随着现代社会生活方式、饮食模式等多因素的变化，出现慢传输型便秘症状的人数呈上升趋势[1]。排便是一个多系统参与、多因素调控的过程，与水分代谢、胃肠动力学、肠道菌群及各种肠道神经递质等因素相关，其中任何一个环节的失衡或功能障碍都可能导致肠道功能异常，从而导致便秘症状[2]，引发多种并发症，严重影响人们的生活质量。目前，常用的便秘治疗药物主要有刺激性泻药、膨胀剂和渗透性泻药。然而，大多数临床药物存在毒副作用强、药物依赖性强等弊端[3]。因此，寻找一种绿色安全并能改善便秘症状的功能成分至关重要。
许多天然植物中的碳水化合物能够维持肠道内稳态的平衡，是理想的通便功能剂和微生态调节剂[4]。研究表明，水苏糖能有效增加便秘小鼠的粪便的湿润度和肠道蠕动，从而防止便秘的发生[5]。因此，开发改善便秘的天然成分已成为主流趋势。
松二糖（Turanose）是一种存在于多种天然物质中的新型功能性二糖，具有防龋、低热量等特点，可应用于食品、医药产业中[6]。它被认为是治疗代谢紊乱患者的合适替代甜味剂，适用于肥胖症等多种代谢性疾病。研究表明，松二糖在体外有抗炎作用[7]，可抑制脂肪形成，具有抑制肥胖和相关慢性病的潜力[8]，在小鼠急性和13 周毒理学研究中未显示毒性[9]。因此作为新型的功能性甜味剂，在食品领域中具有良好的发展前景。松二糖、果糖和葡萄糖等占蜂蜜总成分的70%～80%，已有研究表明蜂蜜可以提高粪便含水率，增加肠道蠕动，提高结肠中神经递质P 物质（substance P，SP）含量，对于治疗便秘有一定作用[10]。松二糖作为天然存在于蜂蜜中的蔗糖异构体，可在蜂蜜治疗便秘中发挥重要作用。而松二糖是否具有通便功效，目前缺乏相关研究。因此，本研究通过洛哌丁胺诱导的慢传输型便秘小鼠模型来评价松二糖的通便作用活性，并进一步借助实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTqPCR）和酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等技术方法探究其通便作用机制，旨在为松二糖调节肠胃功能方面的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
松二糖（Turanose）、阿拉伯树胶、活性炭粉:上海阿拉丁生化科技股份有限公司。昆明小鼠（72 只，17～20 g，SPF 级）:北京斯贝福动物实验有限公司；酚酞（99%）:山东仁和堂药业有限公司；洛哌丁胺（99%）:默克生命科学（上海）有限公司。
总RNA 提取、反转录和实时定量PCR 试剂盒:南京诺唯赞生物科技股份有限公司；血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶联免疫吸附试剂盒:上海生工生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
数显恒温水浴锅（HWS24）:常州国华电器有限公司；电子天平（CP153）:奥豪斯仪器上海有限公司；超纯水机（Micro Pure UV）:赛默飞世尔科技（中国）有限公司；微型涡旋混合器（WXH）:上海跃进医疗仪器厂；组织破碎仪（TGrin H24）、定点分光光度计（OSE-260-3）:天根生化科技（北京）有限公司；低温离心机（540FM02 3109）:中科生命科技股份有限公司；低速离心机（SC-3616）:安徽中科中佳科学仪器有限公司；实时荧光定量PCR 仪（Light Cycler480）:德国Roche 公司；恒温干燥箱（DZF-6020）:巩义市予华仪器有限责任公司；恒温箱（HWS-150）:上海精宏实验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物实验的设计及分组
将SPF 级昆明种小鼠分为空白对照（CON）组、模型对照（LOP）组、阳性对照（POS）组和松二糖低、中、高剂量（LTUR、MTUR 和HTUR）组，每组12 只小鼠，每笼3 只。CON 组灌胃0.9% 生理盐水，LOP 组灌胃8 mg/（kg·d）洛哌丁胺，POS 组灌胃200 mg/（kg·d）的酚酞和8 mg/（kg·d）的洛哌丁胺，3 个剂量组分别灌 胃 相 应浓度的松二糖[250、500、750 mg/（kg·d）]和8 mg/（kg·d）的洛哌丁胺。每天上午9 点灌胃，灌胃体积为0.1 mL/10 g 体质量，连续灌胃7 d。实验期间，小鼠自由饮水和进食，每天给药前称量小鼠食物和饮用水，按下列公式计算每只小鼠每天的摄食量[S，g/（只∙d）]和摄水量[W，g/（只∙d）]。
