咖啡（Coffea）起源于非洲,生长在埃塞俄比亚的卡法地区,在17世纪初荷兰人将其传播到整个欧洲和北美,1825年传到了中南美洲,咖啡是世界上出口仅次于石油的第二大商品[1-2]。咖啡属于茜草科,咖啡属,该属有124 个种,阿拉比卡咖啡（C.arabica.）、刚果咖啡（C.canephora）和利比亚咖啡（C.liberica）是最具商业价值的3 个种[3]。我国咖啡主要分布于云南、海南、广西等地,其中云南地区的咖啡种植面积最大、产量最高[4]。咖啡果是咖啡豆的副产物,咖啡果中含有花青素、绿原酸、咖啡酸、咖啡因等多种生物活性物质[5-7],因此,咖啡果具有消炎、止痛、抗氧化等功效[8-11]。
将咖啡果加工成果酒,可提高其附加值,可将咖啡果变废为宝。酵母菌是果酒酿造过程中主要的微生物类群,非酿酒酵母菌能分泌糖苷酶类,在代谢过程中能产生酯类、醇类等香气物质,影响酒体品质[12]。尹雪林等[13]用戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii SY-2-2）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae RV002）单菌和混菌酿制猕猴桃酒,戴尔有孢圆酵母的参与提高了猕猴桃酒中苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、苯乙醇、β-大马士酮、α-松油醇、桉树油醇等挥发性物质的种类和含量,丰富了猕猴桃酒的香气成分。张曼等[14]分别采用葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、东方伊萨酵母（Issatchenkio orientalis）与商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae D254）混合发酵脆红李酒,结果表明,混合发酵更适合应用于脆红李酒酿造,有利于增加香气复杂性,提升品质。郑淑丹等[15]采用柠檬形克勒克酵母和酿酒酵母混合发酵,以及其单独发酵的方式进行脐橙全果酒的酿造,采用混合发酵的方式,使风味物质得到改善,所得脐橙全果酒香气更浓郁。张文文等[16]采用东方伊萨酵母（Issatchenkio orientalis）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行纯种和混菌发酵杨梅酒,结果表明,混菌发酵与纯种发酵相似度高,但减少了纯酿酒酵母发酵产生的辛酸及正癸酸这2 种不良气味,减少量分别达到0.020 mg/L和0.053 mg/L；东方伊萨酵母的参与使发酵液中丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、3-壬烯酸乙酯等乙酯类、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯类含量分别提高了18.52%和57.34%,增加了杨梅酒的果香味。本研究以咖啡果发酵液为原料,采用形态观察和分子生物学方法鉴定酵母菌,并通过测定产酯、产乙醇、产硫化氢、产气能力,结合菌株嗜杀性、耐受性筛选优良酵母菌,以期为咖啡果果酒酿造提供优质酵母资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
咖啡果：云南普洱金树咖啡产业有限公司；沃勒斯坦实验室营养琼脂鉴别（wallerstein laboratory,WL）培养基：青岛日水生物技术有限公司；赖氨酸培养基、铋亚硫酸盐葡萄糖甘氨酸酵母琼脂（bismuth sulfite glucose glycine yeast,BIGGY）：青岛科技工业园海博生物技术有限公司；NL1、NL4引物：昆明擎科生物科技有限公司；菌株S.cerevisiae NX11424 ：西北农林科技大学惠赠；2×Taq PCR MasterMix：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；葡萄糖、无水乙醇、甘油、焦亚硫酸钾、三丁酸甘油酯、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂（均为分析纯）：昆明品美科技有限公司。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose,YPD）培养基：酵母浸粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L,pH自然,121 ℃灭菌15 min。
YPD固体培养基：酵母浸粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂20 g/L,pH自然,121 ℃灭菌15 min。
酵母浸出粉胨葡萄糖-最小葡糖苷酶（yeast extract peptone dextrose minimal dextrase,YEPD-MB）培养基：葡萄糖20 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,亚甲基蓝0.03 g/L,琼脂20 g/L,pH自然,121 ℃灭菌15 min。
