2 型糖尿病（type II diabetes mellitus，T2DM）是一种威胁人体健康的主要慢性代谢疾病，存在危害性大、发病率高等特点[1]。T2DM 患者体内的二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）能够将胰高血糖素样肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）迅速降解，导致肠促胰岛素效应降低[2]。目前，针对T2DM 治疗的药物主要包括西格列汀（Sitagliptin）、维达列汀（Vildagliptin）和沙格列汀（Saxagliptin）等，上述治疗T2DM 的药物是通过抑制DPP-IV活性、提高血浆中GLP-1 水平并延长内源性GLP-1 半衰期，从而达到促进胰岛素分泌的作用，进而达到降低血糖的效果[3]。由于药物治疗具有一定的副作用，如水肿、心力衰竭等不良反应以及骨折风险增加[4]。因此，在糖尿病的相关研究领域中，开发天然、安全、低副作用的DPP-IV 抑制剂受到越来越广泛地关注。近年来，研究发现海洋蛋白肽具有多种生物活性功能，如抗菌[5]、抗肿瘤[6]、增强免疫[7]、抗氧化[8]和降血压[9]等，且海洋源活性肽大部分都是小分子肽，具有良好的生物相容性，更易于被人体吸收利用，从而发挥特定功能活性的作用[10]。目前，利用海洋资源进行蛋白肽的开发已成为人们关注的一大焦点。研究结果表明，由于酶解条件温和，酶解过程中氨基酸不易遭到破坏且水解液中氨基酸含量较高，人们更倾向于通过酶解法来获取海洋源的活性肽[11]。
鲣鱼（Katsuwonus pelamis）是金枪鱼的一种。鲣鱼作为重要的远洋经济鱼类，2021 年远洋捕捞量为32.23 万t，加工产生的鱼头、鱼皮、鱼骨和红肉等加工副产物数量巨大。鲣鱼的肌肉包括普通肉和红肉两部分，普通肉是用来制作罐头和生鱼片的原料，鲣鱼红肉则由于肉质粗糙、腥味重、味道酸涩等不足，多用来做饲料处理[12]。但是研究显示鲣鱼红肉在营养价值上不亚于普通肉。鲣鱼普通肉与红肉的营养成分研究发现，红肉中的蛋白营养价值比普通肉稍低，但总脂肪和不饱和脂肪酸的含量高于普通肉，同时还富含Ca、Fe、Zn 等矿物元素[13]。王锐等[14]通过对金枪鱼暗色肉进行酶解得到具有抗氧化和降血压功能活性的生物活性肽；李淑凡等[15]通过酶解金枪鱼红肉不仅发现该酶解液对小鼠具有抗氧化作用，还具有抗疲劳以及调节肠道菌群的能力。然而，对于鲣鱼红肉的DPP-IV 抑制活性的研究目前报道较少。
因此，本研究以鲣鱼红肉为原料，采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和风味蛋白酶酶解制备具有DPP-IV 抑制活性的鲣鱼红肉肽，通过单因素试验和响应面优化试验优化酶解工艺，并考察其对DPP-IV 的抑制活性，以期为高值化利用鲣鱼红肉蛋白质资源提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
鲣鱼红肉:浙江兴业集团有限公司；中性蛋白酶（50 000 U/g）:上海索莱宝生物科技有限公司；胃蛋白酶（10 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）、风味蛋白酶（20 000 U/g）:上海瑞永生物技术有限公司；DPP-IV 抑制剂筛选试剂盒:武汉艾美捷生物技术有限公司；甲醛（分析纯）:上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠、柠檬酸（均为分析纯）:上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.2 仪器与设备
H1750R 台式高速冷冻离心机:湘潭湘仪仪器有限公司；HH-4 恒温水浴锅:成都博纳科技有限公司；SpectraMax-M2 多功能酶标仪:上海美谷分子仪器有限公司；ATY224 电子天平（精度0.1 mg）:上海岛津企业管理有限公司；LGJ-18 冷冻干燥机:北京松源华兴科技发展有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 鲣鱼红肉肽制备工艺
鲣鱼红肉匀浆→调节pH 值→酶解→灭酶→离心→取上清液→冷冻干燥→粗多肽粉。
1.2.2 蛋白酶的筛选
除去鲣鱼红肉中的杂质（鱼骨、鱼刺和其他杂物），称取一定质量的鲣鱼红肉，以料液比1∶5（g/mL）加入蒸馏水匀浆，并按照表1 中参数分别调节中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和胃蛋白酶的反应条件。将上述制备好的鲣鱼红肉匀浆液放置恒温水浴锅内酶解处理4 h，酶解完成后随即将其置于90 ℃恒温水浴锅内灭酶15 min，冷却至室温，8 000 r/min 离心10 min，取上清液，冷冻干燥，-80 ℃保存待用。
