聚苹果酸（poly malic acid，PMLA）是一种可生物降解的高分子聚合物，是由L-苹果酸通过酯键聚合而成。PMLA 由于其无免疫原性和良好的水溶性，可以作为药物载体提高难溶性药物的水溶性，从而进入人体发挥药效[1]。PMLA 也可以用于生产生物可降解的包装材料，如食品包装、医疗用品包装等。由于其可降解性，PMLA 可以取代塑料袋作为高分子材料投入生产中，能够降低对环境的污染。总的来说，PMLA 具有广泛的应用潜力，特别是在医药领域和生物可降解材料领域。目前，PMLA 主要是由微生物发酵法合成[2]，通过碳、氮源[3]和发酵条件[4]的优化来提高PMLA产量。
生长因子是微生物在发酵过程中所需的营养物质，不仅能促进微生物快速增殖，还能调节微生物的代谢途径。从广义概念上来说，生长因子包括维生素、复合氨基酸、碱基、嘌呤、嘧啶等，在工业发酵过程中，生长因子具有关键的作用，可以依据微生物的需求选择添加合适的生长因子。刘爽等[5]研究发现，维生素H能促进多形汉逊酵母的生长。陈胜等[6]发现外源添加吡哆醇不仅能够减缓鲁氏结合酵母的延滞期，还能提高鲁氏结合酵母的生物量。李长庚等[7]发现氯化胆碱能够提高大肠杆菌产L-酪氨酸的产量，降低副产物的生成。Huang 等[8]研究发现向培养基中加入胞嘧啶，能够使龟裂链轮丝菌生物合成米多霉素类似物。Borde等[9]研究发现在培养基中添加腺嘌呤提高了蛹虫草菌的虫草素产量。孙雨佳等[10]发现在培养基中添加腺嘌呤能够提高植物乳杆的活菌量。然而，目前尚未有研究表明生长因子对PMLA 合成有影响。
本文主要研究功能较为明确的胞嘧啶、腺嘌呤、维生素H、吡哆醇和氯化胆碱对PMLA 合成的影响，同时优化其适宜的添加浓度，进而借助蛋白质组学技术揭示其对PMLA 代谢调节的机制，以期为腺嘌呤提高聚苹果酸产量的合成机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
出芽短梗霉（Aurebasidium pullulans）:保藏于天津科技大学生化工程研究室，保藏号为CGMCC3337；蔗糖:广西糖业基团有限公司；酵母膏:奥博星生物有限公司；丁二酸铵:广东名图化工有限公司；碳酸钾、磷酸二氢钾:天津市大茂化学试剂厂；硫酸镁、氯化钾:维科特化工产品贸易有限公司；硫酸锌、碳酸钙:天津博迪化工股份有限公司；L-苹果酸:上海铼博生化科技有限公司。所有试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
SKY-2102 型恒温摇床:上海苏坤实业有限公司；UV-1200 型紫外分光光度计:上海元析仪器有限公司；JY92-IIN 细胞超声破碎仪:宁波新芝生物有限公司；08-F25 型四联发酵罐:镇江格瑞生物工程有限公司；GR22G 冷冻离心机:日本日立公司；SBA-40E 生物传感分析仪:山东省科学院生物研究所；5977B-7890B气相色谱质谱联用仪:德国安捷伦科技有限公司；LC-20A 高效液相色谱系统:日本岛津株式会社；Q-Exactive 质谱仪:美国Thermo Scientific 公司。
1.1.3 培养基
种子培养基:蔗糖60 g/L，酵母浸粉3 g/L，丁二酸铵2 g/L，玉米浆1.3 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，K2CO3 0.4 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，ZnSO4 0.05 g/L，CaCO3 20 g/L（单独灭菌），121 ℃灭菌20 min。
发酵培养基:蔗糖100 g/L，蛋白胨35 g/L，NaNO3 2 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4 0.3 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，MnSO4 0.05 g/L，CaCO3 20 g/L（单独灭菌），121 ℃灭菌20 min。
1.2 培养方法
1.2.1 种子培养
将保存于4 ℃冰箱的新鲜菌体斜面在25 ℃培养箱中活化1 h。在超净工作台中，用适量的生理盐水（无菌）将斜面上的菌丝洗下。按体积分数10%，取菌体混悬液接种到种子培养基中，放入25 ℃的恒温摇床中培养40 h，转速为200 r/min。
1.2.2 发酵培养
