随着社会的进步和人们消费水平的提高,肉与肉制品的需求量逐年增长,然而肉类产品,特别是牛肉、羊肉等市场的食品安全风险隐患仍然存在,因此建立肉与肉制品源性成分鉴别方法,有利于保护消费者利益,维护肉类市场秩序。
传统的检测方法主要是对感官指标包括肉类的纹理、色泽和味道等进行综合评价,虽然能在一定程度上鉴别肉制品掺假,但仍然存在着明显的缺陷,尤其是熟肉制品,很难鉴别其掺假种类。因此研究并建立新的动物源性成分鉴别方法至关重要。氨基酸是构成蛋白质的基本单位,是生物体内不可缺少的营养成分之一。由于物种的特异性,不同物种具有不同的氨基酸模式,现利用氨基酸模式进行食品成分掺假分析是进行食品安全评价的一种崭新尝试,该方法准确、快捷,已成功应用于牛奶蛋白掺假分析[1],但在肉类源性成分鉴别中研究甚少。
主成分分析是目前较为常见的多指标品质评价和判定方法[2-5],已被广泛应用于食品品质评价与鉴别[6-8]。主成分概念最早于1901年由Karl Parson提出,用于对非随机变量的分析；1933年,Hotelling对其进行了发展,推广到随机变量的分析[9]。该方法通过利用少量的综合指标的重要信息,代替原来多个指标的大部分信息,缩小变量指标范围,从而解释多维样品之间的差异,这些少数变量彼此相互独立,且与原始变量之间呈线性组合[10]。近年来,在苹果[11]、葡萄[12]、石榴[13]、黄皮[14]、猕猴桃[15]和枇杷[16]等水果以及谷子[17]、食用菌[18]、红薯[19]和黄花菜[20]等农作物品质综合评价中得到广泛应用,在畜禽肉品质评价和鉴别方面也有相关研究,张燕等[21]通过主成分分析和聚类分析研究了青海地区藏羊11 个不同部位肉的质构特性和品质差异,为藏羊肉品质评价和深加工提供了理论支撑。邵坚等[22]对不同产地乌骨鸡肉氨基酸含量进行了差异分析,通过主成分分析法评价了乌骨鸡营养价值。可见,该方法在畜禽肉来源、产地等方面的鉴别具有一定的可行性。
本研究以市售合格的生鲜鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉、羊肉为试验材料,烘干后磨成粉状,利用氨基酸分析仪分别测定不同动物肉样16 种氨基酸含量,建立其氨基酸模式,结合主成分分析和判别分析,建立6 种畜禽肉动物源性鉴别方法,以期为畜禽肉真假以及掺假鉴别提供理论支持,为完善肉制品安全体系提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
新鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉各10份：市售,充分搅匀至肉糜状,备用。
17 种氨基酸混合标准液（2.5 μmol/mL）：美国Sigma公司；盐酸、柠檬酸三钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（优级纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 试验仪器与设备
L-8900型氨基酸自动分析仪：日本日立公司；9246A电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；VORTEX-6旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备
分别取适量6 种动物肉糜,于45 ℃电热鼓风干燥箱中烘干5～6 h,制成风干样品,研磨成粉状,水解后测定氨基酸含量。
分别取适量6 种动物粉状风干样品,置于101～105 ℃电热鼓风干燥箱,烘干至恒重[23],制成绝干基础样品,也称绝干样品。
1.3.2 风干样品氨基酸含量测定
氨基酸含量参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[24]中的方法进行测定。16 种氨基酸分别为天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）。
1.3.3 绝干样品氨基酸含量测定
绝干样品氨基酸含量计算公式如下。
式中：Y为绝干样品氨基酸含量,g/100 g；C为风干样品氨基酸含量,g/100 g；M为样品干物质率,%。样品干物质率计算公式如下。
式中：M为样品干物质率,%；m1为风干样品烘干后质量,g；m2为风干样品烘干前质量,g。
1.4 数据处理
采用Excel软件处理,采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。采用one-way analysis of variance进行显著性检验；采用Factor进行主成分分析,以累积贡献率≥85%作为入选的主成分,采用Discriminant进行样本判别分析。
2 结果与分析
2.1 6 种动物绝干样品氨基酸含量测定分析
6 种动物绝干样品16 种氨基酸含量测定结果见表1。
表1 6 种动物绝干样品16 种氨基酸含量和变异系数
Table 1 Content and coefficient of variation of 16 amino acids in 6 animal absolute dried samples g/100 g