表1 5 种蛋白酶酶解参数
Table 1 Enzymatic hydrolysis parameters of five proteases
蛋白酶中性蛋白酶碱性蛋白酶胰蛋白酶风味蛋白酶胃蛋白酶蛋白酶添加量/（U/g）8 000 8 000 8 000 8 000 8 000酶解pH 值7 10 872酶解温度/℃50 55 37 53 37酶解时间/h 44444料液比/（g/mL）1∶5 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5
1.2.3 水解度的测定
采用甲醛滴定法测定鲣鱼红肉酶解的水解度[16]。用蒸馏水将样品（酶解液，5 mL）定容至100 mL。吸取稀释后的样品液20 mL，再使用0.05 mol/L 的NaOH 溶液边搅拌边滴定至pH 值为8.2。再立即加入10 mL甲醛溶液，轻轻搅拌均匀。最后用NaOH 溶液将其滴定至pH 值9.2，将此时消耗的的NaOH 溶液体积记录下来。鲣鱼红肉的蛋白质质量使用考马斯亮蓝法进行测定。水解度（degree of hydrolysis，DH）计算公式如下。
式中:h1 为酶解液的氨基态氮浓度，mmol/g；D 为水解度，%；h0 为未加酶的溶液的氨基态氮浓度，mmol/g；V1 为滴定酶解液（未加酶的溶液）消耗的NaOH 溶液体积，mL；V2 为滴定蒸馏水消耗的NaOH 溶液体积，mL；C 为NaOH 溶液浓度，0.05 mol/L；m 为鲣鱼肉蛋白质质量，g；V 为待测液体积，mL；htot 为鲣鱼红肉每克蛋白的肽键毫摩尔数，7.8 mmol/g；20 为样品稀释液量，mL；5 为样品量，mL。
1.2.4 DPP-IV 抑制率的测定
采用Kuranov 等[17]的方法，测定鲣鱼红肉酶解液的DPP-IV 抑制率。使用人重组DPP-IV 酶、荧光DPP底物（H-Gly-Pro-AMC）测定化合物的活性。在每个反应孔中添加测定缓冲液、DPP-IV 和每种待测物的溶液10 µL。后加入底物溶液，开始反应。将96 孔板在37 ℃下孵育30 min，进行酶抑制剂反应，并使用酶标仪在激发波长350 nm 和发射波长450 nm 下连续测定。每个样品在两次独立试验中进行3 次重复测定。DPP-IV 抑制率（P，%）的计算公式如下。
式中:A1 为添加缓冲液、DPP-IV 和稀释溶剂反应孔的吸光值；A2 为添加缓冲液、DPP-IV 和样品反应孔的吸光值。
1.2.5 单因素试验
参照李守江等[18]和曹天丽等[19]的方法进行单因素试验。以DH 和DPP-IV 抑制率为指标，单因素试验的基本条件为初始酶解pH 值7.0、酶解温度50 ℃、蛋白酶添加量8 000 U/g、酶解时间4 h、料液比1∶5（g/mL），分别研究酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）、蛋白酶添加量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g）、酶解pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）和料液比[1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）]对鲣鱼红肉酶解液的DH 及DPP-IV 抑制率的影响。
1.2.6 响应面试验设计
参照Qiao 等[20]的方法进行响应面试验。在单因素试验结果的基础上，以酶解时间（A）、酶解温度（B）和蛋白酶添加量（C）为自变量，以DH 和DPP-IV 抑制率为响应值，响应面试验根据Box-Behnken 试验设计原理设计三因素三水平的优化试验，确定酶解的最佳工艺条件。响应面试验设计因素及水平见表2，每组试验进行3 次，结果取平均值。
表2 响应面试验设计因素及水平
Table 2 Response surface experiment design factors and levels
水平-1 01因素A 酶解时间/h 456 B 酶解温度/℃50 55 60 C 蛋白酶添加量/（U/g）6 000 8 000 10 000
1.3 数据处理
采用Graphad Prism 8.0 和SPSS 26.0 软件进行图形的绘制和数据处理统计分析。采用单因素方差分析进行各组样本平均数的比较。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶筛选
选取5 种蛋白酶，分别在其最适宜条件下对鲣鱼红肉进行酶解，水解度和DPP-IV 抑制率结果见图1。
图1 不同蛋白酶对鲣鱼红肉酶解液水解度和DPP-IV 抑制率的影响