摇瓶发酵培养:将培养40 h 的种子液按体积分数10%，接种至发酵培养基中，25 ℃恒温摇床中培养144 h，转速为200 r/min。
发酵罐发酵培养:按体积分数10%，将种子液接种到装有3 L 发酵培养基的发酵罐中。发酵温度恒温25 ℃，通风比1∶1.2[m3/（m3·min）]，罐压0.02 MPa，转速为450 r/min，发酵时间144 h。
1.3 分析方法
1.3.1 残糖的测定
参照文献[11]的方法处理发酵液，按照下列公式计算发酵液中蔗糖含量。
式中:S 为发酵液中的蔗糖含量，g/L；G1 为酸水解前发酵上清液中葡萄糖的含量，g/L；G2 为酸水解后发酵上清液中葡萄糖的含量，g/L；342 为蔗糖的相对分子质量；180 为葡萄糖的相对分子质量。
1.3.2 细胞得率的测定
参照文献[12]的试验方法，按照下列公式计算细胞得率。
式中:YP/X 为细胞得率，%；PF 为发酵结束后PMLA含量，g/L；PI 为发酵开始时PMLA 含量，g/L；XF 为发酵结束时出芽短梗霉的菌体干重，g/L；XI 为发酵初始时出芽短梗霉干重，g/L。
1.3.3 PMLA 产量的测定
参照文献[13]的方法测定水解发酵液中PMLA，利用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法测定PMLA 含量。
HPLC 的检测条件:色谱柱J＆K Chemical C18（4.6 mm×150 mm）；柱温25 ℃；流速1.0 mL/min；进样量5µL；流动相V（25mmol/L KH2PO4溶液）∶V（乙腈）=95∶5（pH 值调至2.5）；检测停留时间10 min；紫外检测波长210 nm。
1.3.4 菌体量测定
取1 mL 发酵液加入适量的稀盐酸溶液除净碳酸钙，用去离子水稀释10 倍后混匀，用紫外分光光度计在波长600 nm 处测定发酵液吸光度，用OD600 值表征发酵液中菌体量。
1.4 蛋白质组学试验方法
取10 mL 发酵液，常温条件下4 000×g 离心1 min，除去碳酸钙沉淀，取上清液。12 000×g 离心10 min，收集菌体，使用磷酸盐缓冲液洗涤菌体3 次。在4 ℃条件下10 000×g 离心15 min，收集菌体。参照Xun 等[14]的方法制备样品，细胞超声破碎仪功率为80 W，超声开10 s，关15 s，重复超声10 次。将超声破碎后的样品100 ℃金 属 浴20 min，13 000×g 离 心30 min，取20µL 上清液用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行蛋白质定量，其余上清液分装后冷冻保存于-80 ℃冰箱中，用于后期蛋白质组学检测。
参照Zhou 等[15]的方法对肽段进行酶解脱盐，用质谱仪进行质谱分析。
1.5 数据分析
试验数据均为3 次试验的平均值，数据处理后由软件Origin 2022 作图，利用MaxQuant 软件（版本号1.5.3.17）对质谱数据进行查库鉴定。
2 结果与分析
2.1 生长因子对PMLA 合成的影响
2.1.1 生长因子对出芽短梗霉产PLMA 的影响
生长因子对PMLA 产量的影响见图1。
图1 生长因子对PMLA 产量的影响
Fig.1 Effect of growth factors on PMLA production
由图1 可知，添加0.5 g/L 的腺嘌呤对出芽短梗霉合成PMLA 的产量提高得最多，PMLA 的产量达到40.1 g/L，相较于空白组（30.2 g/L）提高了32.8%。其次是维生素H，在添加0.5 g/L 时其PMLA 产量为40.8 g/L，相比于空白组（35.7 g/L）提高了14.3%。这5 种生长因子均对PMLA 的合成起促进作用，腺嘌呤的最适添加量为0.5 g/L，维生素H 的最适添加量0.5 g/L，吡哆醇的最适添加量为0.2 g/L，氯化胆碱的最适添加量为0.4 g/L，胞嘧啶的最适添加量为0.5 g/L。因此，需要对这5 种生长因子进行再次筛选。
2.1.2 生长因子对出芽短梗霉细胞生长的影响
按照各生长因子最适添加量添加到培养基中，筛选出最适生长因子。不同生长因子对出芽短梗霉生长的影响见图2。
图2 不同生长因子对出芽短梗霉生长的影响
Fig.2 Effect of different growth factors on the growth of A.pullulans
