桑葚（Fructus Mori）又称桑果、桑子、桑枣,是桑科植物桑树（Morus alba）的果穗,广泛种植于亚洲、欧洲、北美洲等地[1]。我国桑树种质资源丰富,种类占全球的80%,但仍有很多野生品种尚未登录[2],果用桑开发利用程度较低。
桑葚既可鲜食,也可入药,在1988年被卫生部列入首批药食同源名单[3]。桑葚不仅富含蛋白质、氨基酸、脂肪、碳水化合物等基础营养成分,而且富含多酚、生物碱、多糖、活性肽等多种活性物质[4-6],在治疗糖尿病、降血糖、降血脂、免疫调节、抗炎抗肿瘤等方面效果明显[7-9]。目前桑葚研究主要集中在营养活性测定、药理药效研究及多元化开发利用[10-11]。
桑葚果香味浓郁、口感酸甜适中,受到消费者的青睐,但由于桑葚季节性强、采摘期短,鲜果易受霉菌侵染而出现大量腐败变质,且不耐压,因此不易于储藏和运输。为减少鲜果损耗浪费和经济损失,许多学者结合大众喜好,已研制开发出多种桑葚相关加工产品,有桑葚干、桑葚果脯、桑葚果汁、桑葚膏、桑葚醋、桑葚酒等[12]。
目前桑葚酒研究多集中于酿造工艺优化、活性代谢物测定,而不同品种酿造所得桑葚酒品质风味研究较少[13-14]。因此,本试验选择云南省蒙自市两种常见品种和两种特色培育品种进行桑葚酒酿造,测定4 种桑葚酒的理化指标、活性成分及抗氧化性,以感官评分为考察指标,筛选出接受度较高的桑葚酒,并进行理化、活性与感官、抗氧化性之间的相关性分析,以期为高值化开发利用桑葚新品种、酿制风味口感俱佳的桑葚酒提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚品种云桑2号、珍珠白、红粉佳人、黑美人：采自云南省农业科学院桑蚕蜜蜂研究所蚕桑科技示范园；白砂糖（食品级）：市售；酵母、偏重亚硫酸钾、皂土：烟台帝伯仕自酿有限公司；果胶酶（3万U/g）：河南万邦化工科技有限公司；总黄酮测定试剂盒、总多酚测定试剂盒、多糖测定试剂盒、生物碱测定试剂盒、DPPH试剂盒、羟自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司；总多糖测定试剂盒：北京盒子生工科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
玻璃发酵罐：徐州戎剑玻璃制品公司；PB40X2-701A破壁机：美的集团有限公司；糖度计：日本ATAGO株氏会社；HH-6恒温水浴锅：常州市亿能实验仪器厂；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；V-5600可见分光光度计：上海元析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑葚酒酿造工艺流程
桑葚鲜果→榨汁→加入果胶酶→静置过滤→加入SO2→调整初始糖度→接种活化酵母→室温发酵→加入皂土→静置过滤→陈酿→加入SO2→桑葚酒。
操作要点：摘取无病虫害、无腐败变质的桑果进行榨汁。榨汁过程中加入果胶酶20 mg/L增加出汁率及营养物质溶出量。静置后过滤,加入70 mg/L偏重亚硫酸钾进行杀菌护色处理,加入白砂糖调整初始含糖量为18%（质量体积分数）。取活化后的酵母按200 mg/L添加至果汁中,室温条件（18～28 ℃）下发酵。发酵10 d后,底部不再产生小气泡,发酵液逐渐澄清,抽取上清液后加入400 mg/L皂土静置过滤,室温陈酿30 d,加入70 mg/L偏重亚硫酸钾二次杀菌,获得桑葚酒。
1.3.2 样品前处理
将4 个桑葚品种按照1.3.1工艺流程进行桑葚酒酿造,并命名为云桑2号桑葚酒（Y2）、黑美人桑葚酒（HM）、红粉佳人桑葚酒（HF）、珍珠白桑葚酒（ZJ）。
1.3.3 桑葚酒理化指标测定
