糖及其硫酸化衍生物对DPPH 自由基的清除作用
AOS 和不同取代度S-AOS 对DPPH 自由基的清除能力如图15 所示。
图15 AOS 与S-AOS 对DPPH 自由基的清除能力
Fig.15 DPPH free radicals scavenging ability of AOS and S-AOS
由图15 可以看出，AOS 在浓度25～125µg/mL 时清除DPPH 自由基能力较弱。而硫酸基团修饰后寡糖清除DPPH 自由基的能力显著提高（P<0.001），并且呈现浓度依赖关系，随浓度增高而增高；其中S-AOS-3 清除DPPH 自由基能力相对于S-AOS-1、S-AOS-2 组较强，表明硫酸基取代度对S-AOS 清除DPPH 自由基具有影响作用，高硫酸基取代度的S-AOS 清除DPPH 自由基的能力更强。
3 结论
硫酸化修饰海藻酸钠的研究基本聚焦于多糖，海藻酸钠寡糖硫酸化修饰的研究较少，主要原因是寡糖硫酸化修饰通常在极酸环境下进行，导致硫酸衍生化过程中不易控制产物的分子大小和取代度，难以获得理想的寡糖硫酸化衍生物。然而寡糖硫酸化衍生物在水溶性和生物活性方面有着多糖不可替代的优势，因此优化海藻酸寡糖硫酸化修饰的反应条件对制备理想的S-AOS 具有重要的意义。本研究通过氯磺酸-吡啶法制备硫酸化海藻酸钠寡糖。最佳反应条件为氯磺酸-吡啶体积比为1∶7，硫酸化试剂-海藻酸钠寡糖溶液体积比为1∶3，反应时间3 h，反应温度40 ℃。在此条件下制备的硫酸化海藻酸钠寡糖取代度为0.963。抗氧化结果表明硫酸化修饰对AOS 的体外抗氧化活性有较大影响，修饰后可以提高AOS 的还原力和清除ABTS+、DPPH 等自由基的能力，且作用跟取代度呈正相关。综上所述，S-AOS 具有良好的抗氧化效果，具有较好的应用价值和开发潜力。
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