巨大口蘑[Macrocybe gigantea（Massee）Pegler &Lodge]隶属于口蘑科（Tricholomataceae）、大杯伞属（Macrocybe），主要分布在非洲和亚洲的热带、亚热带地区，是一种珍稀高温型食用菌[1-2]，其子实体味道鲜美，脆而鲜甜，食用价值极高，鲜品、干品中均含有丰富的粗蛋白、粗纤维、多糖和多种人体必需矿物质元素，其含量均高于松茸和鸡枞菌[3]。巨大口蘑中还含有黄酮、三萜等多种活性物质，使其具有一定的生理功效，如抗肿瘤、抗氧化、抑菌、降血压和保肝等[4-5]。此外，前期对巨大口蘑培养及贮藏条件进行研究，发现巨大口蘑具有在8～12 ℃贮藏30 d 不变色、不变味的优良特性[6-7]。莫美华等[8]将巨大口蘑、双孢蘑菇和草菇在相同条件下贮藏，测定了褐变相关指标，发现巨大口蘑不易褐变与体内多酚氧化酶活性低有重要关联。
多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一类含铜蛋白酶，广泛存在于食用菌中，是食用菌酶促褐变的主要酶类[9-10]。绝大多数食用菌当受到外界胁迫时，PPO 会与氧发生接触，使得体内酚类物质被氧化成醌类物质，这些醌类物质进一步聚合产生黑色素从而导致食用菌褐变，严重影响了食用菌的外观、风味和运输[11-13]，但是巨大口蘑则与大多数食用菌不同，在机械损伤后，其切口在50 d 内都不会发生褐变[14]，所以对巨大口蘑PPO 特性进行研究具有重要意义。本文以巨大口蘑为原料，研究该酶的最适提取缓冲液、最适反应pH 值和反应温度及酶动力学等酶学特性，以期为巨大口蘑采后耐贮藏机理研究提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
巨大口蘑:广州市粤旺农业有限公司；磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠-磷酸二氢钠）、乙酸缓冲液（乙酸-乙酸钠）、柠檬酸缓冲液（磷酸氢二钠-柠檬酸）、邻苯二酚、抗坏血酸、柠檬酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硝酸银、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰（均为分析纯）:广州市齐云生物技术有限公司；石英砂、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl]缓冲液、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、硫酸锌、硫酸镁（均为分析纯）:广州化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
GL21 低温冷冻离心机:德国Eppendorf 公司；JB-2 磁力搅拌器:上海雷磁新泾仪器有限公司；UV754N 紫外可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司；DK-8D 电热恒温水浴锅:上海精宏实验设备有限公司；DELTA320 pH 计:瑞士METTLER TOLEDO公司。
1.3 试验方法
1.3.1 巨大口蘑PPO 的提取
参考吴英[15]的方法并稍做修改，称取50 g 巨大口蘑子实体于预冷的研钵中，加入少许石英砂和100 mL 20 mmol/L 不同的缓冲液，冰浴研磨成浆，4 ℃、8 000 r/min 离心10 min，所得上清液即为粗酶液。
1.3.2 最适提取缓冲液的筛选
分别用浓度为20 mmol/L、pH7.0 的不同缓冲液（磷酸盐缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、乙酸缓冲液和柠檬酸缓冲液）对巨大口蘑进行粗提，于相同条件下测定巨大口蘑PPO 活性，以最高酶活性为100%，计算PPO相对活性。
1.3.3 提取缓冲液最适pH 值的筛选
选取提取效果最佳的缓冲液，配制浓度相同（20 mmol/L）、pH 值不同（5.7、6.0、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5）的缓冲液对巨大口蘑进行粗提，于相同条件下测定巨大口蘑PPO 活性，以最高酶活性为100%，计算PPO 相对活性。
1.3.4 巨大口蘑PPO 活性的测定
采用邻苯二酚法测定巨大口蘑PPO 活性[16]，于试管中加入1.5 mL 0.1 mol/L 邻苯二酚底物和1.5 mL 20 mmol/L pH6.8 磷酸盐缓冲液，最后加入0.2 mL 粗酶液，测定420 nm 处1 min 内吸光值的变化，以每分钟吸光值改变0.01 为一个酶活性单位。
1.3.5 最适底物用量的筛选