酒精度、干浸出物含量、总酸（以酒石酸计）含量、挥发酸（以乙酸计）含量、总SO2含量参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定[15]；总糖含量、还原糖含量采用总多糖测定试剂盒（苯酚-硫酸法）进行测定。
1.3.4 桑葚酒活性成分测定
总多酚含量、总黄酮含量、生物碱含量均按照试剂盒说明书操作进行测定。
花色苷测定参考高雨寒等[16]的方法并做修改,桑葚酒8 000 r/min、离心10 min,取Y2上清液分别用pH1.0的缓冲溶液（0.2 mol/L KCl-0.2 mol/L HCl,体积比25∶67混合）和pH4.5的缓冲溶液（0.2 mol/L NaAc-0.2 mol/L HAc,体积比1∶1混合）稀释至20倍体积；取ZJ、HF、HM上清液分别用pH1.0的缓冲溶液和pH4.5的缓冲溶液稀释至2倍体积,测定520 nm和 700 nm下吸光值,分别用A520 nm和A700 nm表示,以矢车菊素-3-葡萄糖苷计,按下式计算桑葚酒花色苷含量（C,mg/L）。
式中：ΔA为桑葚酒的总吸光值；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量,449.2 g/mol；N为稀释倍数；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷消光系数,26 900 L/（mol·cm）；L为光程,1.0 cm。
1.3.5 桑葚酒抗氧化性测定
DPPH·清除率、羟自由基清除率、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）均采用试剂盒方法测定。
1.3.6 桑葚酒感官综合评价
挑选10位从事食品研究人员组成评判小组,分别从视觉、嗅觉、味觉、接受喜好度（0～5）进行感官综合评价。视觉从酒体色泽纯正度（0～5分）、酒体透明度（0～5分）、酒体澄清度（0～5分）、酒体光泽度（0～5分）、挂杯效果（0～5分）并结合接受喜好度,进行评分。嗅觉和味觉采用特征风味描述法[17],即评判成员根据备选描述词结合嗅品过程中补充描述词进行打分,结合接受喜好度,进行评分。评分越高,特征性越强。
1.4 数据分析
采用SPSS 18.0进行数据分析,prism 8.0、TBtools、simca、Gephi进行绘图。
2 结果与分析
2.1 桑葚酒的理化指标测定结果
酒的理化指标是酒体品质和成熟度是否达标的基本评判标准,酒精度、残糖量、挥发酸等不仅影响酒整体口感和风味,更关系活性物质的溶出和转化[18]。不同品种桑葚发酵桑葚酒基础理化指标如表1所示。
表1 不同品种桑葚发酵桑葚酒基础理化指标
Table 1 Basic physical and chemical indicators of different mulberry wine
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
总SO2含量/（mg/L）35.2±3.2a 41.6±3.2a 35.2±3.2a 41.6±3.2a桑葚酒Y2 HM HF ZJ酒精度/% vol 6.65±0.07b 7.20±0.17a 7.47±0.09a 5.53±0.15c干浸出物含量/（g/L）32.37±0.49a 15.47±0.49c 22.70±0.36b 31.57±0.60a总糖含量/（g/L）6.92±0.01a 2.85±0.09d 4.01±0.06c 5.61±0.09b还原糖含量/（g/L）2.99±0.15b 0.87±0.06d 1.39±0.04c 4.56±0.12a总酸含量/（g/L）4.29±0.04b 3.09±0.39c 7.34±0.03a 7.86±0.19a挥发酸含量/（g/L）1.35±0.01b 2.78±0.01a 0.26±0.02d 0.33±0.01c
