晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）是由还原糖（如果糖和葡萄糖等）的活性羰基与蛋白质、氨基酸、核酸及脂肪的自由氨基通过非酶促反应生成的一类结构稳定的化合物[1]。大量研究发现，机体内AGEs 水平与糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病和尿毒症等慢性疾病的发生密切相关[2]。从来源分类，AGEs 一般可分为内源性AGEs 和外源性AGEs 两种。内源性AGEs 在机体内形成条件温和，形成时间长。外源性AGEs 通常指从膳食中获取的AGEs，也称为食源性AGEs，是机体内AGEs 的主要来源。由于性质稳定，不易被机体内酶降解，AGEs 进入人体循环系统后可持续在体内蓄积，最终导致组织损伤和疾病的发生[3-4]。因此，抑制AGEs 在食品加工、贮存过程中的形成成为研究热点。其中，通过添加植物源活性物抑制糖基化反应进程被证明是减少食源性AGEs 形成的有效途径。
皂素是一类天然的非挥发性糖苷类化合物，通常由疏水性苷元和亲水性糖链组成，两亲特性使皂素具有良好的表面活性[5]。因此，皂素常作为发泡剂和乳化剂用于食品加工领域。此外，皂素还具有良好的生物活性功能，如抗氧化、抗炎和抑菌等，在功能食品添加剂方面表现出良好应用前景[6]。研究发现皂素是有效的糖基化反应抑制因子[7]，但不同来源的皂素抑制活性差异显著。油茶（Camellia oleifera Abel）是我国最主要的木本油料来源，资源量大，饼粕中皂素含量丰富，是重要的天然皂素来源。然而，目前关于茶皂素抗糖基化活性的研究依然缺乏。为抑制食品加工、贮存过程中糖基化反应、减少AGEs 产生，本文探究茶皂素在蛋白质糖基化反应各阶段的抑制能力，以期拓宽茶皂素在食品加工领域作为天然AGEs 抑制剂的新用途，同时为茶皂素的精深化利用提供新思路和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
茶皂素（纯度>98%）:北京索莱宝科技有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、硫黄素T、1-脱氧-1-吗啉-D-果糖、5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、菲咯嗪（纯度≥97%）:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙酮醛（methylglyoxal，MGO）、氨基胍盐酸盐（aminoguanidine hydrochloride，AG）:美国Sigma 公司；羟自由基测试试剂盒:南京建成生物工程研究所；FeCl2·4H2O:国药集团化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯。
SpectraMax®i3x 酶标仪:美国美谷分子公司；CKX荧光倒置显微镜:日本Olymbus 公司；Five Easy plus 型pH 计:瑞士梅特勒公司；Wizard 2.0 冷冻干燥机:美国Virtis 公司；SPECORD 210Plus 紫外分光光度计:德国耶拿仪器公司。
1.2 BSA-MGO 糖基化模型的建立
BSA-MGO 体外糖基化模型的构建参考Wu 等[8]的方法略作调整:取10 mg BSA 充分溶于10 mL 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4）后，加入8µL MGO（质量分数40%），建立糖基化模型。样品组中加入不同质量的茶皂素，设置AG 为阳性对照组（1 mg/mL），不添加抑制剂为空白组。BSA-MGO 于37 ℃反应7 d，反应完成后置于冰水浴终止反应。同时，在糖基化反应过程中，监测牛血清蛋白的紫外吸收光谱和荧光发射光谱的特征变化。其中，牛血清蛋白紫外吸收光谱特征扫描范围250～400 nm，并在激发波长为370 nm 下测定荧光发射光谱（发射波长范围400～600 nm）。
1.3 抗糖基化活性评估
1.3.1 果糖胺含量测定