由图2 可知，与空白组相比，腺嘌呤对出芽短梗霉细胞生长的促进作用最为明显，其次为胞嘧啶；吡哆醇、氯化胆碱对出芽短梗霉的细胞生长没有明显作用，维生素H 对细胞生长起到了轻微抑制作用。因此，确定腺嘌呤为最适生长因子。
2.1.3 腺嘌呤对PMLA 合成影响的发酵动力学分析
利用5 L 发酵罐从发酵动力学的角度探究腺嘌呤对出芽短梗霉合成PMLA 的影响。腺嘌呤对出芽短梗霉产PMLA 的影响见图3。
图3 腺嘌呤对出芽短梗霉产PMLA 的影响
Fig.3 Effect of adenine on PMLA production by A.pullulans
试验组为添加了0.5 g/L 腺嘌呤的培养基，空白组为基础发酵培养基。由图3 可知，发酵前期（0～36 h）空白组与试验组的细胞生长趋势和蔗糖消耗量趋势是相同的，但试验组消耗底物速率始终比空白组快。发酵至24 h 时试验组的PMLA 产量超过了空白组并且直至发酵结束时试验组合成PMLA 的速率均高于空白组。发酵至144 h 时试验组PMLA 的产量为39.3 g/L，空白组PMLA 产量为29.4 g/L，与空白组相比PMLA的产量提高了33.7%。通过对发酵液OD600、残糖量和PMLA 产量等指标的检测，结果表明，添加0.5 g/L 腺嘌呤后不仅提高了出芽短梗霉的生长速率，还提升了PMLA 的合成速率。因此，为深入研究腺嘌呤对出芽短梗霉合成PMLA 的机理，将通过蛋白质组学技术对发酵过程中产生的差异性蛋白进行分析。
2.2 腺嘌呤对PMLA 合成的作用机理的研究
2.2.1 差异表达蛋白质的定量及统计分析结果
按照差异倍数（fold change，FC）大于1.2 倍或小于0.833 倍筛选差异蛋白质，结果如表1 所示。
表1 差异蛋白统计结果
Table 1 Statistical results of differential proteins
比较组试验组vs 空白组差异蛋白质总个数398上调差异蛋白质个数202下调差异蛋白质个数196
由表1 可知，添加腺嘌呤后共引起出芽短梗霉发酵过程中398 个蛋白质表达量发生变化，其中有202 个蛋白质表达量上调，196 个蛋白质表达量下调。
2.2.2 差异表达蛋白质的功能富集分析
功能富集分析（gmene ontology，GO）能够通过生物过程、分子功能和细胞组分3 个方面描述生物体中基因和基因产物的属性[16]。所以按照差异蛋白质分析体系对检测到的差异蛋白质进行3 方面的功能富集。功能富集结果分别如图4～6 所示。
图4 差异蛋白质按生物过程GO 功能富集
Fig.4 GO functional enrichment of differential proteins by biological process
根据生物过程对差异蛋白质进行富集分类，由图4可知，试验组和空白组中的差异蛋白质主要影响了生物合成过程、碳水化合物代谢过程、细胞代谢过程、磷酸化反应、蛋白质水解和转运等过程。
差异蛋白质按照细胞组分进行GO 功能富集，由图5 可知，差异蛋白质主要定位于出芽短梗霉的膜组成部分、高尔基体相关囊泡膜、线粒体、内质网和细胞核等位置。
图5 差异蛋白质按细胞组分GO 功能富集
Fig.5 GO functional enrichment of differential proteins by cell component classification
由图6 可知，差异蛋白质的作用主要体现在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）结合、核苷酸结合、DNA 和RNA 结合，还影响了水解酶、氧化还原酶、转移酶等酶的活性。
图6 差异蛋白质按分子功能GO 功能富集
Fig.6 GO functional enrichment of differential proteins by molecular function classification
2.2.3 差异表达蛋白质的KEGG 通路分析
KEGG 通路分析是一种利用生物信息学技术来解析基因组、蛋白质组学等高通量生物学数据的方法。利用KEGG 数据库中的生物通路信息，可以了解生物体内不同分子间的相互作用，从而更好地理解生物学过程的调控机制。细胞内的代谢通路是由多个蛋白质协同作用共同组成的复杂网络，以此调控细胞内生化过程的有序进行。细胞中的生化过程中又涉及多条代谢途径，这些代谢途径相互作用以促进细胞有效地调控和执行维持细胞正常活动的生物学功能。通过对影响较大的前20 个代谢途径进行KEGG 通路分析，并绘制成图7。
图7 差异蛋白质KEGG 通路分析