2.1.1 不同品种桑葚发酵桑葚酒的酒精度比较
由表1可知,HF酒精度最高,为7.47% vol,ZJ最低,为5.53% vol,这与酵母的敏感性有关,生物碱具有一定抗菌活性,其不同组分和含量对酵母膜透化程度不同,因此,ZJ中的生物碱含量高可能是导致ZJ发酵较为不彻底的主要原因[19]。
2.1.2 不同品种桑葚发酵桑葚酒的总糖、还原糖含量比较
由表1可知,4 个不同品种桑葚发酵结束后总糖含量维持在6.92～2.85 g/L,其中Y2总糖含量最高,ZJ次之,HM最低。HM在整个发酵过程中还原糖消耗利用的最为彻底,其还原糖含量为0.87 g/L；ZJ还原糖含量最高,为4.56 g/L,Y2 次之。Y2、ZJ总糖、还原糖残余量高的原因可能是本次选用的酵母对Y2、ZJ的活性物质产生不适,导致发酵进程不彻底,因此可做进一步工艺优化调整。
2.1.3 不同品种桑葚发酵桑葚酒的总酸、挥发酸含量比较
总酸和挥发酸是评判酒体品质和香气协调性的重要指标[20]。由表1可知,不同品种桑葚发酵桑葚酒中,ZJ总酸含量最高,为7.86 g/L,HM总酸含量最低,为3.09 g/L；挥发酸含量HM最高,为2.78 g/L,HF最低,为0.26 g/L,结合酒精度可以看出,ZJ酒精代谢转化主要为醇类物质向有机酸类化合物催化氧化,HM主要偏向于挥发酸类物质催化氧化。
2.1.4 不同品种桑葚发酵桑葚酒的干浸出物、总SO2含量比较
由表1可知,4 种桑葚酒只有HM干浸出物含量低于18 g/L,其中Y2干浸出物含量最高,为32.37 g/L,这与ZJ黄酮类、花色苷类含量丰富有关。总SO2在桑葚酒中主要起到防止多酚、花色苷氧化,稳定酒体色泽,抑菌杀菌的作用,但含量过高会引起人体急性中毒。由表1可知,4 种桑葚酒的总SO2均符合我国发酵酒卫生标准（<250 mg/L）[21]。
2.2 桑葚酒的活性成分测定结果
不同品种桑葚发酵桑葚酒总多酚、总花色苷、总黄酮、生物碱含量如图1所示。
图1 不同品种桑葚发酵桑葚酒活性成分含量
Fig.1 Content of active ingredients in different mulberry wine
同一指标不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
桑葚酒中的多酚主要可分为花色苷类和非花色苷类（黄酮类、单宁、酚酸类、黄酮醇类、黄烷醇类等）。由图1可知,Y2与HF中总多酚含量差异显著,且二者与HM、ZJ差异显著。Y2总多酚含量最高,为1 319.11 mg/L,HF次之,HM最低,为77.38 mg/L。花色苷是桑葚酒中主要呈色物质,Y2与HM差异显著,且二者与HF、ZJ差异显著,Y2总花色苷含量最高,为438 mg/L,HM次之,ZJ最低,为2.00 mg/L。总黄酮含量Y2与HF差异显著,且二者与HM、ZJ差异显著。Y2总黄酮含量最高,为669.20 mg/L,HF次之,HM最低,为55.00 mg/L。综合分析总多酚、总花色苷、总黄酮含量差异可以看出,HM、HF总多酚含量分别与其总黄酮、总花色苷含量加合相近,而Y2、ZJ除总黄酮、总花色苷外还有一些占比较高的酚类物质,因此可进一步检测其组分含量,挖掘活性价值。
生物碱是一类含氮有机活性物质,具有较好的抗炎、抗肥胖功效。目前,桑树生物碱研究多见于桑叶、桑枝、桑葚生物碱组分测定分析,桑葚酒中的生物碱组分及含量研究鲜见报道[22]。由图1可知,不同桑葚酒中生物碱含量差异显著。ZJ生物碱含量最高,为66.73 mg/L,具有功能性酒开发价值。