麦芽汁固体培养基：麦芽汁10 g/L,琼脂20 g/L,pH自然,115 ℃灭菌15 min。
TTC上层培养基：TTC 0.5 g/L,葡萄糖0.5 g/L,琼脂15 g/L,煮沸2 min。
TTC下层培养基：MgSO4 0.4 g/L,KH2PO4 1 g/L,酵母浸粉1.5 g/L,蛋白胨2 g/L,葡萄糖10 g/L,琼脂20 g/L,调节pH值至5.5,121 ℃高压灭菌15 min。
YPD产酯筛选培养基：蛋白胨20 g/L,酵母浸粉10 g/L,葡萄糖20 g/L,三丁酸甘油酯4 g/L,琼脂20 g/L,121 ℃高压灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
PHX-280H生化培养箱：宁波莱福科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；PB-10 pH计：赛多利斯科学仪器有限公司；UV755B可见紫外分光光度计：上海分析仪器总厂；CP114电子天平：美国奥豪斯仪器；TG16-WS台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Veriti96-Well聚合酶链式反应仪（polymerase chain reaction,PCR）、WD-9413B凝胶成像仪：伯乐生命医学有限公司；XW-80A漩涡混合器：上海驰唐电子有限公司；YXQ-100G立式压力蒸气灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；PowerPacTM HC十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）：美国BIO-RAD公司；ZD-85AB多功能冷冻气浴恒温振荡器：常州润华电器有限公司；P70D20TL-D4微波炉：广东格兰仕微波生活电器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理
取约100 g咖啡果破碎后置于已灭菌的500 mL锥形瓶中摇匀,28 ℃培养箱中自然发酵至发酵液出现大量气泡时,将发酵液用纱布过滤,备用。
1.3.2 酵母菌的分离纯化
用移液枪吸取1 mL发酵液进行梯度稀释,依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,用移液枪吸取200 μL菌液涂布在含有抗生素（制霉菌素100 mg/L、氯霉素100 mg/L）的YPD固体培养基上,每个稀释梯度平行涂布3 个平板,28 ℃恒温培养箱培养48 h。挑取YPD固体培养基中不同形态、不同大小的菌落在YPD固体培养基上进行划线,在28 ℃恒温培养箱中培养24 h,经多次划线纯化得到单一菌落。
1.3.3 酵母菌的初筛
将分离纯化的酵母菌株,接种于YPD液体培养基,活化24 h后接种到WL培养基28 ℃培养5 d后观察并记录菌落颜色与形态,并制水浸片于显微镜下观察,记录酵母菌的无性繁殖方式及细胞形状,并进行分析和初步的归类。
1.3.4 酵母菌的二级筛选
采用杜氏管发酵法[17],将菌种活化扩大培养后,以2%的接种量接种到装有10 mL YPD液体培养基的试管中,然后放入杜氏小管,置入杜氏小管时确保杜氏小管内无气泡。静置于培养箱中30 ℃培养,每12 h观察产气情况,记录杜氏管内的气泡高度。根据试验结果,筛选出发酵性能好、起酵快、生长旺盛的菌株。
1.3.5 酵母菌产酯、产乙醇、产H2S能力及嗜杀性测定
取5 μL的菌悬液点样于产酯培养基,28 ℃下培养4 d后,观察并记录显色情况。接种5 μL的菌悬液点样于TTC下层培养基,28 ℃培养至酵母长势良好后,覆盖TTC上层培养基。28 ℃避光培养24 h后,观察并记录显色情况。
取10 μL浓度为107 CFU/mL的各供试菌株的菌液滴加至BIGGY培养基表面上的无菌滤纸片上,液体完全吸收后,28 ℃倒置培养5 d,观察滤纸片变色情况。菌株产硫化氢能力由高到低,显色情况分别为显棕黑色、棕色、墨绿色、淡墨绿色及不显色。
将敏感菌株S.cerevisiae NX11424 1296 涂布在YEPD-MB培养基上（涂布前浓度稀释至107 CFU/mL）,接种8 μL待测试菌株到YEPD-MB鉴定培养基中,25 ℃培养48 h。若待测菌为嗜杀菌株,则嗜杀性菌株被一个明确的区域包围,其周围会形成蓝色的死菌带和透明的抑菌圈。
1.3.6 酵母菌的耐受性分析
参照刘晓柱等[18]的方法,稍作修改,对酵母菌进行耐受性测试。以YPD培养基为基础培养基,分别添加不同质量浓度（60、180、300、360 mg/L）的SO2（以H2SO3形式添加）,在不同pH值（2.5、3.0、3.5、4.0）、不同葡萄糖浓度（200、300、400 g/L）、不同温度（4、15、25、35、40 ℃）、不同乙醇体积分数（3%、9%、15%、20%）下,发酵48 h后,在600 nm下测定其OD值,以商业酵母（andante,ADT）为对照。
1.3.7 酵母菌的分子生物学鉴定