Fig.1 Effects of different proteases on DH and DPP-IV inhibition rate of enzymatic hydrolysate of skipjack tuna dark muscles
由图1 可知，中性蛋白酶酶解鲣鱼红肉的效果最佳，DH 和DPP-IV 抑制率最高，胰蛋白酶酶解鲣鱼红肉的效果次之，而碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶酶解鲣鱼红肉的效果略差。统计分析表明，中性蛋白酶酶解鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率显著高于胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶（P<0.05）。因此，以中性蛋白酶为最佳蛋白酶制备鲣鱼红肉DPPIV 抑制肽，并进行后续单因素和响应面试验。
2.2 单因素试验结果分析
2.2.1 酶解pH 值对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响
不同酶解pH 值对鲣鱼红DH 和DPP-IV 抑制率的影响见图2。
图2 酶解pH 值对鲣鱼红肉肽水解度和DPP-IV 抑制率的影响
Fig.2 Effect of pH on DH and DPP-IV inhibition rate of skipjack tuna dark muscle peptide
由图2 可知，在酶解pH 值为5.5～7.5 时，DH 和DPP-IV 抑制率随酶解pH 值的升高先逐渐升高后显著降低（P<0.05），在酶解pH 值为7.0 时，DH 和DPP-IV抑制率均达到最大值。原因可能是在酶解pH 值过高或过低时，改变了酶与底物的带电状态，并且使蛋白酶的稳定性发生变化，从而对蛋白酶造成不可逆的破坏[21]。综上，选择酶解pH 值为7.0。
2.2.2 酶解温度对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响
不同酶解温度对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响见图3。
图3 酶解温度对鲣鱼红肉肽的水解度和DPP-IV 抑制率的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on DH and DPPIV inhibition rate of skipjack tuna dark muscles peptide
由图3 可知，随酶解温度升高，DH 和DPP-IV 抑制率先升高后降低，当酶解温度达到55 ℃时，DH 和DPP-IV 抑制率达到最大值，超过55 ℃时，均显著下降（P<0.05）。原因可能是酶解温度不断升高，促进了酶促反应的进行，进而达到中性蛋白酶的最适酶解温度（DH、DPP-IV 抑制率达到最大值），然而当反应体系温度过高时，会使蛋白酶的次级键断裂，从而导致蛋白质发生变性，DH 下降，DPP-IV 抑制率下降[22]。Suo 等[9]利用中性蛋白酶酶解鲣鱼红肉制备ACE 抑制肽，发现酶解温度55 ℃最佳，与本研究结果一致。综上，选择酶解温度50、55、60 ℃进行后续试验。
2.2.3 蛋白酶添加量对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响
不同蛋白酶添加量对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响见图4。
图4 蛋白酶添加量对鲣鱼红肉肽的水解度和DPP-IV 抑制率的影响
Fig.4 Effect of protease addition amount on DH and DPP-IV inhibition rate of skipjack tuna dark muscles peptide
由图4 可知，蛋白酶添加量为2 000～10 000 U/g时，随蛋白酶添加量的增加，DH 先显著增大（P<0.05），在达到8 000 U/g 时，DH 不再发生显著变化（P>0.05）。而DPP-IV 抑制率先增大后减小，在8 000 U/g 时达到最大值，随后显著下降（P<0.05）。原因可能是随蛋白酶添加量的增大，酶与底物的接触位点增多，酶解速度提高；但当蛋白酶添加量过高时，酶与底物完全充分地接触，底物水解完全，从而导致底物DH 和DPP-IV 抑制率不再发生变化或变化很小，不具有显著性[23]。王建成等[24]利用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶在加酶量为6 000～14 000 U/g 时酶解红松仁，结果显示，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的DH 均先逐渐增加，当蛋白酶添加量达到一定值时，DH 不再发生显著性的增加，与本试验结果一致。综上，选择蛋白酶添加量6 000、8 000、10 000 U/g 进行后续试验。