2.3 桑葚酒的抗氧化性
发酵桑葚酒总抗氧化能力、DPPH·清除率、羟自由基清除率如图2所示。
图2 不同桑葚酒的抗氧化性
Fig.2 Antioxidant capacity of different mulberry wine
2.3.1 不同品种桑葚发酵桑葚酒的总抗氧化能力比较
由图2可知,Y2总抗氧化能力与HM、HF、ZJ之间差异明显,HM、HF、ZJ三者之间总抗氧化能力差异不明显,Y2总抗氧化能力最强,为3 421.62 mg/L,ZJ最低,为651.81 mg/L。其变化趋势与花色苷含量趋势一致,与张新蕊[23]研究结果相似。
2.3.2 不同品种桑葚发酵桑葚酒的DPPH·清除率比较
由图2可知,HF与Y2 的DPPH·清除率差异不明显,与HM、ZJ差异明显,HF的DPPH·清除率最高,为95.59%,YZ次之,ZJ最低,为60.22%。研究表明,桑葚酒的DPPH·清除率强弱与总多酚含量呈正比,但本试验结果与之并不完全吻合,除理化因素对其有一定影响外,其主要原因可能是ZJ总多酚组分具有多个螯合位点,能够与金属离子生成的螯合物形成多肩峰,间接增强抗氧化性[24]。
2.3.3 不同品种桑葚发酵桑葚酒的羟自由基清除率比较
由图2可知,HF与Y2、ZJ羟自由基清除率差异不明显,与HM差异相对明显,HF的羟自由基清除率最高,为98.60%,YZ次之,HM最低,为97.08%,可能与HM所含有的不饱和键含量较低有关。
2.4 桑葚酒感官评价
不同品种桑葚发酵桑葚酒视觉、味觉、嗅觉评分如图3所示。
图3 桑葚酒视觉、味觉、嗅觉评分热图
Fig.3 Heat map of color，taste，and smell scores of mulberry wine
由图3视觉评分可知,ZJ透明度、光泽度最高,Y2透明度、光泽度最低,说明花色苷组分和含量对桑葚酒的透明度起主导作用。4 种桑葚酒挂杯效果并不理想,Y2挂杯较其他3 种桑葚酒较好,HF挂杯效果最差,这与桑葚酒中干浸出物、残糖量、醇类含量有关。
由图3味觉评分可知,Y2整体口感较为饱满,但苦味和涩味较为明显。HM酒精味低,酸味比较突出,甜味较低,这也是HM口感较为淡薄酸味明显的主要原因。HF、ZJ酒精味适中,酸味较高,但其他滋味强度较低,导致整体口感平衡性较差。由于Y2单宁及聚合物相对含量较高,Y2在收敛性和柔和度上要优于其他3 种桑葚酒。
由图3嗅觉可知,ZJ的香气最为丰富,甜香味、奶油味、发酵味、面包味、花香味、果香味较为突出,这可能是ZJ在酒精发酵过程中生成了较多的高级醇类及酯类化合物,这些物质能够赋予酒体清新的基调以及淡雅怡人的舒适感[25]。HF与HM香气较为接近,HF在甜香味、酒味、奶油味较为突出,而HM在玫瑰味、桂花味、香草味较为突出。Y2酒味比较突出,但嗅到的香气种类较少,且气味较淡,导致Y2在香气方面较为不平衡不协调。
2.5 桑葚酒感官差异分析
为进一步验证感官评分是否具有代表性以及不同桑葚酒之间的区分程度,对其进行差异分析,由于味觉的Q2值为负值,组间差异不显著,因此除味觉外,其余做正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA）。桑葚酒视觉、嗅觉差异分析如图4～图5所示。
图4 桑葚酒视觉差异分析
Fig.4 Analysis of color differences in mulberry wine
A.桑葚酒视觉OPLS-DA得分图；B.桑葚酒视觉置换检验200 次执行；C.桑葚酒视觉VIP图。
图5 桑葚酒嗅觉差异分析
Fig.5 Analysis of smell differences in mulberry wine