分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8 mL 0.1 mol/L 邻苯二酚，通过改变磷酸盐缓冲液的用量使得终体积保持为3.0 mL，最后加入0.2 mL 粗酶液，测定420 nm 处吸光值变化。以最高酶活性为100%，计算PPO 相对活性。
1.3.6 酶促反应最适pH 值的筛选
以0.1 mol/L 邻苯二酚为底物，分别加入不同pH值（4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）的磷酸盐缓冲液和0.2 mL 粗酶液，于室温下测定巨大口蘑PPO 活性。以最高酶活性为100%，计算PPO 相对活性。
1.3.7 酶促反应最适温度的筛选
在试管中加入1.5 mL 20 mmol/L pH6.5 磷酸盐缓冲液、1.5 mL 0.1 mol/L 邻苯二酚和0.2 mL 粗酶液，分别于15、20、25、30、40、60、80 ℃下测定巨大口蘑PPO活性。以最高酶活性为100%，计算PPO 相对活性。
1.3.8 热稳定性的研究
将粗酶液分别放于20、30、40、50、60、70、80 ℃下保温30 min，并迅速置于冰上冷却，然后测定巨大口蘑PPO 活性。以最高酶活性为100%，计算PPO相对活性。
1.3.9 酸碱稳定性的研究
将粗酶液分别放于不同pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的磷酸盐缓冲液中，于最适温度下保温30 min，再测定巨大口蘑PPO 活性。以最高酶活性为100%，计算PPO 相对活性。
1.3.10 抑制剂及金属离子对PPO 活性的影响
用磷酸盐缓冲液分别配制不同浓度的EDTA-2Na、抗坏血酸、柠檬酸和含各种金属离子的盐溶液（K+、Na+、Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+），取上述溶液和粗酶液在最适温度和最适pH 值下温育30 min后，测定巨大口蘑PPO 活性。以最高酶活性为100%，计算PPO 相对活性。
1.3.11 酶动力学研究
以邻苯二酚为底物，改变底物浓度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L），在最适温度和最适pH 值条件下测定巨大口蘑PPO 在不同底物浓度下的活性变化，并按Lineweaver-Burk 作图，计算出米氏常数和最大反应速率。
1.4 数据分析
采用Microsoft Office Excel 2016 进行数据整理；采用GraphPad Prism 软件作图。
2 结果与分析
2.1 提取缓冲液种类对巨大口蘑PPO 活性的影响
不同的缓冲液含有的离子种类不同，pH 值大小也不一致，这些都会影响酶的蛋白构型，或者影响底物的解离程度，进而影响酶活性[17]。提取缓冲液种类对巨大口蘑PPO 活性的影响见图1。
图1 提取缓冲液种类对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.1 Effect of extraction buffer on PPO activity of Macrocybe gigantea
由图1 可知，在相同条件下分别以磷酸盐缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、乙酸缓冲液及柠檬酸缓冲液为提取缓冲液测定巨大口蘑PPO 活性，其中磷酸盐缓冲液的提取效果最好，与其他3 种缓冲液差异明显，故选择磷酸盐缓冲液为巨大口蘑PPO 的提取缓冲液。
2.2 提取缓冲液pH 值对巨大口蘑PPO 活性的影响
提取缓冲液pH 值对巨大口蘑PPO 活性的影响见图2。
图2 提取缓冲液pH 值对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.2 Effect of pH value of extraction buffer on PPO activity of M.gigantea
由图2 可知，随着pH 值的增加，PPO 相对活性呈先上升后下降的趋势。当pH 值在6.5～7.5 间，PPO 相对活性比较高，在pH 值为6.8 时达到最大，与其他pH值下测定的PPO 相对活性差异明显，因此提取缓冲液的最适pH 值即为6.8。此外，当提取缓冲液pH 值在5.7 或8.5 附近时，酶活性表现为最差，可能是过酸或者过碱的环境影响了酶蛋白的构象，使得酶自身失活。
2.3 底物用量对巨大口蘑PPO 活性的影响
底物用量对巨大口蘑PPO 活性的影响见图3。