2.2.4 酶解时间对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响
不同酶解时间对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响见图5。
图5 酶解时间对鲣鱼红肉肽水解度和DPP-IV 抑制率的影响
Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on DH and DPP-IV inhibition rate of skipjack tuna dark muscles peptide
由图5 可知，DH 随酶解时间的延长先显著增大（P<0.05），达到4 h 后DH 无显著性变化（P>0.05）。酶解时间2～6 h 时，DPP-IV 抑制率是先增大后减小，在5 h 时达到最大值，随后显著下降（P<0.05）。原因可能是随着酶解时间的延长，底物（鲣鱼红肉）逐渐被中性蛋白酶酶解，从而导致整体的浓度降低。综上，选择酶解时间4、5、6 h 进行后续试验。
2.2.5 料液比对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响
不同料液比对鲣鱼红肉DH 和DPP-IV 抑制率的影响见图6。
图6 料液比对鲣鱼红肉肽水解度和DPP-IV 抑制率的影响
Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on DH and DPP-IV inhibition rate of skipjack tuna dark muscles peptide
由图6 可知，料液比为1∶2～1∶6（g/mL）时，DH 显著增加（P<0.05），在料液比为1∶6（g/mL）时达到最大值，随后无显著性变化（P>0.05）。而在1∶2～1∶10（g/mL）范围内，DPP-IV 抑制率先增大后显著下降（P<0.05），在料液比为1∶8（g/mL）时达到最大值。原因可能是溶剂添加量较低时，底物与酶的接触程度受物料的粘稠度影响，会使酶解速度缓慢，但是随着溶剂添加量的增大，会使酶与底物的接触位点增多，从而导致DH增大，DPP-IV 抑制率增大，然而当料液比增加到1∶6、1∶8（g/mL）时，就会造成底物浓度过低从而导致酶解效率低，引起DH 下降，DPP-IV 抑制率下降[25]。综上，选择料液比1∶8（g/mL）进行后续试验。
2.3 响应面试验
2.3.1 Box-Behnken 试验设计及结果
基于以上单因素试验与分析结果，以酶解时间（A）、酶解温度（B）和蛋白酶添加量（C）为影响因素，按照Box-Behnken 试验设计原理，采用Design-Expert 12.0 软件进行分析三因素三水平响应面试验，响应面试验设计方案及数据处理结果如表3 所示。
表3 响应面试验设计方案及结果
Table 3 Response surface experiment design and results
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 A 酶解时间-1-1-1-1 0000000001111 B 酶解温度010-1-1 00-110100-1001 C 酶添加酶量10-10100-1-1 010001-10 D DH/%28.60 24.36 22.21 23.55 27.96 33.39 34.88 22.74 21.85 34.00 23.89 32.79 33.12 24.30 23.01 21.79 20.92 P DPP-IV抑制率/%47.50 52.71 40.67 56.89 41.79 57.80 56.60 40.88 42.04 58.34 48.63 55.97 57.37 40.80 39.27 41.22 53.04
2.3.2 模型建立及显著性分析
按照Box-Behnken 试验设计原理要求，将以上17 组试验数据进行二次多元回归拟合，获得测定指标（DH 和DPP-IV 抑制率）与影响因子（酶解时间、酶解温度和酶添加量）的关系为D=33.64-1.09A-0.941 2B+1.86C-1.05AB-1.29AC-0.795BC-5.28A2-5.07B2-4.45C2；P=57.216-2.93A+2.007 5B+1.547 5C+4.105AB-2.195AC+1.42BC-3.763A2-2.593B2-11.288C2。
为了验证上述二次多元回归方程的准确及有效性对响应面法优化鲣鱼活性肽的DH 和DPP-IV 抑制率的显著性和多元回归模型的方差进行进一步分析，其分析结果见表4 和表5。