氨基酸种类鸡肉鸭肉鹅肉猪肉牛肉羊肉6 种动物氨基酸平均值6 种动物变异系数氨基酸种类鸡肉鸭肉鹅肉猪肉牛肉羊肉6 种动物氨基酸平均值6 种动物变异系数Asp 7.92 7.92 7.02 7.77 8.08 7.66 7.73 4.86 Ile 3.99 4.07 3.67 3.92 4.04 3.91 3.93 3.65 Thr 4.10 4.27 3.82 4.17 4.25 4.12 4.12 3.95 Leu 6.97 7.16 6.62 6.81 7.19 6.96 6.95 3.09 Ser 3.25 3.37 3.39 3.22 3.35 3.18 3.29 2.67 Tyr 3.04 3.28 2.87 3.07 3.18 3.04 3.08 4.53 Glu 13.03 13.60 12.74 13.44 14.07 13.29 13.36 3.46 Phe 4.09 3.81 3.61 3.89 3.89 3.79 3.85 4.09 Ala 3.97 3.98 4.12 3.75 4.71 4.15 4.11 7.90 Lys 7.65 7.75 7.05 7.43 7.62 7.50 7.50 3.30 Gly 4.21 4.36 3.99 4.18 4.50 4.28 4.25 4.07 His 3.13 2.56 2.33 3.12 3.02 2.62 2.80 12.08 Val 3.89 3.94 3.90 3.89 3.97 3.88 3.91 0.91 Arg 5.61 5.78 5.31 5.57 5.81 5.50 5.60 3.31 Met 2.23 2.16 1.90 2.24 2.28 2.05 2.14 6.72 Pro 3.59 3.97 3.72 4.08 4.28 4.13 3.96 6.59
由表1可知,6 种动物样品16 种氨基酸含量变异系数由大到小分别为His> Ala> Met> Pro> Asp> Tyr>Phe> Gly> Thr> Ile> Glu> Arg> Lys> Leu> Ser> Val,变异系数越大,说明数据的离散程度越高。本研究中选择变异系数相对较大的指标进行主成分分析。
2.2 主成分分析
对6 种动物16 种氨基酸含量进行主成分分析,各主成分的特征值、贡献率以及主成分的特征向量值见表2和表3。
表2 相关系数矩阵特征值和累积贡献率
Table 2 Correlation coefficient matrix eigenvalues and cumulative contribution rates
主成分1 2 3特征值10.278 3.003 1.211贡献率/%64.240 18.768 7.567累积贡献率/%64.240 83.008 90.575
表3 3 个主成分特征向量值
Table 3 Eigenvector values of three principal components
指标Asp Thr Ser Glu Ala Gly Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Pro特征向量值第1主成分0.969 0.960-0.058 0.897 0.358 0.946 0.646 0.867 0.965 0.941 0.905 0.603 0.905 0.577 0.978-0.557第2主成分-0.238 0.078 0.766 0.309 0.661 0.239 0.686-0.362-0.147 0.167 0.151-0.705-0.218-0.626 0.103 0.378第3主成分0.022-0.071 0.568-0.269-0.224-0.133 0.188-0.012 0.153 0.116 0.179 0.175 0.227-0.149 0.171-0.710
由表2可知,前3 个主成分累积可以解释全部变异的90.575%,其中第1、2、3主成分分别解释总变异的64.240%、18.768%和7.567%。根据累积贡献率达85%以上,即信息损失量在15%以下的原则,在选取3 个特征值后,累积贡献率就达到90.575%,故将前3 个特征值分别定义为第1、第2和第3主成分。
由表3可知,第l主成分与Arg、Asp等14 种氨基酸呈正相关,与Ser和Pro呈负相关,主要反映了Arg、Asp、Ile、Thr、Gly、Leu、Tyr和Lys等氨基酸的信息,其中Arg的贡献最大,特征向量值为0.978；其次为Asp,特征向量值为0.969；Pro的贡献最小,特征向量值为-0.557。第2主成分与Ser、Val等10 种氨基酸呈正相关,与Phe、His等其余氨基酸呈负相关,其中Ser的贡献最大,特征向量值为0.766；Phe的贡献最小,特征向量值为-0.705。第3主成分与Ser、Lys等9 种氨基酸均呈正相关,与Pro、Glu等其余氨基酸呈负相关,其中Ser的贡献最大,特征向量值为0.568；Pro的贡献最小,特征向量值为-0.710。
主成分分析是利用“降维”思想在尽可能保留原有信息的前提下找到几个综合因子来代表原来众多的变量,这些综合因子彼此之间互不相关[25]。而特征向量即主成分载荷,反映了各指标对主成分载荷的相对大小和作用方向[26],一般情况下特征向量值越大,其贡献率也就最大。目前,利用氨基酸含量进行主成分分析评价品种质量已有相关研究,颜孙安等[12]通过主成分分析和聚类分析成功比较了31 种葡萄间的氨基酸含量差异。杨林等[18]分析了西藏林芝地区5 种野生食用菌氨基酸含量,通过主成分分析法构建了不同品种食用菌综合评价模型。刘伟等[20]分析了湖南主栽的10 个黄花菜品种游离氨基酸含量差异,通过主成分分析和聚类分析准确评价了不同品种游离氨基酸综合质量。本研究中,前3 个主成分累积贡献率达90.575%,包含了所有的16 个氨基酸组成指标,因此前3 个主成分所反映的信息完全可代替已有的信息,可以有效地用于系统分析。
2.3 6 种动物肉样绝干样品氨基酸模式比较分析