使用NBT 法测定糖基化模型中果糖胺的含量[9]:以0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH10.8）配制0.5 mmol/L的NBT 溶液，取180µL NBT 溶液与20µL 糖基化溶液混匀，于37 ℃下孵化反应10 min。反应完成后，于530 nm 处测定混合液吸光度，通过1-脱氧-1-吗啉-D-果糖建立标准曲线y=0.119 92x+0.146 91（R2=0.999 5）对果糖胺进行定量。
1.3.2 羰基化合物检测
使用二硝基苯肼（DNPH）法对蛋白质羰基含量进行分析[10]:以2.5 mol/L 盐酸溶液配制10 mmol/L 的DNPH 溶液，取0.5 mL DNPH 溶液与糖基化溶液等体积混匀。室温下静置60 min 后，加入0.5 mL 三氯乙酸溶液（质量分数20%）沉淀蛋白。8 000 r/min 离心10 min 后弃去上清液，使用乙酸乙酯/乙醇（体积比1∶1）溶液洗涤沉淀物3 次后，加入1 mL 8 mol/L 尿素溶液充分溶解沉淀物，在370 nm 处测定吸光度。
1.3.3 β-淀粉样蛋白分析
β-淀粉样蛋白表征参考Prasanna 等[11]的方法:取硫黄素T 溶液（32 mmol/L）与糖基化蛋白溶液等体积共混，室温下静置60 min 后，使用荧光倒置显微镜观察淀粉样蛋白的形成情况。
1.3.4 蛋白质巯基含量检测
使用Ellman 法测定蛋白巯基含量[12]:以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）配制5 mmol/L 的DTNB 溶液，移取130µL DTNB 溶液与70µL 糖基化体系溶液混匀，于室温下反应15 min 后，在410 nm 下测定吸光度。同时使用半胱氨酸建立标准曲线y=2.482 42x+0.562 85，R2=0.999 8，对巯基进行定量分析。
1.3.5 AGEs 抑制活性评价
基于测定糖基化溶液荧光强度，分析茶皂素对AGEs 形成的抑制作用[13]:取0.2 mL 糖基化体系溶液于激发波长370 nm、发射波长440 nm 条件下检测荧光强度。AGEs 抑制率通过以下公式计算。
式中:Y 为AGEs 抑制率，%；L0 为空白组荧光强度；L1 为阳性对照组或样品组荧光强度。
1.3.6 色氨酸和蛋白质氧化产物的检测
色氨酸、二聚酪氨酸、犬尿氨酸及N′-甲酰基犬尿氨酸荧光强度参考Ding 等[14]的方法进行检测:其中，色氨酸荧光强度在激发波长为280 nm、发射波长为350 nm 处测定；二聚酪氨酸荧光强度在激发波长为330 nm、发射波长为415 nm 处检测；犬尿氨酸荧光强度在激发波长为365 nm、发射波长为480 nm 下测定；N′-甲酰基犬尿氨酸荧光强度在激发波长为325 nm、发射波长为434 nm 下检测。
1.4 抗氧化活性评价
1.4.1 羟基自由基清除能力
茶皂素对羟基自由基的清除能力使用试剂盒检测，测定方法参照试剂盒说明书进行。
1.4.2 亚铁离子螯合能力
茶皂素对Fe2+螯合能力的测定参考于慧等[15]的方法:将2 mL 不同浓度皂素溶液与2.7 mL 蒸馏水及0.1 mL 的FeCl2·4H2O 溶液（2 mmol/L）混匀后，加入0.2 mL 菲洛嗪（5 mmol/L），在室温下反应10 min 后，在562 nm 处测定吸光度。同时，以蒸馏水代替样品为对照组，以蒸馏水代替菲洛嗪为空白组。Fe2+螯合率（X，%）通过下列公式计算。
式中:X 为Fe2+螯合率，%；A1 为样品组的吸光度；A2 为空白组的吸光度；A3 为对照组的吸光度。
1.5 数据处理与分析
所有数据均以3 次试验结果的平均值±标准差表示，使用Excel 软件进行显著性差异分析，当P<0.05时表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 糖基化过程BSA 的紫外吸收光谱和荧光发射光谱
使用紫外吸收光谱监测BSA 在糖基化过程中构象的变化，利用荧光发射光谱追踪荧光性AGEs 的形成情况，结果见图1。
图1 BSA 糖基化过程的紫外吸收光谱与荧光发射光谱
Fig.1 Ultraviolet absorption spectra and fluorescence emission spectra of BSA during glycation process