A.桑葚酒嗅觉OPLS-DA得分图；B.桑葚酒嗅觉置换检验200 次执行；C.桑葚酒嗅觉VIP图。
2.5.1 桑葚酒视觉差异分析
由图4可知,HM、HF、ZJ组内各值离散度不高,可较好代表HM、HF、ZJ在视觉感受方面普遍评价情况。Y2 组内各值的离散度较高,说明在视觉评价方面,存在一定分歧。从组间区分度来看HM、HF、ZJ三者重叠部分面积较大,说明HM、HF、ZJ在视觉方面区分度不明显,Y2与HM、HF、ZJ重叠部分较小,说明Y2在视觉方面与另外3 个存在差异。置换结果R2<0.3,Q2<0.05,模型可靠,可进行差异筛选。从图4C可以看出,酒体透明度、酒体澄清度变量投影重要度（variable important for the projection,VIP）值>1,说明酒体透明度、酒体澄清度是引起Y2、HM、HF、ZJ视觉差异的主要因素,该分析结果与视觉感官评分结果相吻合。
2.5.2 桑葚酒嗅觉差异分析
由图5可知,Y2、HM、HF、ZJ组内各值较为集中,可较好代表Y2、HM、HF、ZJ在嗅觉感受方面普遍评价情况。从组间区分度来看,HF与ZJ,Y2与HF重叠面积较大,说明HF与ZJ,Y2与HF在嗅觉上具有一定的相似性,HM与其他三者未有面积重叠,说明HM与Y2、HF、ZJ在嗅觉方面存在差异。置换结果R2<0.3,Q2<0.05,模型可靠,可进行差异筛选。从VIP图中可以看出,中药味、奶油味、玫瑰味、面包味、坚果味、香草味、苹果味、花香味、桑葚味、芒果味、丁香味、蜂蜜味、甜香味的VIP值>1,说明这类气味是引起Y2、HM、HF、ZJ嗅觉差异的主要因素,该分析结果与嗅觉感官评分结果相吻合。
2.6 桑葚酒喜好接受度分析
喜好接受度反映消费者对食品的满意程度,同时也是厂家改良提升食品品质风味所参考的主要依据。由图6可知,HM在颜色项喜好接受度评分最高,为4.27。因此,HM可开发以颜色为特色的桑葚功能性酒。ZJ口感协调,回甘时间保留较长,香气清新怡人,花香、果香味充分在口感和气味项喜好度评分最高,分别为4.02、3.88。Y2在口感方面得分也比较突出,但由于苦涩味较强,口感评分稍逊于ZJ。因此,ZJ和Y2可开发以风味为特色的桑葚保健酒。
图6 不同桑葚酒喜好接受度得分
Fig.6 Scores of preference acceptance for different mulberry wine
2.7 桑葚酒多重相关性分析
不同品种发酵桑葚酒多重相关性分析网络图如图7所示。
图7 桑葚酒多重相关性网络图
Fig.7 Multi-correlation network of mulberry wine
边粗细代表相关性强弱,过滤掉相关性±0.7以内的值,无显著性边进行淡化处理。
由图7可知,桑葚酒的理化指标、活性成分与感官及抗氧化能力之间有一定相关性。从理化指标的关联性可看出,SO2含量与桂花味呈显著正相关、与芒果味呈极显著正相关,该研究结果与Garde-Cerdán等[26]研究结果相似。酒精度与香蕉味呈显著正相关,与果香味呈极显著负相关,原因可能是适量的酒精有利于桑葚酒中乙酸异戊酯、丁酸乙酯等酯类挥发性风味化合物香气的增强和扩散,但随着酒精含量的增加,酒精味愈发强烈,对其他香气具有较强的掩盖作用[27]。总酸与甜香味呈显著正相关,但与酸味（滋味）和醋香味（气味）并未体现出相关性。干浸出物与柑橘味呈显著负相关,总糖与柑橘味呈极显著负相关。
从活性成分的关联性可看出,总多酚、总黄酮与酒体透明度呈显著负相关,花色苷与酒体透明度呈极显著负相关,证明桑葚酒多酚类化合物中花色苷是影响酒体色泽的主要物质,该研究结果与高雨寒等[16]、Tchabo等[28]研究结果一致。生物碱与面包味呈极显著正相关,与醋香味呈显著负相关。总多酚、总黄酮、花色苷与抗氧化性呈极显著正相关,证明不同品种桑葚酒的总抗氧化能力依然以总多酚、总黄酮、花色苷含量为主导,而生物碱并未与抗氧化性有直接关联。
