生物体维持正常的生理活动和功能离不开必需微量元素的作用,缺乏微量元素可能导致各种健康问题。锌是生物体内必需的微量元素之一,对于稳定蛋白质的结构和功能、信号传导、基因表达和细胞凋亡的调控起着核心作用[1-2]。因生物体无法自行合成微量元素或其合成量不足以满足生理需求,目前全球约有17.3%的人群均存在锌缺乏的现象,特别是在发展中国家,锌缺乏现象更为普遍,锌缺乏对于婴幼儿、孕妇和哺乳期妇女来说尤为严重,可能导致生长发育迟缓、发育不良、免疫功能受损等一系列疾病[3]。因此,开发安全有效且无副作用的新型补锌剂成为行业关注的热点。
研究表明,植物蛋白肽具有良好的金属离子螯合活性,通过配位键与金属离子结合生成具有环状结构的金属有机螯合物,能够显著提高金属离子的生物利用率,使其更容易被人体吸收和利用,同时还具有多种生物活性功能,例如抗氧化、抗菌作用。研究已报道了来源于多种植物源蛋白的金属离子螯合肽,如从大豆蛋白中分离富集得到钙载量为158.63 mg/g的多肽[4]、桃仁蛋白酶解液中提取能与亚铁螯合的桃仁蛋白肽[5]、玉米蛋白中分离纯化出具有锌螯合能力的多肽[6],均表明植物蛋白可以作为螯合金属元素的基料。其次,有研究表明肽锌螯合物在胃肠道中的溶解率、透析率和生物利用率均优于无机锌[7-8],可以有效促进必需微量元素锌的吸收利用,研究结果进一步表明从植物蛋白中获取天然金属离子螯合剂的可行性。目前,有关核桃多肽与金属元素螯合能力的研究鲜见报道,尤其是与锌进行螯合的研究。孙小东[9]从核桃多肽中分离出具有钙螯合能力的肽段,而林栋等[10]从核桃多肽中分离出具有硒螯合能力的肽段,表明核桃多肽在制备金属离子螯合物领域的应用值得关注和探讨。
核桃粕中含有丰富的营养素,如蛋白质、脂类、矿物质等,其中蛋白质的平均含量达到40%以上,是优质植物蛋白质的重要来源。根据不同蛋白质溶解性的差异,可以将核桃蛋白分为核桃清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、酸溶性谷蛋白（谷蛋白-1）和碱溶性谷蛋白（谷蛋白-2）[11-12]。不同的蛋白质组分在营养价值、功能特性、生理活性与应用前景等方面均存在较大差异,这些差异主要是由氨基酸组成和溶解性的不同导致的,因此在不同的应用领域中会有不同的选择和应用。目前,关于核桃蛋白质的研究报道较多,但针对其组分蛋白的功能性质与生理活性等研究较少,对核桃各组分蛋白酶解物与锌螯合及相关产品的研究鲜见报道。
因此,为实现脱脂核桃粕的高值化利用,本研究以核桃粕为原料,从脱脂核桃粕中连续提取分离出各组分蛋白,以锌螯合能力为指标,筛选出适宜制备肽锌螯合物的组分蛋白,并探究螯合温度、螯合时间、螯合pH值及肽锌质量比对螯合能力和螯合物得率的影响,以期为核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的研究开发提供一定理论依据,为核桃谷蛋白在食品中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃谷蛋白：新疆农业大学食品科学与药学学院实验室自制；中性蛋白酶（10 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市鑫铂特化工有限公司；硫酸锌、乙二胺四乙酸、氯化铵（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：成都市科隆化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3C型雷磁pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；TD5A-WS型台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；FA1204B型电子天平：上海仪天科学仪器有限公司；TU-1810PC型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；CHRIST Alpha 1-2 LDplus型真空冷冻干燥机：北京五洲东方科技发展有限公司；SHZ-B型恒温水浴摇床：上海赫田科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理
将核桃粕粉碎后过40 目筛,在4 ℃条件下,按照料液比1∶2 （g/mL）加入石油醚除去残留油脂,重复脱脂3 次,直至上清液呈无色为止,烘干后,即得到脱脂核桃粕,在4 ℃贮存。
1.3.2 核桃蛋白各组分的提取分离
参考文献[13-14]的方法,依次从脱脂核桃粕中提取分离出清蛋白（用纯水提取）、球蛋白（用1 mol/L NaCl提取）、醇溶蛋白（用70%乙醇提取）、谷蛋白-1（用50%冰乙酸提取）和谷蛋白-2（用0.1 mol/L NaOH提取）。
提取流程：脱脂核桃粕→加入溶剂[料液比1∶10 （g/mL）]→搅拌2 h→离心（4 500 r/min,15 min）→冻干上清液,即为各组分蛋白。
1.3.3 核桃谷蛋白-2多肽的制备
采用酶解法制备核桃谷蛋白-2多肽。将核桃谷蛋白-2配成底物浓度5%的蛋白液,然后磁力搅拌10 min,将蛋白充分溶解后加入中性蛋白酶（10 000 U/g）,用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.00,50 ℃保温水解4 h,水解期间用0.1 mol/L NaOH溶液维持体系pH值稳定,测其水解度。4 h后沸水浴灭酶10 min,冷冻干燥上清液,即为核桃谷蛋白-2多肽。
1.3.4 核桃谷蛋白-2多肽锌螯合物的制备
根据文献[15-16]中制备肽锌螯合物的方法并稍作修改,将核桃谷蛋白-2多肽溶于去离子水中,多肽浓度为4%,按照肽锌质量比2∶1加入ZnSO4·7H2O,快速充分混匀,用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值为7.00,恒温水浴反应1 h,然后在4 500 r/min条件下离心20 min,收集上清液,加入3倍体积无水乙醇,4 ℃静置醇沉12 h,离心（4 500 r/min,10 min）取沉淀,用无水乙醇洗涤数次直至无沉淀生成,冷冻干燥,即为核桃谷蛋白-2多肽锌螯合物。