如图1a 所示，原BSA 的最大紫外吸收峰位于280 nm 附近，但在MGO 作用后，最大吸收峰蓝移，且强度逐渐提升。研究表明，MGO 诱导的糖基化反应可使BSA 侧链展开，特别是MGO 与BSA 上精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸间的相互作用能引起BSA 微环境的变化，使BSA 内部的色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸暴露，导致增色效应的发生[16]。如图1b 所示，糖基化模型中BSA 的荧光强度随时间的延长而增强，表明MGO 能促进蛋白质糖基化反应发生，特别是在0～72 h 内，荧光性AGEs 迅速形成，当时间超过72 h 后，AGEs 形成速度减缓，这与紫外吸收光谱的结果相似。
2.2 茶皂素抗糖基化活性表征
2.2.1 茶皂素对果糖胺生成抑制活性
果糖胺是蛋白质糖基化反应早期的重要产物，茶皂素对果糖胺、羰基化合物、巯基含量的影响见表1。
表1 茶皂素对果糖胺、羰基化合物和巯基含量的影响
Table 1 Effect of tea saponin on fructosamine，carbonyl compound，and sulfhydryl group contents
注:同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
组别原BSA空白组BSA BSA+AG（1 mg/mL）BSA+茶皂素（2 mg/mL）BSA+茶皂素（4 mg/mL）BSA+茶皂素（6 mg/mL）BSA+茶皂素（8 mg/mL）BSA+茶皂素（10 mg/mL）果糖胺含量/（mmol/L）0.53±0.03f 5.06±0.21a 0.71±0.06ef 4.60±0.07b 4.47±0.05b 3.76±0.04c 3.28±0.14d 0.92±0.06e羰基化合物含量/（µmol/g）7.87±0.07g 36.96±0.11a 8.40±0.18g 33.04±0.55b 29.84±0.71c 27.44±0.44d 25.02±0.57e 21.01±0.36f巯基含量/（µmol/g）0.50±0.00a 0.07±0.00h 0.43±0.00b 0.12±0.00g 0.16±0.01f 0.22±0.01e 0.23±0.00d 0.25±0.00c
如表1 所示，在MGO 刺激下，糖基化模型中形成了大量果糖胺，尤其是空白组中的果糖胺含量达到5.06 mmol/L，显著高于原BSA（0.53 mmol/L）。添加抗糖基化抑制剂AG 后，果糖胺的形成被有效抑制，含量仅为0.71 mmol/L。茶皂素对果糖胺的形成同样具有抑制作用，当茶皂素浓度为2 mg/mL 时，BSA-MGO 模型中果糖胺含量为4.60 mmol/L，当茶皂素浓度为10 mg/mL 时，果糖胺含量降低至0.92 mmol/L。由此可知，茶皂素在蛋白质糖基化早期具有良好的抑制作用。
2.2.2 茶皂素对羰基化合物形成的抑制能力
羰基化合物是蛋白质糖基化反应的中间阶段产物，反应活性强，能促进蛋白分子间的交联，导致蛋白质生理活性发生变化[17]。由表1 可知，原BSA 中的羰基化合物含量低，仅为7.87µmol/g。然而，空白组BSA 中羰基化合物达36.96µmol/g，表明BSA 中大量氨基酸在MGO 作用下被氧化。茶皂素能有效阻止羰基化合物的形成，并呈现明显量效关系。当茶皂素浓度为2 mg/mL 时，羰基化合物含量为33.04µmol/g，当茶皂素浓度提高至10 mg/mL 时，体系中羰基化合物含量降低为21.01µmol/g。因此，茶皂素在蛋白糖基化中期具有一定抑制效应。
2.2.3 茶皂素对BSA 巯基含量的影响
蛋白质中半胱氨酸和蛋氨酸的巯基在糖基化过程中容易被氧化、形成二硫键，进而导致蛋白质的聚集和交 联[18]。 如 表1 所 示，原BSA 中 巯 基 含 量 为0.50µmol/g，在MGO 作用下，BSA 中86%的巯基被消耗，巯基含量降低为0.07µmol/g。添加AG 后，BSA 中的巯基得到有效保护。同样，茶皂素同样能减少巯基在糖基化进程中被氧化。当茶皂素浓度为2 mg/mL时，BSA 中巯基含量为0.12µmol/g，当茶皂素浓度为10 mg/mL 时，BSA 中50%的巯基得到有效保护。研究发现，活性物中的羟基对保护蛋白质巯基具有重要影响，茶皂素对BSA 巯基的保护作用可能源于其苷元和糖链上大量存在的活性羟基基团[19]。