Fig.7 KEGG pathway analysis of differential proteins
由图7 可知，差异蛋白主要作用于核糖体并影响了氧化磷酸化、嘌呤代谢和各种氨基酸代谢等过程。所以差异蛋白质参与的这些生物反应、引起的代谢途径变化，均有可能对出芽短梗霉对PMLA 的合成产生影响。
2.2.4 差异表达蛋白质的代谢途径分析
蛋白质组学的研究内容主要涵盖了蛋白质的定性定量、蛋白质的分子结构与翻译修饰过程以及蛋白质相互作用网络的构建[17]。差异蛋白质的代谢途径分析能通过生物信息学的方法研究蛋白质的相互作用网络，将注释后的差异表达蛋白质与代谢途径数据库进行关联，通过匹配蛋白质与已知的代谢途径相关的基因，可以确定这些差异表达蛋白质所涉及的代谢途径[18]。所以，为了解添加腺嘌呤对出芽短梗霉代谢途径的影响，对差异蛋白质进行代谢途径分析，结果见图8。
图8 腺嘌呤引起的差异蛋白对出芽短梗霉代谢途径的影响
Fig.8 Effect of differentially expressed proteins induced by adenine on the metabolic pathway of A.pullulans
添加腺嘌呤后影响了出芽短梗霉代谢途径中相关蛋白质的表达量，其中差异表达蛋白如表2 所示。
表2 代谢途径中的差异表达蛋白
Table 2 Differentially expressed proteins in metabolic pathways
蛋白质ID A0A1A7MNG7 A0A074XWV5 A0A074XKC2 A0A1A7MML1 A0A074XCF3 A0A074XDC4 A0A074XPW6 A0A1A7MSL0 A0A1A7MG97 A0A1A7MMW5蛋白质名称磷酸甘油酸激酶（EC:2.7.2.3）磷酸甘油酸变位酶（EC:5.4.2.1）苹果酸脱氢酶（EC:1.1.1.37）苹果酸酶（EC:1.1.1.40）NADH 脱氢酶（EC:1.6.5.3）泛醌-细胞色素c 还原酶（EC:1.10.2.2）磷酸核糖焦磷酸激酶（EC:2.7.6.1）半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶（EC:2.7.7.12）丙酮酸脱氢酶（EC:1.2.4.1）异柠檬酸脱氢酶（EC:1.1.1.42）表达量上调上调上调上调上调上调下调下调下调下调
由表2 可以得出有6 个表达量上调的差异表达蛋白和4 个表达量下调的差异表达蛋白。
磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）的主要功能是催化甘油与ATP 之间的磷酸化反应，是糖酵解途径中关键酶，能够使磷酸基从1，3-二磷酸甘油酯转化成3-磷酸甘油酯并伴随ATP 产生，磷酸甘油酸激酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱[19]。磷酸甘油酸变位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM）是参与生物体内甘油磷酸通路的关键酶之一，与PGK 不同，PGAM 催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。这一反应是甘油磷酸通路中的第二步，也是将3-磷酸甘油酸进一步代谢为丙酮酸的关键步骤之一。PGK 和PGAM 均是糖酵解过程中必不可少的关键酶，PGK 和PGAM 表达量的上调可以加快糖酵解代谢，推测添加腺嘌呤增强了出芽短梗霉的糖酵解途径，积累了胞内丙酮酸[20]，并进入丙酮酸羧化途径。核糖-5-磷酸是磷酸戊糖途径中的一个重要中间产物，也是核酸合成和其他生物合成过程中的关键中间产物之一。磷酸核糖焦磷酸激酶表达量的下调减弱了磷酸戊糖途径，积累核糖-5-磷酸含量，并使其更多地进入糖酵解途径。丙酮酸脱氢酶是葡萄糖代谢途径中必不可少的酶，能将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。此反应是葡萄糖有氧呼吸过程中的一个关键反应，它起到了连接糖酵解途径和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）的作用。异柠檬酸脱氢酶能够催化异柠檬酸脱碳产生α-酮戊二酸，这个反应是TCA 循环中的第一个产生能量的步骤。丙酮酸脱氢酶表达量的下调减弱了出芽短梗霉细胞的糖酵解途径与TCA 循环的连接，异柠檬酸脱氢酶表达量的下调减弱了TCA 循环，它们共同作用使出芽短梗霉细胞的代谢中产生的丙酮酸更多的进入丙酮酸羧化途径。增强丙酮酸羧化途径能够减少碳骨架流向其他途径，减少副产物的生成，为之后的提取降低难度[21]。丙酮酸通过苹果酸酶还原成苹果酸，草酰乙酸能被苹果酸脱氢酶还原成苹果酸[22]，苹果酸酶和苹果酸脱氢酶表达量的上调为PMLA 的合成积累了苹果酸。