图3 底物用量对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.3 Effect of substrate dosage on PPO activity of M.gigantea
由图3 可知，底物用量的改变对于巨大口蘑PPO活性的影响较大，PPO 相对活性随着底物用量的增加，呈先上升再下降趋势。当底物用量增长至1.5 mL 时，PPO 相对活性达到最大，比在0.2 mL 底物用量下测定的PPO 相对活性高77.55%，之后继续增加底物用量反而呈下降趋势，这与刘玉环等[18]在双孢蘑菇PPO 研究中发现底物浓度对PPO 活性的影响类似。原因可能是刚开始反应时底物用量少，不足以与巨大口蘑体内所有酶结合反应，当底物用量不断增大时，越来越多的酶可以与底物接触反应，直至达到饱和，此时再进一步增加底物用量，反而会抑制活性[19]。因此，最适底物用量为1.5 mL。
2.4 酶促反应pH 值对巨大口蘑PPO 活性的影响
不同酶的表面构象是不同的，其解离的pH 值范围也是不同的，发挥作用的pH 值区域也会有所差异[20]。酶促反应pH 值对巨大口蘑PPO 活性的影响见图4。
图4 酶促反应pH 值对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.4 Effect of pH value in enzymatic reaction on PPO activity of M.gigantea
由图4 可知，当pH 值从4.0 上升至5.5 时，PPO相对活性急剧上升，增长为pH4.0 时测定的PPO 相对活性的2 倍；当pH 值在5.5～6.0，PPO 相对活性则呈平缓上升，在pH 值为6.5 时达到最大，这与杨广等[21]对于蓝莓的最适pH 值的研究结果相类似；随着pH 值继续增加，PPO 相对活性反而呈下降趋势，可能因为PPO是属于含铜类酶，在强酸下铜离子会被解离出来，使得活性下降，而在强碱下铜离子会与氢氧根离子结合变成氢氧化铜，使得活性也呈下降趋势。因此，最适酶促反应pH 值为6.5。
2.5 酶促反应温度对巨大口蘑PPO 活性的影响
温度会影响酶与底物的结合程度，进而对酶的催化速度产生影响[22]。为研究巨大口蘑PPO 的最适反应温度，在相同条件下测定了不同温度的巨大口蘑PPO 活性，酶促反应温度对巨大口蘑PPO 活性的影响见图5。
图5 酶促反应温度对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.5 Effect of enzymatic reaction temperature on PPO activity of M.gigantea
由图5 可知，巨大口蘑PPO 相对活性随着反应温度的增加，呈先上升再下降的趋势，PPO 最适反应温度为30 ℃。在15～30 ℃，PPO 相对活性逐渐升高的原因是温度升高会促使酶的催化反应速率增加，而随着温度继续升高，相对活性开始呈下降趋势，到80 ℃时酶基本上失活，可能是温度过高使得酶的二级结构和三级结构出现断裂，进而活性降低。
2.6 巨大口蘑PPO 的热稳定性
温度对于PPO 活性影响较大。巨大口蘑PPO 的热稳定性结果见图6。
图6 巨大口蘑PPO 的热稳定性结果
Fig.6 Thermal stability of PPO from M.gigantea
由图6 可知，温度在20～30 ℃之间，巨大口蘑PPO相对活性可以保持在90% 以上，该温度范围内PPO相对活性比较稳定，且与40～80 ℃测定的PPO 相对活性差异明显；当温度上升至80 ℃时，PPO 相对活性下降至19.67%，比最适温度30 ℃下测定的PPO 相对活性降低了80.33%，这与黄志鸿等[23]对棘托竹荪PPO 耐热性的结果类似。
2.7 巨大口蘑PPO 的酸碱稳定性
巨大口蘑PPO 的酸碱稳定性结果见图7。
图7 巨大口蘑PPO 的酸碱稳定性结果
Fig.7 Acid-base stability of PPO from M.gigantea
由图7 可知，pH 值为3 时，PPO 相对活性仅为28.57%；当pH 值升至6～7 的中性条件时，PPO 相对活性均上升至90%以上，与其他pH 值下测定的PPO 相对活性差异明显；之后当pH 值过大（8～9）时，PPO 相对活性下降趋势明显，在pH 值为9 时PPO 相对活性已经降至8.96%，比在酸性条件和中性条件下都低，PPO 表现得更加不稳定，这说明碱性条件比酸性条件和中性条件对巨大口蘑PPO 活性的影响更大，这与何兴兴等[24]在双孢蘑菇PPO 特性的研究中发现pH 值变化对PPO 活性影响大结果相类似。
2.8 抑制剂及金属离子对巨大口蘑PPO 活性的影响
2.8.1 抑制剂对巨大口蘑PPO 活性的影响
抑制剂对巨大口蘑PPO 活性的影响见图8。
