我国是全球最大的猪肉生产和消费国,其中生鲜猪肉是我国肉类供应和消费的主要方向[1]。猪肉富含高品质蛋白质、脂肪和小分子矿物质,易受到环境影响。在运输和零售过程中,温度、湿度的波动以及贮藏期延长带来的猪肉品质劣变,是相关从业者和研究工作者关心的热点问题[2-3]。猪肉品质变化通常集中在两个方面:由猪肉持水性、色泽、气味、质构等指标表征的加工特性改变;由肌肉蛋白质、脂肪氧化和肌红蛋白成分改变带来的肌肉氧化特性变化。猪肉的加工特性与氧化特性关系紧密,研究表明,氧化会带来蛋白质构象、溶解度和功能特性(如凝胶和乳化性质)的改变,进一步导致猪肉持水性和质构特性的改变[4];氨基酸小分子会转化为羰基化合物、含硫化合物,猪肉中的多不饱和脂肪酸则会通过自由基机制与氧结合发生氧化,形成氢过氧化物,进一步氧化生成醛、酮等物质,影响冷鲜猪肉的气味感官[5-6];同时,脱氧肌红蛋白(deoxymyoglobin,DeoMb)自动氧化形成高铁肌红蛋白(methemoglobin,MetMb),氧 合 肌 红 蛋 白(oxymyoglobin,OxyMb)比例降低,进而导致肌肉色泽变暗[7-8]。
猪肉在冷藏过程通常伴随着加工特性与氧化特性的改变,许多研究对该过程中生鲜猪肉的持水性、质构特性以及常见的微生物和理化指标进行分析,但在猪肉氧化特性方面鲜有全面的探究,加工特性与氧化特性的联系尚未得到详细阐明。本研究对冷藏条件下猪肉的加工品质、氧化特性进行综合试验评价,以期为我国生鲜猪肉生产加工行业提供理论借鉴。
生鲜猪肉:市售;平板计数琼脂:广东环凯生物科技有限公司;2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA):上海麦克林生化科技股份有限公司;蛋白质羰基含量比色法测试盒、总巯基含量检测试剂盒:北京索莱宝科技有限公司。
UH5300 紫外-可见分光光度计:日本HITACHI 公司;SYNERGY H1 酶标仪:美国伯腾仪器有限公司;VELOCITY 14R 冷冻高速离心机:英国Dynamica 公司;T-18 高速分散均质机:德国IKA 集团;F98 荧光分光光度计:上海棱光技术有限公司;HH-2 数显恒温水浴锅:金坛市江南仪器厂;ZE7700 电色色差仪:日本电色工业株式会社;AL104 电子天平:美国METTLER TOLEDO 公司;T-Plus 质构仪:英国XT 公司。
1.3.1 样品制备
新鲜猪肉样品进行无菌分割,每块50 g,用密封袋包装后置于4 ℃冷藏处理,分别在第0、3、6、9、12 天取样进行各项指标的测定。
1.3.2 挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVBN)测定
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中的方法测定挥发性盐基氮(TVB-N)。
1.3.3 菌落总数测定
参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中的方法测定菌落总数。
1.3.4 蛋白质溶解度与肌原纤维小片化指数测定
蛋白质溶解度参考张佳伟等[9]的方法进行测定。称取1 g 切碎的猪肉与20 mL 碘化钾溶液[1.1 mol/L 溶解于0.1 mol/L 磷酸钾缓冲溶液(71.7 mL 1 mol/L K2HPO4和28.3 mL 1 mol/L KH2PO4 定容至1 L,pH7.2],低温状态下,高速分散均质机中均质3 次后搅拌提取2 h,离心(1 500×g,20 min)取上清液。上清液测定蛋白质浓度,结果表示为mg/g。
肌原纤维小片化指数参考赵立等[10]的方法,并略作修改。称取4 g 切碎的猪肉与40 mL 缓冲液[100 mmol/L KCl,20 mmol/L K2HPO4,1 mmol/L 乙二胺四 乙 酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)1 mmol/L MgCl2·6H2O,pH7.0]混合,高速分散均质机中均质3 次后离心(3 000×g,15 min),取沉淀与5 倍体积上述缓冲液混合搅拌混匀,过滤除去结缔组织、不溶性肌纤维等不溶物,测定蛋白质浓度。将溶液蛋白质浓度调整至0.5 mg/mL,在540 nm 处测量吸光度,将所得结果乘200 后得到肌原纤维小片化指数值。