式中:f 为定食量，g；l 为剩食量，g；d 为定水量，g；r为剩水量，g；12 为小鼠数量，只；7 为实验时间，d。
1.3.2 排便实验
排便前配制墨汁，准确称量10 g 阿拉伯树胶和5 g 活性炭，烧杯中加入80 mL 无菌水置于水浴锅中煮沸，加入阿拉伯树胶煮至透明后加入活性炭，搅拌混匀，待冷却后定容至100 mL，灭菌后放入4 ℃冰箱保存备用[11]。
在各受试物干预后的第6 天晚上，将小鼠垫料替换为刨花垫料，对各组小鼠采取撤食处理，自由饮水。第二天早上提前将灭菌纱布铺于笼内，放上对应小鼠的标签和灭菌EP 管。分别给各组小鼠灌胃相应的受试物，30 min 后，各组小鼠按0.1 mL/10 g 体质量进行墨汁灌胃。记录每只小鼠首粒黑便时间，并收集6 h内小鼠排出的粪便，将收集的粪便样品置于80 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重，按下式计算出各组小鼠的粪便含水率（F，%）。
式中:a 为粪便湿重，g；b 为粪便干重，g。
1.3.3 小肠运动实验
在各受试物干预的第7 天晚上，对各组小鼠采取撤食处理，但饮水自由。第二天早上灌胃相应剂量的受试物，30 min 后，各组小鼠按0.1 mL/10 g 体质量进行墨汁灌胃。20 min 后，通过CO2 吸入法处死小鼠，随即打开小鼠腹腔，取出肠道，剪取幽门至盲部的肠段，测量长度，以幽门到墨汁前沿的距离作为小肠墨汁推进的距离，按下式计算各组小鼠的墨汁推进率（M，%）。
式中:c 为墨汁的推进距离，cm；d 为小肠全长，cm。
1.3.4 RNA 提取、反转录及实时荧光定量PCR
1）总RNA 提取:取20 mg 的小鼠结肠组织放入装有研磨珠和裂解液的组织研磨管中，在组织破碎仪中将结肠彻底研磨均匀；提取步骤参考总RNA 提取试剂盒说明书进行，洗脱好的RNA 及时采用定点分光光度计测定其浓度和纯度。
2）反转录:RNA 提取后，及时将浓度和纯度合格的RNA 进行反转录，其操作步骤参考反转录试剂盒说明书进行，分别取计算好所需的模板RNA 的量、ddH2O 和4×gDNA wiper Mix 4µL 置于200µL 无酶离心管中混匀，于PCR 仪上扩增42 ℃，2 min，4 ℃进行第一步反应；在扩增好的第一步反应液中加入5×HiScript qRT SuperMixⅡ，混匀后于PCR 仪上扩增37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，反 转 完 成 后 得 到 的cDNA 保 存于-80 ℃冰箱保存备用；
3）实时荧光定量PCR:根据需求稀释cDNA 和引物浓度。利用实时荧光定量PCR 试剂盒配制相应的PCR 体系。然后应用PCR 仪进行功能基因表达的测定，所有PCR 反应均设置2 个重复。PCR 反应程序:95 ℃预变性，30 s（斜率变化率4.4 ℃/s）1 循环；95 ℃变性10 s（斜率变化率4.4 ℃/s），60 ℃退火和延伸30 s（斜率变化率2.2 ℃/s）（200 bp 以内的扩增子，延伸时间为20 s；200 bp 以上的扩增子，延伸时间为30 s），40 循环；融解曲线95 ℃15 s（斜率变化率4.4 ℃/s），60 ℃1 min（斜率变化率2.2 ℃/s），95 ℃（斜率变化率0.11 ℃/s）1 循环，50 ℃30 s（斜率变化率2.2 ℃/s）1 循环。以βactin 作为内参基因，标定目的基因mRNA 的相对表达。根据样品循环数阈值（cycle threshold，CT）值，采用2-△△CT 法计算目的基因的相对表达量。本研究中测定的目标基因和管家基因的引物序列见表1。
表1 功能基因表达测定所用引物序列
Table 1 Primer sequences for functional gene expression determination