结合主成分分析以及6 种动物肉样绝干样品氨基酸含量变异系数情况,选择Asp、Thr、Ala、Gly、Met、Tyr进行氨基酸模式分析,以表1中含量相对较少的Met为1,分别计算Asp、Thr、Ala、Gly、Tyr含量与Met含量的比值,即为氨基酸模式,以Met∶Asp∶Thr∶Ala∶Gly∶Tyr的比值表示,具体见表4。
表4 6 种动物绝干样品简洁氨基酸模式
Table 4 Simplied amino acid patterns of 6 animal absolute dried samples
样品鸡肉鸭肉鹅肉猪肉牛肉羊肉指标Met 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Asp 3.55 3.67 3.69 3.47 3.54 3.74 Thr 1.84 1.98 2.01 1.86 1.86 2.01 Ala 1.78 1.84 2.17 1.67 2.07 2.02 Gly 1.89 2.02 2.10 1.87 1.97 2.09 Tyr 1.36 1.52 1.51 1.37 1.39 1.48
由表4可知,不同动物样品Met∶Asp∶Thr∶Ala∶Gly∶Tyr的比值均不一样,其中鸡肉为 1.00∶3.55∶1.84∶1.78∶1.89∶1.36,鸭肉为1.00∶3.67∶1.98∶1.84∶2.02∶1.52,鹅肉为1.00∶3.69∶2.01∶2.17∶2.10∶1.51,猪肉为1.00∶3.47∶1.86∶1.67∶1.87∶1.37,牛肉为1.00∶3.54∶1.86∶2.07∶1.97∶1.39,羊肉为1.00∶3.74∶2.01∶2.02∶2.09∶1.48。本研究结果显示,6 种动物均具有其独特的氨基酸模式,可以用于肉类成分源性区分。
2.4 判别分析
利用典型判别函数对鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉、羊肉6 种动物样品进行判别分析,结果见表5和表6。
表5 典型判别函数特征值
Table 5 Typical discriminant function eigenvalues
函数1 2 3特征值427.78 52.06 37.85方差百分比/%79.5 9.7 7.0累积百分比/%79.5 89.2 96.2典型相关系数0.999 0.991 0.987
表6 判别函数显著性检验
Table 6 Discriminant function significance test
函数检验1 2 Wilks′ lambda 0.000 0.000卡方检验256.53 171.67自由度80 60 P值0.000 0.000
由表5可知,此次分析有3 个判别函数,其中第1 个判别函数特征值为427.78,解释了79.5%的方差,第2 个判别函数解释了9.7%的方差,前两个判别函数的贡献达到了89.2%,典型相关系数为0.991,可以用于判别分析。
Wilks′ lambda是组内平方和与总平方和之比,当所有观测的组均值相等时,Wilks′lambda值为1；当组内变异与总变异相比越小时,Wilks′lambda值接近于0。Wilks′lambda值越小,表示组间差异越大,在判别分析中,只有各组均值不等时,判别分析才有意义。由表6可知,对判别函数进行Wilks′lambda假设检验,Wilks′ lambda值为0,说明利用判别函数1和2对6 种动物样品进行判别分析是可行的。第1判别函数和第2判别函数概率P值均为0.000,小于显著性水平0.05,说明判别函数有效,具有显著的差异和判别力。
判别分析属于监督类分析方法,其基本原理是按照一定的判别准则,确定分类变量与其他多元变量之间的数量关系,建立一个或多个判别函数,并利用此函数构建二元判别图进行样品判别分析,同时该方法还可以对其他未知分组样品进行判别分析。目前判别分析技术已被广泛应用于物种来源区分,在畜禽肉不同部位来源方面也有相关研究,洪晶等[8]综合评价了肃南牦牛4 个不同部位肉品质差异,研究显示通过判别分析能有效区分不同部位的肉。本研究对鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉、羊肉6 种动物样品进行判别分析,结果见图1。
图1 6 种动物样品判别分析图
Fig.1 Discriminant analysis of 6 animal samples
1～6分别为牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉。
由图1可知,6 种动物样品分别集中在不同的区域,彼此之间差异明显,很容易辨别,可见判别分析可以较好地用于畜禽肉源性成分鉴别。
3 结论
本研究对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉6 种动物样品16 种氨基酸含量进行测定比较,并对其进行主成分分析和判别分析。结果表明,将16 个氨基酸指标简化为3 个主成分,3 个主成分累积贡献率达到90.575%。结合主成分分析和6 种动物肉样绝干样品氨基酸含量变异系数情况,构建了基于Met∶Asp∶Thr∶Ala∶Gly∶Tyr比值的鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉和羊肉氨基酸简洁模式。判别分析显示6 种动物肉样的典型判别函数1和2解释了89.2% 的方差,相关性达到0.991,利用判别函数1和2对鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉和羊肉6 种动物样品进行判别是可行的,可以用于畜禽肉源性成分鉴别。
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