半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶是乳糖代谢中的关键酶，能够催化半乳糖-1-磷酸转化成二磷酸尿苷葡糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）-半乳糖，该酶表达量的下调能够降低乳糖代谢效率，从而减少向UDPG的转化过程。UDPG 是普鲁兰多糖合成的前体物质[23]，而普鲁兰多糖是出芽短梗霉产PMLA 的副产物，所以减少UDPG 的生成，能够有效控制副产物的产生。综上，腺嘌呤可能是通过减弱乳糖代谢效率从而起到减少副产物的产生，进而达到了提高PMLA 产量的作用。
在糖类代谢中，葡萄糖、蔗糖等碳水化合物能通过糖酵解途径和TCA 循环氧化形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），简称还原型辅酶Ⅰ。蛋白质代谢中，蛋白质和脂类化合物分解形成氨基酸，氨基酸通过转氨作用产生α-酮酸，其中α-酮戊二酸进入TCA 循环，产生NADH。NADH是一种储存了高能电子的还原性辅酶，能通过线粒体内膜上的电子传递链，把高能电子被传递给电子载体，电子再传递给氧分子，与质子结合生成水[24]。NADH脱氢酶的主要功能是在细胞呼吸链的氧化磷酸化过程中将NADH 氧化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），简称氧化型辅酶Ⅰ，同时将释放的电子通过呼吸链传递到辅酶Q，并释放能量[25]。这种氧化磷酸过程产生的能量用于合成ATP，是维持生物体代谢活动所必需的。泛醌-细胞色素c 还原酶是呼吸链中的一种重要蛋白质复合物，它位于线粒体内膜上，作为电子传递链的一部分从NADH 或黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体（flavine adenine dinucleotide，FADH2）开始接收高能电子。在电子传递的过程中，泛醌-细胞色素c 还原酶还起到质子泵的作用，每次能将4 个质子从线粒体基质泵至内膜间隙，形成质子浓度梯度从而促进ATP 生成。泛醌-细胞色素c 还原酶能够维持细胞内能量代谢的正常进行，它在细胞内能量平衡和氧化磷酸化过程中发挥着重要作用。添加腺嘌呤后提高了TCA 循环中NADH 脱氢酶和泛醌-细胞色素c 的表达量，能够促进代谢过程中ATP 的生成，而出芽短梗霉合成PMLA 需要消耗能量，充足的能量能够有利于PMLA 的合成。
综上所述，腺嘌呤影响了代谢途径中的酶的表达量，在这些酶的共同作用下促进了出芽短梗霉合成PMLA。
3 结论
添加腺嘌呤后产生了大量差异蛋白质，这种变化可能对菌体生长和代谢通路等生物学过程产生影响。利用蛋白质组学技术对差异蛋白质进行检测并进行功能分析。研究发现，与空白组相比添加0.5 g/L 腺嘌呤后明显提升了PMLA 的产量，并产生了398 个差异性蛋白质，包括202 个上调蛋白和196 个下调蛋白。通过功能富集分析，差异蛋白质主要影响了细胞代谢过程、ATP 合成、膜的组成部分以及各种酶的活性；KEGG 通路分析发现差异蛋白主要作用于核糖体；通过对整体的代谢途径分析发现，这些差异蛋白影响了糖酵解、磷酸戊糖途径、氧化磷酸化、半乳糖代谢、TCA循环、丙酮酸羧化途径等多个代谢途径。半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶表达量的下调减少了副产物的生产；NADH 脱氢酶、细胞色素c 表达量的上调为出芽短梗霉合成PMLA 提供了充足能量；PGK 和PGAM 表达量的上调提高了糖酵解速率，积累了大量丙酮酸；表达量上调的苹果酸酶和苹果酸脱氢酶促进了丙酮酸生成PMLA。研究结果依据蛋白质组学技术，解释了腺嘌呤对合成PMLA 的作用机制，为进一步提高PMLA 的产量提供了新的方向。
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