基因名称β-actin Aqp3 Aqp4 Aqp8 Aqp9 VIP iNOS引物序列（5′-3′）上游:5′-CGGACACGGACAGGATTGACA-3′下游:5′-CCAGACAAATCGCTCCACCAACT-3′上游:5′-GTCAACCCTGCCCGTGACTTTG-3′下游:5′-CGAAGACACCAGCGATGGAACC-3′上游:5′-GCAGACAAGGTGCAACGTGGTT-3′下游:5′-GGCGGAAGGCAAAGCAGTATGG-3′上游:5′-CACAGCAGGGTTGAAGTGTC-3′下游:5′-AGTCCGAATACTGGGCTCCT-3′上游:5′-TAGTGATGATCCCACCAGCC-3′下游:5′-CACTCTCTGAGTTCCTGGGC-3′上游:5′-TTATCTGCATCATCCGAA-3′下游:5′-GGAAAGACCCTACGACGA-3′上游:5′-ATTCAGATCCCGAAACGC-3′下游:5′-CCAGAACCTCCAGGCACA-3′
1.3.5 血清神经递质的检测
小鼠CO2 吸入法处死后取血，于37 ℃恒温箱孵育30 min 后，置于4 ℃低温离心机3 500 r/min 离心10 min，收集血清。采用ELISA 试验测定5-HT 和VIP含量。根据试剂盒提供步骤进行测定。
1.3.6 脏器指数
在各受试物干预的最后一天早上，称量小鼠体质量，CO2 吸入法处死后取小鼠的肝脏、肾脏和盲肠称重，并计算每只小鼠的脏器指数（Z，mg/g）。
式中:v 为脏器质量，mg；w 为小鼠质量，g。
1.4 数据处理
实验所得数据采用GraphPad Prism 9.0 软件进行数据统计和图片绘制，数据统计结果以平均值±标准差表示。使用独立T 检验比较两组数据之间的差异显著性（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 松二糖对便秘小鼠机体指标的影响
在各受试物干预过程中，小鼠的体质量变化、摄食量、摄水量以及肝脏、肾脏和盲肠指数结果如图1所示。
图1 松二糖对便秘小鼠体质量、摄食量、摄水量和脏器指数的影响
Fig.1 Effects of Turanose on body weight，food intake，water intake and organ index in mice with constipation
由图1 可知，实验期间各组小鼠的体质量在正常范围内波动，生长状况良好。各组小鼠的摄食量、摄水量和各脏器指数整体上差异不明显，表明受试物对小鼠的机体指标的影响较小，相对安全。
2.2 松二糖对便秘小鼠的排便状态的影响
松二糖对便秘小鼠排便参数的影响如图2 所示。
图2 松二糖对便秘小鼠排便参数的影响
Fig.2 Effects of Turanose on defecation parameters of constipated mice
由图2 可知，与CON 组首粒黑便时间（158 min）相比，LOP 组的首粒黑便时间（255 min）增加了38.03%（P<0.001）；与LOP 组相比，HTUR 组小鼠的首粒黑便时间缩短了18.04%，差异显著（P<0.05），POS 组首粒黑便时间显著缩短了22.74%（P<0.05），此外，LTUR 组和MTUR 组的首粒黑便时间分别缩短了30.94%，13.33%（P<0.05）；此外，与CON 组相比，LOP 组粪便含水率下降了11.11%（P<0.01），HTUR 组粪便含水率增加10.01%（P<0.05）；与CON 组相比，LOP 组粪便数量减少了6 粒（P<0.05），粪便质量减少0.2 g（P<0.05）。以上结果表明，松二糖高剂量组能显著缩短排便时间，改善便秘小鼠的粪便状态，提高粪便含水率。
2.3 松二糖对便秘小鼠的小肠运动的影响
胃肠道转运率是评价受试物通便作用的重要指标之一[12]。松二糖对便秘小鼠的小肠运动的影响如图3所示。
图3 松二糖对便秘小鼠小肠运动的影响
Fig.3 Effect of Turanose on intestinal motility of constipated mice