2.2.4 茶皂素阻碍β-淀粉样蛋白形成的作用
AGEs 在糖基化反应最后阶段会发生分子间交联，形成β-淀粉样蛋白，可永久改变蛋白质原有的生物功能[11]。使用荧光倒置显微镜观察茶皂素对β-淀粉样蛋白形成的影响，结果见图2。
图2 BSA 中β-淀粉样蛋白的荧光倒置显微镜观察
Fig.2 Inverted fluorescence microscope observation of β-amyloid protein in BSA
如图2a 所示，在原BSA 中未观察到明显的荧光团聚物，表明原BSA 中几乎不存在β-淀粉样蛋白。然而，在图2b 中发现大量荧光团聚物，表明BSA 在MGO 作用下发生了分子间交联，形成了大量β-淀粉样蛋白。在图2c、图2d 中只观察到少量分散的荧光点，表明在抑制剂作用下AGEs 的分子间交联减少，仅有少量β-淀粉样蛋白形成，表明添加AG 和茶皂素后抑制β-淀粉样蛋白形成。
2.2.5 茶皂素对AGEs 形成的抑制活性
茶皂素抑制AGEs 形成的活性见图3。
图3 茶皂素对AGEs 的抑制活性
Fig.3 Inhibitory activity of tea saponin on AGEs
如图3 所示，AG 对AGEs 形成的抑制能力强，当浓度为1 mg/mL 时，AGEs 抑制率达95.89%。虽然茶皂素与AG 相比抑制AGEs 能力较弱，当浓度为2 mg/mL时，茶皂素对AGEs 的抑制率为82.13%，但依然高于其他植物源活性物，如浓度为2 mg/mL 红海藻多糖对AGEs 的抑制率仅为58.4%；浓度为2 mg/mL 的杨梅多酚的AGEs 抑制率低于40%[20-21]。同时，茶皂素对AGEs 的抑制呈量效关系，当浓度为10 mg/mL 时，茶皂素的AGEs 抑制率达92.59%。因此，茶皂素能有效抑制AGEs 的形成。
2.3 茶皂素对BSA 糖基化过程中色氨酸
色氨酸是芳香性氨基酸，在糖基化过程中极易被氧化。通过监测内源色氨酸的荧光强度，可了解糖基化对蛋白结构的影响，反映糖基化程度[22]。BSA糖基化过程内源色氨酸及氧化产物荧光强度变化见表2。
表2 BSA 中色氨酸及氧化产物的荧光强度
Table 2 Fluorescence intensity of tryptophan and oxidative products in BSA
注:同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
组别原BSA空白组BSA BSA+AG（1 mg/mL）BSA+茶皂素（2 mg/mL）BSA+茶皂素（4 mg/mL）BSA+茶皂素（6 mg/mL）BSA+茶皂素（8 mg/mL）BSA+茶皂素（10 mg/mL）色氨酸（×107）17.47±0.72a 0.12±0.01f 14.17±0.11b 4.39±0.42c 3.74±0.03c 2.69±0.03d 2.15±0.03d 1.35±0.01e二聚酪氨酸（×106）0.35±0.03e 22.31±1.58a 0.63±0.02e 5.55±0.31b 4.32±0.24bc 3.53±0.07cd 2.35±0.39d 2.26±0.21d犬尿氨酸（×106）0.41±0.04f 17.80±0.82a 0.66±0.09f 8.69±0.17b 7.42±0.06c 5.82±0.07d 5.22±0.13de 4.90±0.03e N′-甲酰基犬尿氨酸（×106）0.45±0.01e 19.34±1.50a 0.54±0.03e 5.43±0.15b 4.46±0.04b 3.21±0.06c 1.67±0.05d 1.13±0.02d
如表2 所示，原BSA 的内源色氨酸荧光强度为17.47×107，经MGO 诱导的糖基化反应后，荧光强度降低至0.12×107。表明糖基化反应消耗了BSA 中大量的色氨酸，造成荧光强度降低。茶皂素可有效保护BSA 中的色氨酸，浓度为2 mg/mL 时，BSA 内源色氨酸荧光强度为4.39×107，是空白组的36.58 倍。然而，随着茶皂素浓度逐渐提高，内源色氨酸荧光强度呈下降趋势，当浓度为6 mg/mL 时，色氨酸荧光强度降低至2.69×107。与Prasanna 等[23]研究结果相似，这可能是茶皂素与BSA 间的相互作用改变了色氨酸周围的微环境，导致部分荧光猝灭的发生。