3 讨论
桑葚酒作为桑葚深加工的一种,根据桑葚品种不同,呈现出不同的理化活性和感官品质。ZJ酒精含量最低,但花香、果香味充分强烈,推测较多醇类物质参与了醛酮转化及酯类合成[29]。陈酿期间保持一定的残糖量有助于提升桑葚酒圆润饱满的口感,从HM与Y2、ZJ残糖量和口感得分来看,证实了这一观点。本研究中ZJ的总酸含量最高,但并未导致口感失衡,反而呈现出酸甜爽口的特性,这与Yadav等[30]用 MI-362品种酿造桑葚酒的口感有相似之处。SO2在发酵前加入有利于酯类物质的溶出和增加[31],SO2相关性分析表明,SO2含量与与桂花味呈显著正相关、与芒果味呈极显著正相关,推测一定量的SO2均能促进不同桑葚酒中呈果香味、花香味挥发性化合物的生成,对风味轮廓的修饰具有积极贡献。
研究表明,酚类物质在发酵过程中的变化对酒的颜色、口感、风味有重要影响[32]。本研究中Y2的总多酚含量最高,在口感方面表现出较为饱满回甘性好的特性,HM总多酚含量最低,在香气和口感方面也就呈现出一定的缺陷。花色苷是桑葚酒中的主要且性质活跃的一类活性物质[33],陈杭君[34]测定不同品种桑葚中的花色苷含量,结果表明白桑系列花色苷含量极低,Li等[35]、Zhao等[36]也证实了这一观点。本研究中ZJ的花色苷含量最低,进一步证明了白桑系列及其发酵后花色苷含量低、色泽浅的基本特征。但值得关注的是,“珍珠白”桑葚生物碱含量较高,经发酵后具有优势,其含量是Y2的3.8倍,因此,可以进一步研究“珍珠白”在酿造过程中生物碱组分和含量的变化,深入挖掘ZJ的活性物质。
目前,黑桑系列桑葚酒已有大量研究,但白桑系列、长果桑系列桑葚酒相关研究较少。Yu等[29]选用大白桑、紫玉一号及药桑按1∶1∶3的比例进行果酒混合发酵,结果表明该条件下桑葚果酒能够呈现出较为理想的风味口感。孙佳勰[37]对大什、四季、红果、白珍珠发酵桑葚酒进行挥发性风味成分测定分析,结果表明,不同品种桑葚酒的香气组成存在差异,参与香气组成的酯类、酸类、醇类、醛酮类等含量各不相同。因此,应结合当地桑葚资源特色,加大桑葚产品精深加工的研究开发力度,进一步开拓桑葚产品。
4 结论
对比不同品种桑葚发酵桑葚酒的理化指标,结果表明,HF酒精度含量最高,为7.47% vol；Y2干浸出物、总糖含量最高,为32.37 g/L、6.92 g/L；ZJ还原糖含量最高,为4.56 g/L；HM挥发酸含量最高为2.78 g/L。经活性成分测定,Y2在总多酚、总黄酮、总花色苷含量上占有绝对优势,ZJ生物碱含量最为突出,HF其次。抗氧化试验结果表明,HF的DPPH·清除率、羟自由基清除率最高,均为95%以上,但总抗氧化能力Y2最强,为3 421.62 mg/L。
4 个品种桑葚发酵桑葚酒感官结果表明,黑美人（HM）桑葚酒色泽微红透亮,颜色喜好接受度得分最高；ZJ口感协调,香气饱满,口感和香气喜好接受度得分最高。结合活性成分及抗氧化性分析结果,初步确立ZJ和Y2可开发以风味为特色的桑葚功能性酒,HM适合开发以色泽为亮点的桑葚酒。进一步相关性分析发现,果香味和酒精含量呈一定关系,适量的酒精有利于促进果香味形成,但过量容易掩盖其香味特征,多数香气成分与SO2、总酸呈正相关,与干浸出物、总糖呈负相关；总多酚、总黄酮、总花色苷与酒体透明度呈负相关,与总抗氧化呈极显著正相关。因此,可深入研究发酵过程中不同桑葚酒各类风味物质的形成机理,与活性成分之间的相互作用,为进一步挖掘桑葚资源、开发高值化特色桑葚酒提供数据支撑。
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