在25 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min,分离上清液,收集菌体。采用微波炉法提取酵母菌基因组DNA作为模板[19]。以NL1（5′ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3′）和NL4（5′ GGTCCGTGTTTCAAGACGG3′）为引物扩增26S rDNA D1/D2区。送至昆明硕擎生物科技有限公司测序,将测定的基因序列与NCBI数据库中的已知序列进行同源比对,采用MEGA X软件构建系统发育树,分析该菌株的分类地位[20]。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0软件进行数据分析处理,方差分析采用Duncan检验法（P<0.05）,每组试验3 个重复。采用Graphpad Prism 9.1软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的形态鉴定
通过筛选培养基共分离到109株酵母菌,将分离纯化后的酵母菌涂布于WL培养基进行形态观察和显微镜镜检,经去重后获得27株形态不同的酵母菌,其细胞形态和菌落形态如表1所示。
表1 酵母菌的菌落形态和细胞形态特征
Table 1 Morphological characteristics of colonies and cells of yeast strains
菌株编号WRJ-1菌落形态形态描述细胞学形态images/BZ_212_1390_2287_1579_2476.pngimages/BZ_212_1885_2287_2074_2476.png形态描述及繁殖方式球形,裂殖WRJ-3images/BZ_212_1390_2502_1579_2691.pngimages/BZ_212_1885_2502_2074_2691.png球形,裂殖WRJ-4images/BZ_212_1390_2716_1579_2905.pngimages/BZ_212_1885_2716_2074_2905.png球形,裂殖WRJ-6images/BZ_212_1390_2930_1579_3119.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层浅绿色,中心层白色光滑状最外层深绿色边,外层浅绿色,内层透明光滑,中心浅绿色突起外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层淡黄色,中心淡绿色褶皱外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层浅绿色,中心淡黄色火山状突起images/BZ_212_1885_2930_2074_3119.png球形,裂殖
续表1 酵母菌的菌落形态和细胞形态特征
Continue table 1 Morphological characteristics of colonies and cells of yeast strains
菌株编号WRJ-7菌落形态形态描述细胞学形态images/BZ_213_390_625_579_814.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层白色小圆环状突起,中心浅绿色images/BZ_213_885_625_1074_814.png形态描述及繁殖方式椭圆形,裂殖WRJ-9images/BZ_213_390_846_579_1035.pngimages/BZ_213_885_846_1074_1035.png椭圆形,芽殖WRJ-10images/BZ_213_390_1089_579_1278.png最外层火山状白色毛边,有颗粒感,外层淡绿色,内层绿色圆环状褶皱,中心绿色光滑外层火山状白色毛边,内层白色圆环状突起,中心奶油色光滑images/BZ_213_885_1089_1074_1278.png球形,裂殖WRJ-11images/BZ_213_390_1310_579_1499.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层奶油色小圆环突起,中心淡绿色images/BZ_213_885_1310_1074_1499.png椭圆形,裂殖WRJ-12images/BZ_213_390_1531_579_1720.pngimages/BZ_213_885_1531_1074_1720.png椭圆形,裂殖WRJ-14images/BZ_213_390_1774_579_1963.png最外层火山状白色毛边,有颗粒感,外层淡绿色,内层奶油色褶皱状突起,中心白色外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层蓝绿色圆饼状突起,粗糙images/BZ_213_885_1774_1074_1963.png球形,裂殖WRJ-23images/BZ_213_390_1995_579_2184.