1.3.5 色差值测定
使用电色色差仪测定猪肉的亮度L*值、红度a*值和黄度b*值。
1.3.6 猪肉持水性测定
贮藏损失率测定:猪肉样品原本质量记为M0(g)。在不同的贮藏时间节点取出样品,擦干表面水分,称重记为M1(g)。按照如下公式计算贮藏损失率(X,%)。
蒸煮损失率测定:取猪肉5 g 并擦干肉表面水分,称重记作M0(g),蒸煮锅预热至75 ℃后将猪肉块投入锅中,待肉块中心温度达到70 ℃后取出,擦干肉块表面水分进行称重记作M1(g),按照如下公式计算蒸煮损失率(X,%)。
1.3.7 质构特性和剪切力测定
参考张佳伟等[9]的方法测定质构特性:沿肌原纤维方向将样品切成1 cm×1 cm×1 cm 的正方体,使用带有探头(P/36R)的质构仪测定质构特性,探头以2 mm/s 的速度向下移动,设置形变量50%,触发力参数5 g。
剪切力测定:将样品切成3 cm×1 cm×1 cm 的长条状,使用刀片沿着样品肌肉纤维的垂直方向以2 mm/s 的速度向下切割。将获得的峰值力(N)记录为剪切力值。
1.3.8 TBARS 值、羰基值、巯基值测定
TBARS 值参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》中第二法进行测定。
羰基值、巯基值测定分别按照试剂盒说明书进行测定。
1.3.9 肌红蛋白组成、邵氏蛋白条带测定
肌红蛋白组成测定:取5 g 绞碎的样品,加入25 mL 磷酸盐缓冲液(40 mmol/L,pH6.8),混合均质处理,在3 000×g、4 ℃条件下离心30 min。随后用定量滤纸过滤上清液,弃去初滤液,用后续滤液分别在503、525、582 nm 和557 nm 处测定吸光度。肌红蛋白(X)、氧合肌红蛋白(Y)与高铁肌红蛋白比例(Z)计算公式如下。
式中:R1、R2、R3 为不同波长下吸光度的比值,R1=A582/A525;R2=A557/A525;R3=A503/A525。
邵氏蛋白条带测定:样品制备方式同上,方法参考剑菊等[11]并略作修改,肌红蛋白的卟啉环在紫外可见区域具有特征吸收峰。向狭缝比色皿中添加650µL 检测液,记录380~450 nm 的光谱数据,扫描间距为2.0 nm。
1.3.10 希夫碱、色氨酸测定
参考剑菊等[11]的研究方法,取1 g 绞碎的样品,与10 mL 磷酸缓冲溶液(20 mmol/L,pH6.5)混合均质,双层纱布过滤不溶物质,取1 mL 与20 mL 磷酸缓冲溶液(20 mmol/L,pH6.5)混合均匀。希夫碱激发波长在380 nm,发射波长在400~550 nm,435 nm 为最大波长;色氨酸采用固定激发波长与发射波长差值的方式进行测定,色氨酸固定差值为80 nm,284 nm 为最大吸收波长。以上吸光度均除以蛋白质浓度为系数。
使用IBM SPSS Statistics 22 中的ANOVA 方差分析和Duncan 多重检验(P<0.05)进行比较分析,图形绘制采用Origin 2022 软件,主成分分析(principal components analysis,PCA)采用SIMCA 软件分析和绘制。
2.1.1 生鲜猪肉贮藏过程中的基本理化指标分析
TVB-N 和菌落总数是生鲜肉品质和污染程度评价的重要指标,GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品》中规定鲜猪肉中的TVB-N 不得超过15 mg/100 g,GB/T 9959.2—2008《分割鲜、冻猪瘦肉》中规定新鲜猪肉中的菌落总数不得超过104 CFU/g。图1为生鲜猪肉贮藏过程中基本理化指标变化情况。
图1 生鲜猪肉在贮藏过程中的基本理化指标变化情况
Fig.1 Changes in basic physical and chemical indexes of fresh pork during storage