由图3 可知，各组小鼠间的小肠长度差异不显著（P>0.05）。因此，可排除其对小肠运动实验结果的影响。与CON 组相比，LOP 组的墨汁推进率减少22.97%（P<0.01），表明便秘模型成立。与LOP 组相比，实验组的墨汁推进率呈剂量依赖性增加，HTUR 组墨汁推进率增加14.90%（P<0.05）。结果表明，松二糖可以通过促进便秘小鼠小肠蠕动从而缓解便秘。
2.4 松二糖对便秘小鼠神经递质相关因子的表达的影响
便秘与肠神经递质的异常表达密切相关[13]。5-HT为兴奋性神经递质，可刺激肠肌收缩，促进肠蠕动[14]。VIP 是ENS 中重要的抑制性神经递质，可抑制肠循环肌的收缩，使肠道处于松弛状态[15]。松二糖对便秘小鼠神经递质相关因子的影响如图4 所示。
图4 松二糖对便秘小鼠神经递质相关因子的影响
Fig.4 Effects of Turanose on neurotransmitter related factors of constipation mice
由图4 可知，与CON 组相比，LOP 组小鼠血清中的5-HT 的表达下降，而TUR 干预后能显著上调血清中5-HT 的表达（P<0.01），下调抑制性神经递质VIP 的含量，同时显著下调诱导型iNOS 的mRNA 表达（P<0.05）；结果表明，松二糖能通过调节血清和结肠中神经递质相关因子的表达来改善便秘小鼠的症状。
2.5 松二糖对便秘小鼠结肠组织中水通道蛋白的基因表达的影响
水通道蛋白在肠道的异常表达会导致结肠中水分的吸收和肠液的分泌发生紊乱[16]，从而导致便秘症状的发生。松二糖对便秘小鼠结肠水通道蛋白表达的影响如图5 所示。
图5 松二糖对便秘小鼠结肠水通道蛋白表达的影响
Fig.5 Effect of Turanose on the expression of colonic aquaporins of constipated mice
由图5 可知，与CON 组相比，LOP 结肠中Aqp3 的mRNA 增加了5 倍（P<0.01），Aqp4 的mRNA 表达量也增加，但不存在显著性差异，此外，Aqp8 的mRNA 表达量增加了3.5 倍（P<0.05）；高剂量TUR 干预后Aqp3、Aqp4 和Aqp8 的mRNA 表达水平降低了69%、72% 和80%（P<0.01）。同时，与CON 组相比，LOP 组便秘小鼠结肠中Aqp9 的mRNA 表达量降低了82%（P<0.05），高剂量TUR 干预后Aqp9 的mRNA 表达水平增加了5.54 倍（P<0.01）。结果表明，松二糖能显著降低便秘小鼠中Aqp3、Aqp4、Aqp8 的过度表达，减少肠道水分的重吸收，同时上调Aqp9 的表达，增加了肠液的分泌，从而达到改善便秘的效果。
3 讨论与结论
慢传输型便秘是由于胃肠道传导功能失常引起的常见病症，该病的发病机制与肠道运动障碍、肠道水分代谢失调、肠道菌群等多种因素相关[17]，但确切机制尚不明确，任何环节紊乱均可能引发[18]。目前，常用缓解便秘的药物存在一定的副作用，长期使用会加重便秘程度。因此，与传统便秘药物相比，植物中的天然活性成分因无药物依赖性、相对安全性等优点备受关注，开发安全有效的天然新药物是控制慢传输型便秘亟待解决的问题。
蜂蜜中的糖类部分通过肠道细菌消化后产生有机酸，加快肠道蠕动，从而改善便秘症状[19]。松二糖作为蜂蜜中天然存在的二糖，具有低降解率，适用于代谢性疾病患者食用，这表明了松二糖作为蜂蜜的活性成分可能在蜂蜜通便的过程中发挥着重要作用。此外，有研究表明松二糖能通过调节促炎细胞因子来改善硫酸葡糖钠盐诱导的结肠炎小鼠的炎症反应[11]。本研究采用洛哌丁胺诱导便秘小鼠模型后，小鼠状态稳定，小鼠的肠道运动减弱，粪便质量和数量减轻，表明便秘模型建立成功。松二糖干预可显著缩短便秘小鼠的首粒黑便时间，提高小肠墨汁推进率，促进便秘小鼠的肠道运动，增加6 h 时粪便含水率、粪便数量和质量；此外，研究表明松二糖对小鼠饮食、体质量以及脏器指数均无较大影响，这表明了松二糖可能具有较好的安全性。