表4 响应面法优化鲣鱼红肉肽DH 的方差分析
Table 4 Variance analysis of DH of skipjack tuna dark muscle peptide optimized by response surface methodology
注:*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）；***表示影响高度显著（P<0.001）。
项目模型ABCA B AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总和平方和403.16 9.46 7.09 27.64 4.39 6.68 2.53 117.4 108.36 83.49 4.83 2.11 2.72 407.99自由度91111111117341 6均方根44.8 9.46 7.09 27.64 4.39 6.68 2.53 117.4 108.36 83.49 0.689 9 0.702 4 0.680 6 F 值64.93 13.71 10.27 40.06 6.36 9.69 3.66 170.16 157.05 121.01 1.03 P 值<0.000 1 0.007 6 0.015 0 0.000 4 0.039 7 0.017 0 0.097 2<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.468 1显著性********************
表5 响应面法优化鲣鱼红肉肽DPP-IV 抑制率的方差分析
Table 5 Variance analysis of DPP-IV inhibition rate of skipjack tuna dark muscle peptide optimized by response surface methodology
注:*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）；***表示影响高度显著（P<0.001）。
项目模型ABCA B AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总和平方和881.28 68.68 32.24 19.16 67.40 19.27 8.07 59.62 28.31 536.50 12.58 9.02 3.56 893.86自由度91111111117341 6均方根97.92 68.68 32.24 19.16 67.40 19.27 8.07 59.62 28.31 536.50 1.80 3.01 0.890 0 F 值54.49 38.22 17.94 10.66 37.51 10.72 4.49 33.18 15.75 298.54 3.38 P 值<0.000 1 0.000 5 0.003 9 0.013 8 0.000 5 0.013 6 0.071 9 0.000 7 0.005 4<0.000 1 0.135 2显著性*********************
由表4 和表5 可知，回归方程一次项A 对DH 的影响极显著（P<0.01），B 对DH 的影响显著（P<0.05），而C 对DH 的影响高度显著（P<0.001）；A 对DPP-IV抑制率的影响高度显著（P<0.001），B 对DPP-IV 抑制率的影响极显著（P<0.01），而C 对DPP-IV 抑制率的影响显著（P<0.05）。其中，模型的P 值均小于0.001，表明该模型具有高度显著性，说明试验方法可行；同时模型的失拟项P 值分别为0.468 1（以DH 为响应值）和0.135 2（以DPP-IV 抑制率为响应值）均大于0.05说明不显著，以上试验结果进一步说明该模型与实际试验情况拟合情况较好，可以使用该模型对实际试验进行预测和分析。
其他响应面模型的相关系数，R²反映了回归方程对数据的拟合程度，R²越接近0 则表明拟合程度越差，反之则越好。响应面试验相关系数见表6。
表6 响应面试验相关系数
Table 6 Correlation coefficients of response surface experiment
相关系数DH DPP-IV 抑制率标准偏差0.830 6 1.34平均值26.67 48.91变异系数/%3.11 2.74 R²0.988 2 0.985 9 R²Adj 0.972 9 0.967 8 R²Pre 0.906 9 0.832 3精密度21.080 6 18.118 5 60 22 24 26 26 28水解度/%