由图1A 可知,冷藏过程中生鲜猪肉的TVB-N 和菌落数量,随着贮藏时间的延长均有不同程度的增加,第3 天的猪肉菌落数量已经达到4.83 lg(CFU/g),超过相应标准中的限值,表明该阶段的猪肉已经不再新鲜,有研究指出生猪肉中菌落总数超过106 CFU/g 视为腐败[12-13]。从本研究结果来看,猪肉在第6 天的菌落数量达到5.63 lg(CFU/g),接近腐败限值,本研究中猪肉的TVB-N 在第6 天达到16.24 mg/100 g,超过标准规定的值。本研究与张鹏程等[14]的研究结果相近,TVBN 的增加表明在致腐微生物和内源酶作用下,猪肉中的小分子氨基酸经过氧化和微生物代谢转化为含氮碱性物质,当该项指标达到一定值后,猪肉会呈现较为明显的劣变气味感受。
蛋白质溶解度既是肌肉蛋白质重要的功能性质,也是肌肉品质评价的关键标志之一[15]。由图1B 可知,猪肉中的蛋白质溶解度总体呈现下降趋势,在试验时间终点达到133.32 mg/g,可能的原因是猪肉中可溶性蛋白质在贮藏过程中发生聚集或者随水分流失;而肌原纤维小片化指数反映猪肉组织中肌原纤维的降解程度,随着贮藏时间延长,该指标呈现上升趋势,在试验时间终点达到61.45,表明猪肉中结构蛋白的降解,一般表现为猪肉组织弹性下降、咀嚼性变差。此外,本研究中猪肉的蛋白质溶解度在贮藏前期(第3 天)有上升趋势,可能的原因是猪肉前期失水严重,相应的可溶性蛋白比例得以增加。
猪肉色泽通过L*值、a*值和b*值来体现,由图1C可知,a*值和b*值呈现相反的变化趋势,a*值体现猪肉色泽的红度,a*值降低则表明绿色比重增加,而b*值体现猪肉的黄度,b*值增加表明黄色比重增加,结果表明猪肉的色泽呈现出向绿色和黄色转化。贮藏损失和蒸煮损失分别反映了猪肉在生肉状态和熟肉状态下的持水能力,是猪肉品质评价的关键性指标[16-17]。图1D 中两项指标均呈现整体增加的趋势,表明猪肉的持水能力随贮藏时间延长而下降。此外,猪肉在贮藏前期(第3 天)贮藏损失率增加程度明显高于后期,表明猪肉贮藏前期失水程度高,如何做好生鲜猪肉前期保水工作十分重要。另外,猪肉蒸煮损失率在贮藏后期略微下降,可能的原因是猪肉自由水经过12 d 的贮藏已经基本流失尽,组织中稳定存在的结合水比例增加,因而导致蒸煮后的损失低于贮藏前期。
2.1.2 生鲜猪肉贮藏过程中的质构指标分析
表1 为生鲜猪肉在贮藏过程中的质构特性与剪切力变化。
表1 生鲜猪肉在贮藏过程中的质构特性与剪切力
Table 1 Texture characteristics and shear force of fresh pork during storage
贮藏时间/d 0 3 6 9 1 2硬度/g 3 157.56±21.68 2 468.17±33.46 2 548.31±40.14 2 660.33±19.47 2 425.89±22.84弹性/mm 0.62±0.01 0.73±0.01 0.70±0.06 0.58±0.07 0.49±0.04内聚性0.65±0.03 0.64±0.02 0.67±0.02 0.59±0.04 0.53±0.01咀嚼性/mJ 1 272.49±26.44 1 153.13±38.46 1 195.16±51.49 910.36±32.35 630.77±24.01剪切力/N 98.13±1.58 64.22±1.13 61.40±1.02 59.34±0.78 57.30±0.84
本研究中猪肉的质构特性与剪切力指标总体上随着贮藏时间的延长而降低,质构的变化与肌肉食物中肌原纤维的退化和收缩以及结缔组织的溶解有关[18-20],同时贮藏过程中的水分流失也能够影响质构特性,与前述的贮藏损失指标相对应。由表1 可知,硬度在不同贮藏阶段的变化存在波动,尤其是在第6 天时硬度有明显提升,达到2 548.31 g,第9 天硬度增加至2 660.33 g,而在第12 天降低至2 425.89 g,内聚性与咀嚼性的变化情况与硬度相似,可能的原因是贮藏前期(前6 d)水分过度流失,而后续第12 天时硬度下降,推测可能的原因是具有支架作用的肌原纤维蛋白发生降解。
生鲜猪肉在贮藏过程中会发生一系列生化反应,其中,具有氧化活性的酶以及部分金属离子能够在生物体内催化产生各种活性物质进而引起蛋白质和脂肪氧化,而氧化会影响肌肉组织的持水性、色泽、质构等加工品质,因此氧化特性分析对于贮藏过程中的生鲜猪肉综合品质评估十分关键[21-22]。图2 展现了生鲜猪肉的氧化特性指标变化情况。