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层奶油色,中心层白色光滑状images/BZ_213_885_1995_1074_2184.png椭圆形,芽殖WRJ-24images/BZ_213_390_2216_579_2405.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层奶油色小圆环突起,中心白色images/BZ_213_885_2216_1074_2405.png椭圆形,芽殖WRJ-26images/BZ_213_390_2437_579_2626.pngimages/BZ_213_885_2437_1074_2626.png椭圆形,芽殖WRJ-27images/BZ_213_390_2680_579_2870.pngimages/BZ_213_885_2680_1074_2870.png椭圆形,芽殖WRJ-28images/BZ_213_390_2924_579_3113.png最外层白色毛边,外层淡绿色环状突起,内层淡绿色光滑,中心浅绿色饼状突起,粗糙最外层火山状白色毛边,有颗粒感,外层奶油色,内层浅绿色小圆环突起,中心淡绿色外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层浅绿色小圆环突起,中心淡绿色images/BZ_213_885_2924_1074_3113.png椭圆形,裂殖
续表1 酵母菌的菌落形态和细胞形态特征
Continue table 1 Morphological characteristics of colonies and cells of yeast strains
菌株编号WRJ-29菌落形态形态描述细胞学形态images/BZ_213_1435_625_1624_814.pngimages/BZ_213_1930_625_2119_814.png形态描述及繁殖方式球形,芽殖WRJ-33images/BZ_213_1435_836_1624_1025.pngimages/BZ_213_1930_836_2119_1025.png球形,裂殖WRJ-34images/BZ_213_1435_1065_1624_1254.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层奶油色小圆环突起,中心白色最外层火山状白色毛边,有颗粒感,外层浅绿色,内层淡绿色褶皱状突起,中心淡绿色外层白色边,内层奶油色,中心浅绿色突起images/BZ_213_1930_1065_2119_1254.png球形,裂殖WRJ-35images/BZ_213_1435_1273_1624_1462.pngimages/BZ_213_1930_1273_2119_1462.png椭圆形,裂殖WRJ-19images/BZ_213_1435_1481_1624_1670.png外层火山状白色毛边,有颗粒感,内层浅绿色,中心层奶油色光滑状菌体为奶油色images/BZ_213_1930_1481_2119_1670.png球形,芽殖WRJ-20images/BZ_213_1435_1689_1624_1878.pngimages/BZ_213_1930_1689_2119_1878.png球形,芽殖WRJ-31images/BZ_213_1435_1897_1624_2086.png最外层白色边,外层奶油色,内层浅绿色,中心淡绿色突起外层白色毛边,内层奶油色花边,中心白色光滑images/BZ_213_1930_1897_2119_2086.png球形,裂殖WRJ-32images/BZ_213_1435_2105_1624_2294.png外层白色毛边,内层白色圆环状,中心奶油色光滑images/BZ_213_1930_2105_2119_2294.png球形,芽殖WRJ-22images/BZ_213_1435_2313_1624_2502.png外层奶油色,内层绿色,中心翠绿色突起images/BZ_213_1930_2313_2119_2502.png球形,芽殖WRJ-30images/BZ_213_1435_2521_1624_2710.png外层白色毛边,内层蓝色images/BZ_213_1930_2521_2119_2710.png椭圆形,芽殖WRJ-36images/BZ_213_1435_2729_1624_2918.png外层奶油色,内层浅绿色,中心翠绿色突起images/BZ_213_1930_2731_2119_2918.png球形,裂殖WRJ-37images/BZ_213_1435_2937_1624_3126.png最外层透明,外层深绿色,内层绿色,中心翠绿色突起images/BZ_213_1930_2937_2119_3126.png球形,裂殖
由表1可知,27株酵母菌菌落形态外层主要是毛边、奶油色、白色或绿色,部分中心具有颗粒感。细胞形态主要是球形和椭圆形,繁殖方式以裂殖和芽殖为主。
2.2 酵母菌发酵性能
酵母菌产气能力如表2所示。
表2 酵母菌产气能力
Table 2 Gas production of yeast strains
注：-、+、++、+++分别表示不产气、产气达到杜氏小管体积的1/3、2/3、全部。