由表6 可知，该试验R²分别为0.988 2 和0.985 9，说明响应值与回归方程的拟合程度很好，表明鲣鱼红肉酶解的DH 和DPP-IV 抑制率试验值与预测值具有较好的拟合一致性；模型的R²Adj 分别为0.972 9 和0.967 8，这也表明模型对试验拟合具有一定准确性，试验精确度高，可以用该模型来分析和预测中性蛋白酶酶解鲣鱼红肉的工艺。
2.3.3 交互作用分析
酶解温度、酶解时间和蛋白酶添加量这3 个工艺参数之间的相互影响可以通过响应面图（3D 图和平面图）直观观察。如果响应面中曲面坡度较缓，则说明两个影响因子间交互作用较弱；如果陡峭，说明交互作用较强。对平面响应面而言，等高线为椭圆形时表明研究因素间交互作用显著，而为圆形时表明交互作用并不显著。各因素间交互作用对DH 的影响如图7～图9所示；各因素间交互作用对DPP-IV 抑制率的影响如图10～图12 所示。
图7 酶解时间和酶解温度三维平面关系
Fig.7 Three-dimensional relation of enzymatic hydrolysis time and temperature
图8 酶解时间和蛋白酶添加量三维平面关系
Fig.8 Three-dimensional relation of enzymatic hydrolysis time and protease addition amount
图9 酶解温度和蛋白酶添加量三维平面关系
Fig.9 Three-dimensional relation of enzymatic hydrolysis temperature and protease addition amount
由图7～图9 可知，酶解温度、酶解时间和蛋白酶添加量这3 个因素相互作用对鲣鱼红肉DH 的影响。从图7 中可以看出，响应曲面的坡度较陡，等高线呈近似圆形，表明酶解时间与酶解温度之间存在显著的交互关系（P<0.05）。从图8 中可以看出，响应曲面图的坡度和等高线呈现的图形与图7 类似，表明酶解时间和蛋白酶添加量之间也存在显著的交互关系（P<0.05）。从图9 中可以看出，响应曲面图较为平缓，等高线呈现圆形，表明酶解温度和蛋白酶添加量之间交互关系不显著（P>0.05），与方差分析结果相吻合。
从图10～图12 中可以看出蛋白酶添加量、酶解时间和酶解温度3 个因素间的交互作用对DPP-IV 抑制率产生了一定的影响。从图10 中可以看出，响应曲面图的坡度非常陡峭，等高线呈椭圆形，这表明酶解时间与酶解温度之间存在着高度显著的相互作用（P<0.001）；从图11 中可以看出，响应曲面图坡面略陡且等高线呈椭圆形，表明酶解时间与蛋白酶添加量之间存在显著的交互关系（P<0.05）；从图12 中可以看出，响应曲面图的坡面较平坦，等高线呈圆形，表明酶解温度与蛋白酶添加量之间交互作用不显著（P>0.05），与方差分析结果相吻合。
图10 酶解时间和酶解温度三维平面关系
Fig.10 Three-dimensional relation of enzymatic hydrolysis time and temperature
图11 酶解时间和蛋白酶添加量三维平面关系
Fig.11 Three-dimensional relation of enzymatic hydrolysis time and protease addition amount
图12 酶解温度和蛋白酶添加量三维平面关系
Fig.12 Three-dimensional relation of enzymatic hydrolysis temperature and protease addition amount
2.3.4 模型验证
通过单因素和响应面试验得出，酶解法制备鲣鱼DPP-IV 抑制肽的最佳工艺参数为中性蛋白酶添加量8 160.27 U/g、酶解时间5.35 h、酶解温度55.40 ℃、酶解pH 值7、料液比1∶8（g/mL），按照该工艺进行验证试验，得到DH 和DPP-IV 抑制率分别为（32.19±0.39）%和（56.00±1.14）%，结果与响应面预测值拟合良好。说明通过响应面法优化得到的回归模型方程及最佳条件准确可靠。Zhang 等[26]通过蛋白酶酶解鲢鱼肌肉得到的水解物最高的DH 为（29.29±0.02）%，DPP-IV 抑制率为（56.67±2.23）%，与本试验结果类似。
3 结论
为对鲣鱼红肉中性蛋白酶酶解工艺进行优化，以单因素试验和响应面试验对鲣鱼红肉肽制备过程的蛋白酶添加量、酶解温度和酶解时间进行优化，确定最佳酶解工艺条件为中性蛋白酶添加量8 160.27 U/g、酶解温度55.40 ℃、酶解pH 值7、酶解时间5.35 h、料液比1∶8（g/mL）。该工艺得到的鲣鱼红肉肽水解度为（32.19±0.39）%，DPP-IV 抑制率为（56.00±1.14）%，与响应面预测值吻合度较好。本研究为鲣鱼红肉的功能产品开发和高值化利用提供技术支持。
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