图2 生鲜猪肉在贮藏过程中的氧化指标
Fig.2 Oxidation indexes of fresh pork during storage
TBARS 值是表征猪肉中脂肪氧化产物丙二醛的指标,由图2A 可知,该值随着贮藏时间的延长而升高,在第12 天达到0.3 mg MDA/kg;羰基含量表征了猪肉中脂肪和蛋白质氧化产物羰基化合物的含量,该项指标与TBARS 值变化情况一致,在第12 天达到2.95 nmol/mg;该研究猪肉中巯基含量随着贮藏时间延长逐渐降低,在第12 天降低至79.89 nmol/mg,构成肌原纤维蛋白的肌球蛋白和肌动蛋白中的巯基会随着贮藏时间的延长不断发生氧化反应,导致巯基含量不断减少[23-24]。本研究中的TBARS 值、羰基含量和巯基含量均随着贮藏时间的延长而改变,其中TBARS 值在第3 天呈现显著增长现象,该发现可能有助于生鲜猪肉氧化劣变的科学抑制方法开发。图2B 与图2D 反映了肌红蛋白的组成与结构变化,猪肉组织中肌红蛋白通常有DeoMb、MetMb 和OxyMb 3 种氧化状态,DeoMb、MetMb 与OxyMb 分别呈现紫红色、褐色与亮红色,3 种肌红蛋白形式的相互转化促成肌肉色泽的转变[25]。OxyMb 随着贮藏时间延长逐渐降低,MetMb 随着贮藏时间延长而整体增加,两者的变化解释了上述研究中猪肉色泽的劣变情况。图2D 是肌红蛋白的紫外光谱图,在邵氏带的吸收峰是由卟啉环共振体系的π-π*跃迁产生的,吸收峰的变化(包括峰强和位置)可以反映出卟啉环中心铁离子的价态和第六配位键与不同分子的结合情况[25-26]。本研究中不同贮藏阶段肌红蛋白的紫外光谱图发生明显变化,在后续贮藏阶段,邵氏蛋白条带的特征峰发生红移且峰强发生明显降低,表明肌红蛋白的氧化情况发生变化。
希夫碱是肌原纤维蛋白质糖基化过程中的产物[22],图2C 中希夫碱含量随着贮藏时间延长逐渐增加,与上述羰基含量变化趋势一致,另外,希夫碱能够进一步通过缩合反应生成醛类物质[22],而醛类物质是肉品腐败后呈现异味的主要物质,因此希夫碱含量的增加为肉品异味的产生提供了分子基础。在肌肉内部微环境中,疏水作用是维持蛋白质三级结构最重要的作用力,随着蛋白质氧化程度加深,蛋白质中疏水基团展开进而导致疏水性氨基酸色氨酸荧光猝灭[22,27],因此芳香族氨基酸色氨酸的变化情况可以反映出蛋白质三级结构的改变,本研究中色氨酸含量随着贮藏时间延长而降低,进一步表明猪肉蛋白质的三级结构发生变化。
PCA 是数学分析中一种常见的数据降维方法,多个数据变量通过降维后可以得到新的变量,通过新的变量可以更直观地分析研究目的[28-30]。图3 为猪肉品质指标主成分分析。
图3 猪肉品质指标主成分分析
Fig.3 PCA of pork quality index
由图3 可知,PCA 将猪肉在不同贮藏阶段的基本理化指标与氧化特性指标做了降维处理,得到两个新变量PC1 与PC2,分别包含了本研究86.70%和8.02%的数据信息,表明该分析较为合理。图中五角星代表样本点,不同贮藏阶段的猪肉样本点在图中位置区分明显,其中D6(第6 天)位于图中央位置,表明从第6 天开始,猪肉品质发生较大的劣变,第6 天可以作为猪肉贮藏的关键时间节点。图中各项指标点分布于两侧,较为明显地反映出新鲜猪肉与贮藏后期猪肉的品质差异。综上所述,PCA 分析对猪肉贮藏阶段进行了合理区分,并确定了猪肉贮藏中品质劣变的关键时间点。
本研究以生鲜猪肉为对象,探究了生鲜猪肉在冷藏过程中的加工品质与氧化特性变化规律。试验结果表明,猪肉在贮藏过程中的品质呈现下降趋势,突出表现在持水性下降、组织质构特性降低、色泽变差;氧化程度随着贮藏时间延长而加深,氧合肌红蛋白含量下降、蛋白质和脂肪氧化产物增加,肌肉蛋白质结构发生变化,疏水性基团展开,同时氧化程度指标能够解释加工品质指标的变化;第6 天前后品质指标差异较大,第6 天可以作为猪肉冷藏过程中品质控制的关键时间节点。综上所述,猪肉冷藏过程猪肉加工品质与氧化特性的变化规律有助于加深相关从业人员的理论认识,为猪肉贮藏保鲜技术开发提供理论指导。
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