2.4 茶皂素对BSA 氧化产物的影响
蛋白质糖基化过程常伴随氧化反应，BSA 中的色氨酸和酪氨酸可被氧化形成相应的荧光产物。其中，色氨酸容易被氧化成为二聚酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸，酪氨酸被氧化后可形成犬尿氨酸[24]。由表2 可知，在空白组BSA 中检测到大量二聚酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸，荧光强度分别为原BSA 的63.74 倍和42.98 倍。表明BSA 中大量的色氨酸被氧化，这与上述内源色氨酸分析结果一致。此外，空白组BSA 中犬尿氨酸的荧光强度也显著增强，为17.80×106，是原BSA 的43.41 倍。表明BSA 中的酪氨酸在糖基化过程中同样不稳定。然而，添加茶皂素能有效抑制氧化产物的形成。当茶皂素浓度为2 mg/mL 时，体系中二聚酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸的荧光强度分别降低至5.55×106 和5.43×106；当浓度为10 mg/mL 时，二聚酪氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸的荧光强度进一步降低至2.26×106 和1.13×106。添加茶皂素能降低酪氨酸的氧化程度，当茶皂素浓度为10 mg/mL 时，犬尿氨酸的荧光强度为4.90×106，是空白组的27.53%。因此，茶皂素能提高BSA 的稳定性，减少氧化产物的形成。
2.5 茶皂素的抗氧化活性
茶皂素的抗氧化活性见图4。
图4 茶皂素的抗氧化活性
Fig.4 Antioxidant activity of tea saponin
2.5.1 茶皂素清除羟基自由基活性
活性氧自由基可在糖基化反应早期产生，并加速蛋白质结构的改变、促进AGEs 的形成。·OH 是一类高活性自由基，·OH 介导的蛋白质氧化与羧甲基赖氨酸（典型AGEs）的形成紧密相关[25]。因此，普遍认为清除自由基的活性与抑制AGEs 的能力积极相关。如图4a 所示，茶皂素对·OH 具有良好的清除作用，当浓度为2 mg/mL 时，茶皂素对·OH 的清除率为66.04%；当浓度为4 mg/mL 时，茶皂素的·OH 清除率为90.99%，高于积雪草多糖（约50%）[26]；当茶皂素浓度为10 mg/mL时，·OH 清除率达96.63%。因此，茶皂素对·OH 清除能力强，可通过清除·OH 发挥抑制AGEs 的作用。
2.5.2 茶皂素对Fe2+的螯合能力
Fe2+是一种高活性的过渡态金属离子，可催化并加速蛋白质的糖基化反应[27]。因此，螯合Fe2+是抑制AGEs 形成的重要途径。如图4b 所示，在检测浓度范围内，茶皂素对Fe2+的螯合能力与浓度呈正相关。茶皂素苷元和C3 位连接的糖链上有大量羟基，可能是螯合Fe2+的重要位点。当茶皂素浓度2 mg/mL 时，体系中12.93%的Fe2+被螯合。随着浓度的提高，茶皂素对Fe2+的螯合能力逐渐提升，当浓度为10 mg/mL 时，对Fe2+的螯合率上升至23.80%。因此，茶皂素可通过螯合Fe2+发挥抑制AGEs 的作用。
3 结论
茶皂素在BSA-MGO 体外糖基化模型中表现出优异的抗糖基化活性，当茶皂素浓度为10 mg/mL 时，对荧光性AGEs 的抑制率达92.59%。通过对果糖胺、羰基化合物和β-淀粉样蛋白的监测发现，茶皂素在AGEs 形成的各阶段均具有抑制效应，尤其是在糖基化反应早期，10 mg/mL 茶皂素可减少91.39% 的果糖胺生成。同时，茶皂素能保护BSA 巯基，阻碍AGEs 分子间交联，减少β-淀粉样蛋白的产生。此外，茶皂素还能保护BSA 色氨酸，减少氧化产物二聚酪氨酸、犬尿氨酸和N′-甲酰基犬尿氨酸的形成。抗氧化结果表明，茶皂素能清除·OH 和螯合Fe2+，浓度为4 mg/mL 时可清除90.99%的·OH，可能是阻碍AGEs 形成的重要途径。本研究结果可拓宽茶皂素在食源性AGEs 抑制剂中的应用，提高茶皂素的附加值。
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