菌株编号WRJ-1 WRJ-3 WRJ-4 WRJ-6 WRJ-7 WRJ-9 WRJ-10 WRJ-11 WRJ-12 WRJ-14 WRJ-23 WRJ-24 WRJ-26 WRJ-27 24 h 24 h------+-+--+--48 h++++++++++++++++++++++++++++++72 h++++++++++++++++++++++++++++++++++沉淀情况白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀菌株编号WRJ-28 WRJ-29 WRJ-33 WRJ-34 WRJ-35 WRJ-19 WRJ-20 WRJ-31 WRJ-32 WRJ-22 WRJ-30 WRJ-36 WRJ-37-----+--++---48 h+++++++++++++++++++++++++72 h+++++++++++++++++++++++++++沉淀情况白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色紧实沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色紧实沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀白色疏松沉淀
由表2可知,27株酵母菌产气能力,其中7株酵母菌（WRJ-7、WRJ-9、WRJ-12、WRJ-14、WRJ-23、WRJ-34、WRJ-22）48 h就将杜氏小管产满气体,72 h后27株菌均能产气。27株酵母菌菌体主要呈白色疏松沉淀和白色紧实沉淀。
2.3 酵母菌产H2S能力
部分酵母菌可能会产生臭鸡蛋味的H2S,造成果酒不良风味[21]。果酒酿造过程中,酵母菌可经过硫酸盐还原途径产生H2S,H2S本身具有臭鸡蛋味,大量积累H2S会影响果酒品质。通过酵母菌在BIGGY琼脂培养基上显色情况可检测其产H2S能力,菌体在平板上颜色越深说明H2S产量越多,根据酵母菌显色深浅判断H2S产量的高低。酵母菌产H2S能力如图1所示。
图1 酵母菌产H2S能力
Fig.1 H2S production of yeast strains
由图1可知,菌株WRJ-35、WRJ-34、WRJ-20、WRJ-31、WRJ-37、WRJ-36不产H2S,其余菌株高产H2S。
2.4 酵母菌嗜杀性
酵母菌嗜杀性可以抑制腐败微生物的生长,在果酒酿造过程中可以降低杂菌污染,对果酒品质具有重要影响[22]。在YEPD-MB培养基中添加次甲基蓝溶液,具有嗜杀性的酵母菌其周围会形成抑菌圈和蓝色死菌带。酵母菌周围形成的抑菌圈或死菌带越大说明嗜杀能力越强,根据其直径大小判断酵母菌的嗜杀能力。酵母菌的嗜杀性如图2所示。
图2 酵母菌的嗜杀能力
Fig.2 Killer activities of yeast strains
由图2可知,27株酵母菌有5株菌具有嗜杀性,其中菌株WRJ-34、WRJ-26具有较强的嗜杀性,菌株WRJ-37、WRJ-29、WRJ-27嗜杀性较弱。
2.5 酵母菌的产酯能力
酯类物质是果酒酿造过程中酵母菌产生的主要风味物质。酵母菌产生的酯酶能分解产酯筛选培养基中的三丁酸甘油酯进而出现透明圈。酵母菌周围形成的透明圈越大说明产酯能力越高,通过透明圈的大小判定酵母菌产酯量的高低[23]。酵母菌的产酯能力如图3所示。
图3 酵母菌的产酯能力
Fig.3 Lipid production of yeast strains
由图3可知,27株酵母菌具有产酯能力,其中WRJ-32透明圈最大,产酯能力最强,有6株酵母菌（WRJ-37、WRJ-30、WRJ-22、WRJ-10、WRJ-7、WRJ-11）产酯能力较弱。
2.6 酵母菌产乙醇能力
酵母菌显色越深说明产乙醇能力越高,根据酵母菌在TTC培养基上显色深浅判断酵母菌产乙醇能力[24]。酵母菌的产乙醇能力如图4所示。
图4 酵母菌的产乙醇能力
Fig.4 Ethanol production of yeast strains
由图4可知,有7 株酵母菌（WRJ-10、WRJ-12、WRJ-11、WRJ-7、WRJ-1、WRJ-24、WRJ-23）在TTC培养基上呈深红色,说明产乙醇能力较强,有14 株酵母菌呈红色,产乙醇能力一般,还有6 株酵母菌呈白色,说明不产乙醇。
2.7 酵母菌耐受性
根据酵母菌形态特征、产气性能、产酯能力、产乙醇能力、产H2S能力及嗜杀性,从27 株酵母菌筛选出3 株（WRJ-20、WRJ-34、WRJ-37）优良酵母菌进行后续试验,以商业酵母菌（alcohol active dry yeast,ADT）为对照。
2.7.1 酵母的温度耐受性
在果酒酿造过程中,温度的变化会影响酵母菌的生长及酒精发酵,进而影响果酒品质,不同的酵母菌具有不同的适应温度[21]。酵母菌的温度耐受性如图5所示。
图5 酵母菌的温度耐受性
Fig.5 Thermal stability of yeast strains
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图5可知,4 ℃条件下,4 株酵母菌生长能力较弱,35 ℃条件下,4 株酵母菌OD600值均超过1.0,生长较好；当温度达到40 ℃时,WRJ-34与商业酵母生长良好,说明菌株WRJ-34具有较好的温度耐受性。