图8 抑制剂对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.8 Effect of inhibitors on PPO activity of M.gigantea
由图8 可知，3 种抑制剂对巨大口蘑PPO 相对活性均有抑制作用。低浓度EDTA-2Na（0～150 mmol/L）对巨大口蘑PPO 相对活性首先表现为微弱的促进作用，在浓度大于150 mmol/L 后则变成抑制作用，但当浓度增加至300～1 000 mmol/L 时，它们的抑制效果相差不大；不同浓度的抗坏血酸和柠檬酸对于巨大口蘑PPO 相对活性均表现为抑制作用，但抗坏血酸的抑制作用会比柠檬酸的抑制作用更强烈，在浓度为1 000 mmol/L 时PPO 已经完全失活，比柠檬酸对于巨大口蘑PPO 的抑制作用高9%，可能是抗坏血酸既可以作为一种还原剂，将酚类底物还原为醌类，又可作为一种螯合剂螯合铜离子，从而强烈抑制巨大口蘑PPO活性[25]。
2.8.2 金属离子对巨大口蘑PPO 活性的影响
将含不同浓度的金属离子盐溶液（K+、Na+、Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+）分别加入至粗酶液中，保温30 min 后于相同条件下测定巨大口蘑PPO 活性，金属离子对巨大口蘑PPO 活性的影响见图9。
图9 金属离子对巨大口蘑PPO 活性的影响
Fig.9 Effect of metal ions on PPO activity of M.gigantea
由图9 可知，不同的金属离子对于巨大口蘑PPO活性的影响作用不同。
首先发现Ag+、Zn2+、Mn2+、Mg2+和Cu2+对巨大口蘑PPO 相对活性的影响表现为低浓度时促进酶活，高浓度时抑制酶活的效果（图9a），可能是低浓度时金属离子可以作为酶的辅因子，促进酶与底物之间结合，高浓度时过多的金属离子则可以改变酶结构使得酶变性，进而抑制酶活性[26]。当金属离子浓度为0.1 mmol/L时，Zn2+对于巨大口蘑PPO 相对活性的促进作用最强，为157.3%，与其他金属离子对于PPO 相对活性的抑制率差异明显；当金属离子浓度为3.0 mmol/L 时，Ag+、Cu2+对于巨大口蘑PPO 相对活性的抑制作用最强，在17%左右，与其他金属离子对于PPO 相对活性的抑制率差异明显。
其次发现所有金属离子中只有Fe2+对巨大口蘑PPO 相对活性的影响在所使用的浓度范围均表现为促进效果（图9b），当Fe2+浓度升至1.0 mmol/L 时，PPO相对活性增长至200.68%，是未加Fe2+时测定的PPO相对活性的2 倍，随着Fe2+浓度继续升高，PPO 相对活性增长变得平缓，这与魏要武等[27]用硫酸亚铁处理巨大口蘑后得到的结果相类似。
最后发现K+、Na+、Ca2+对巨大口蘑PPO 活性的影响表现为抑制效果（图9c），其中Ca2+的抑制效果最强，与K+和Na+下测定的PPO 相对活性差异明显。当Ca2+浓度增长至3.0 mmol/L 时，比未加Ca2+测定的PPO 相对活性降低42%，可能是Ca2+可与PPO 活性位点的氨基酸残基结合，使得酶结构发生改变，影响了酶活性。其次是K+，最后是Na+，K+和Na+两者浓度在大于0.5 mmol/L 后，对于巨大口蘑PPO 相对活性的抑制作用均趋于平缓。
2.9 酶动力学的研究
米氏常数是酶催化反应中研究的一个重要数据，它反映了酶与底物间亲和力的大小，米氏常数值越小，说明酶与底物间的亲和力越大[28]。
酶动力学的研究结果见图10。
图10 巨大口蘑PPO 酶促反应的双倒数图
Fig.10 Double reciprocal plot of PPO enzymatic reaction of M.gigantea
根据图10，计算得到巨大口蘑PPO 的米氏常数为0.114 mol/L，最大反应速率为50.125 mmol/min。
3 结论
为了解巨大口蘑PPO 的酶学特性，对PPO 最适的提取条件、底物用量、反应pH 值、反应温度和化合物与金属离子对PPO 活性的抑制作用进行初步探索，发现pH6.8 磷酸盐缓冲液提取的PPO 相对活性最大，底物用量在1.5 mL 时PPO 相对活性最大，过高则会抑制酶活性。巨大口蘑PPO 最适反应pH 值是6.5，最适反应温度是30 ℃，稳定性结果表明巨大口蘑PPO 在高温下很不稳定，在偏酸或偏碱的环境下也不稳定，pH值和温度对于该酶的影响较大。此外在抑制试验中，发现Fe2+是唯一能促进PPO 相对活性的金属离子，K+、Na+、Ca2+等其他离子都会抑制PPO 相对活性。最后测定不同底物浓度下的PPO 活性，按Lineweaver-Burk 作图得出PPO 的米氏常数为0.114 mol/L。
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