肠神经递质参与肠道的多种生理功能，在肠道运动和分泌中起到重要作用。人体95%的5-HT 是由胃肠黏膜层的肠嗜铬细胞分泌的，同时5-HT 作为兴奋性的肠神经递质，可与其受体结合，产生兴奋性蠕动信号[20]。此外，5-HT 还能与肠上皮细胞中的G 蛋白偶联受体结合，增加靶细胞中环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，促使肠道中氯离子和水分的分泌[21]。橙皮苷可以通过增加五羟色胺受体4（recombinant 5-hydroxytryptamine receptor 4，5-HTR4）来增强环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A，cAMP/PKA）通路相关蛋白，从而明显改善洛哌丁胺诱导的慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）大鼠模型的胃肠道传递功能[22]。本研究发现高剂量松二糖同样能显著上调便秘小鼠血清5-HT 的含量。
VIP 作为一种抑制性神经递质，可诱导肠道平滑肌松弛，抑制肠道蠕动[23]。同时VIP 也与其受体结合，增加cAMP 的水平，促使Na+和水分进入肠道，从而增加肠道液体的分泌。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是一氧化氮（nitric oxide，NO）合成的关键酶，其过度表达会使得结肠收缩处于持续抑制状态，导致肠道蠕动减缓[24]。比如，芍根总糖苷可以改善Cajal 间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）的功能，阻断NO、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、VIP 等抑制性神经递质，增加粪便量和含水量以及肠道转运率[25]。综上所述，5-HT 和VIP 均能通过上调cAMP 的表达水平，从而促使肠道中水分的增加。
水通道蛋白主要在肠道上皮细胞表达，在调节肠道水代谢的同时也能分泌黏液保护和润滑肠道[26]。目前为止，哺乳动物中发现的水通道蛋白共鉴定出13 种Aqps[27]，其中在便秘研究中具有典型代表的是Aqp3、Aqp4、Aqp8、Aqp9。Aqp3 主要在肠道黏膜上层细胞表达，可将肠腔内的水分转运至细胞间隙，加速水分子的转运，与便秘的发生有直接联系[28]，结肠上皮细胞中Aqp3 表达上调可导致严重便秘。Aqp4 主要位于隐窝细胞和上皮细胞的基底膜上[29]，其表达升高会加速结肠黏膜的水分吸收。Aqp8 近端空肠、近端结肠及直肠的吸收性上皮细胞中大量表达[30]。Aqp9 主要表达于黏膜杯状细胞，能促进黏液分泌、保护结肠黏膜，润滑肠道。研究发现，在便秘小鼠中肠神经递质和水通道蛋白的异常表达，促使肠道过度吸收水，导致便秘[31]。大黄素通过cAMP 依赖的蛋白激酶A-磷酸化结合蛋白信号通路调节水的转运和吸收，改变Aqp3 的表达，从而缓解便秘症状[32]。此外，水通道蛋白是VIP 的靶点[33]。洛哌丁胺诱导的便秘大鼠模型中发现结肠组织Aqp8 表达水平显著升高，而Aqp9 的表达显著下调，粪便含水率减少，排便困难。长期使用蒽醌类成分的泻药会导致Aqp8 在肠道内表达的减少[34]。这些现象与本研究结果基本一致。
在本研究中，LOP 组便秘小鼠血清中兴奋性神经递质5-HT 的表达下降，抑制性神经递质VIP 的表达增加，结肠中VIP 和iNOS 的mRNA 表达增加。这表明，松二糖可能通过调节便秘小鼠中神经递质相关因子的表达增加肠道平滑肌的收缩以加快肠道蠕动。此外，LOP 组便秘小鼠结肠组织中Aqp3、Aqp8 的mRNA表达显著上调，同时，Aqp4 的表达水平也上调，松二糖可能增强小鼠机体对水分的重吸收，导致肠道中水液代谢出现紊乱，Aqp9 的mRNA 表达下调可能会导致肠液分泌减少，进而引起便秘；但是高剂量松二糖干预有效地逆转便秘小鼠水通道蛋白的异常表达，增加粪便含水率，从而达到改善便秘的效果。综上所述，松二糖可能通过肠神经递质相关因子、水通道蛋白及其相互作用来调节便秘小鼠的胃肠运动和肠道水分代谢，从而温和有效地缓解洛哌丁胺诱导的慢传输型便秘。
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