2.7.2 酵母的低pH值耐受性
pH值是影响果酒品质和酵母生长的重要因素,果酒酿造环境偏酸性,且可抑制有害微生物的生长[25]。因此,筛选具有耐低pH值的酵母菌是酿造果酒的关键技术。酵母菌的pH值耐受性如图6所示。
图6 酵母菌的pH耐受性
Fig.6 pH tolerance of yeast strains
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图6可知,4 株菌随着pH值的降低耐受能力整体逐渐减弱。当pH2.5时,菌株WRJ-37和商业酵母均可正常生长（OD600>0.5）；当pH值为3.0～3.5时,4 株菌均可正常生长（OD600>1.0）；当pH值为4.0时,WRJ-20、WRJ-34和商业酵母均可正常生长（OD600>1.0）。
2.7.3 酵母的葡萄糖耐受性
葡萄糖是酵母菌生长的能源物质,但是高浓度的葡萄糖会抑制酵母菌的生长,且会引起细胞失水,导致活性降低[21]。因此,果酒酿造过程中优良酵母菌应具有较高的葡萄糖耐受性。酵母菌的葡萄糖耐受性如图7所示。
图7 酵母菌的葡萄糖耐受性
Fig.7 Glucose tolerance of yeast strains
由图7可知,4 株酵母菌均能耐受400 g/L葡萄糖浓度（OD600>0.5）,说明3 株酵母菌与商业酵母比较对葡萄糖均具有较高的耐受性,符合优良酵母菌的特性。
2.7.4 酵母的SO2耐受性
在果酒酿造过程中,适量添加SO2可抑制有害微生物且具有护色的作用[26]。酵母菌的SO2耐受性如图8所示。
图8 酵母菌的SO2耐受性
Fig.8 SO2 tolerance of yeast strains
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图8可知,在SO2浓度为60～180 g/L时,4 株菌均能正常生长（OD600>1.0）；当SO2浓度达到300～400 g/L时,对菌株WRJ-37有一定的抑制作用,其中菌株WRJ-20的SO2耐受性最好。
2.7.5 酵母的乙醇耐受性
果酒酿造过程中会产生大量乙醇,高浓度乙醇环境会影响酵母菌的生长[27]。因此,优良酵母菌必须具备高浓度乙醇耐受性。酵母菌的乙醇耐受性如图9所示。
图9 酵母菌的乙醇耐受性
Fig.9 Ethanol tolerance of yeast strains
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图9可知,乙醇浓度为3%时,菌株WRJ-20的乙醇耐受性最好（OD600>1.5）；当乙醇浓度为9%时,菌株WRJ-20、WRJ-37的乙醇耐受性较好；当乙醇浓度达到15%～20%时,4 株菌均不能正常生长；相对而言,菌株WRJ-20均有较好的乙醇耐受性。
2.8 酵母菌的分子生物学鉴定
3株酵母菌经PCR扩增和测序,用软件MEGA构建系统发育树,结果见图10。
图10 基于26S rDNA序列系统发育树
Fig.10 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA sequences
由图10可知,WRJ-20与异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的同源性较高,WRJ-37与泽普林假丝酵母（Starmerella bacillaris）的同源性较高,WRJ-37与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性较高。在NCBI数据库上经同源序列比对确认WRJ-20属于Wickerhamomyces anomalus,WRJ-37属于Starmerella bacillaris,WRJ-34属于Saccharomyces cerevisiae。
3 结论
本研究从咖啡果发酵液中分离纯化获得本土酵母菌,并研究其发酵特性。经形态鉴定获得27 株酵母菌,并探究酵母菌的产气能力、产乙醇能力、产酯能力、产H2S能力及嗜杀性,筛选得到3 株优良酵母菌（WRJ-20、WRJ-34、WRJ-37）。通过与商业酵母菌比较耐受性发现,当温度达到40 ℃时,WRJ-34还能正常生长具有较好的温度耐受性；当pH值为3.0～3.5时,4 株菌均可正常生长,具有较好的pH耐受性；3 株酵母菌均能耐受400 g/L葡萄糖浓度,均具有较高的葡萄糖耐受性；菌株WRJ-20的SO2耐受性最好；菌株WRJ-20有较好的乙醇耐受性。经分子生物学鉴定,WRJ-20为Wickerhamomyces anomalus,WRJ-34为Starmerella bacillaris,WRJ-37为Saccharomyces cerevisiae。综上所述,从咖啡果发酵液中筛选获得的3 株酵母菌具有良好的发酵性能、耐受性、嗜杀性等酿造学特性,为咖啡果果酒酿造提供优良酵母资源。
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