1.3.5 单因素试验
以锌离子螯合能力为评价指标,在其他条件不变的前提下,研究螯合温度（30、40、50、60、70 ℃）,螯合时间（20、30、40、50、60 min）、肽锌质量比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1）以及螯合pH值（5.00、6.00、7.00、8.00、9.00）对核桃谷蛋白-2多肽与锌离子螯合能力的影响。
1.3.6 响应面试验设计
在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,以螯合能力为响应值,选择螯合温度（A）、螯合时间（B）、螯合pH值（C）、肽锌质量比（D）为自变量,采用Design-Expert 12软件设计四因素三水平的响应面试验,共计29 个试验点,其中包含24 个析因点和5 个中心点,以探究不同因素对螯合能力的影响,并分析各影响因素之间的交互作用,最终得出制备核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的最佳工艺参数。试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factor and levels of response surface test
水平-1 0 1 A螯合温度/℃40 50 60 B螯合时间/min 20 30 40 C螯合pH值5.00 6.00 7.00 D肽锌质量比1∶1 2∶1 3∶1
1.3.7 螯合能力的测定
采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）络合滴定法测定核桃谷蛋白-2多肽与锌离子的螯合能力。根据文献[17-18]螯合能力的测定方法并稍作修改,取0.1 g核桃谷蛋白-2肽锌螯合物,用10 mL去离子水充分溶解,再加入10 mL氨-氯化铵缓冲溶液（pH10.0）和2 mL铬黑T指示剂（0.01 mol/L）,混匀后,用0.01 mol/L EDTA标准溶液进行滴定,直至颜色由紫色变为蓝色。螯合能力[Y,（mg/g）]计算公式如下。
式中：M为金属锌的相对原子质量,g/mol；c为EDTA标准溶液的浓度,mol/L；V为加入EDTA标准溶液的体积,mL；m为称取产物的质量,g。
1.3.8 螯合物得率的测定
将冻干后的核桃谷蛋白-2肽锌螯合物称重,螯合物得率计算公式如下。
式中：X为螯合物得率,%；m1为螯合产物的质量,g；m2为加入的多肽和无机锌盐的总质量,g。
1.4 数据处理
使用Excel 2020处理数据,Origin 2021绘制图表,Design-Expert 12设计分析响应面方案模型,Duncan′s法多重比较试验数据,数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 核桃粕各组分蛋白的含量与螯合能力
核桃粕中各组分蛋白含量以及螯合能力结果见图1。
图1 核桃粕中各组分蛋白的含量及螯合能力
Fig.1 Protein content of each component in walnut meal and its chelating ability
（A）核桃粕中各组分蛋白的含量；（B）各组分蛋白的酶解产物与锌离子的螯合能力。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图1（A）可知,核桃粕中蛋白质含量大小顺序为谷蛋白-2>谷蛋白-1>球蛋白>清蛋白>醇溶蛋白。由图1（B）可知,5 种组分蛋白均具有一定的锌螯合能力,其中螯合能力最高的为谷蛋白-1,为（78.54±2.48） mg/g,谷蛋白-2 次之,螯合能力为（76.59±2.61） mg/g,二者螯合能力相近,且差异不显著（P>0.05）。醇溶蛋白的螯合能力最差,为（16.03±1.31） mg/g,这可能与其氨基酸结构有关。综上,选择谷蛋白-2为原料蛋白,进行肽锌螯合物的制备。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 螯合pH值对螯合能力和螯合物得率的影响
螯合pH值对螯合能力和螯合物得率的影响见图2。
图2 螯合pH值对肽锌螯合物螯合能力和螯合物得率的影响
Fig.2 Effect of chelating pH on chelating ability and yield of peptide-zinc chelate
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图2可知,pH值对螯合能力和螯合物得率均具有明显影响,当反应体系的pH值小于6.00时,二者均随着pH值的升高而增加,但当pH值大于6.00时,二者均随着pH值升高反而急速减小,pH值为6.00时螯合能力和螯合物得率均达到最大值。这可能是由于pH值过低时,反应体系中的H+与Zn2+竞争供电基团,抑制了多肽与锌发生螯合反应；而pH值继续升高螯合能力反而下降,可能是因为pH值过高导致体系中氢氧根离子增多,易与锌离子产生白色氢氧化锌沉淀,消耗体系中的锌离子,无法与多肽螯合反应[19]。其次,合适的pH值有利于—NH和—COOH中氢离子的解离,而且能提供给电子基团与金属离子结合的最适环境[20]。因此,选取螯合pH值5.00、6.00、7.00进行后续响应面试验。
2.2.2 螯合温度对螯合能力和螯合物得率的影响
螯合温度对螯合能力和螯合物得率的影响见图3。
图3 螯合温度对肽锌螯合物螯合能力和螯合物得率的影响
Fig.3 Effect of chelating temperature on chelating ability and yield of peptide-zinc chelate
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图3可知,随着螯合温度的升高,螯合能力和螯合物得率均在30～50 ℃范围内不断增加,50 ℃后均减小,50 ℃时螯合能力达到最大值,为（78.00±1.62） mg/g,此时螯合物得率为（48.31±4.14）%。这是因为温度升高会加剧分子的运动,增大分子之间的碰撞概率,从而对螯合反应产生正面影响[21],但是蛋白肽与金属离子的螯合反应是放热反应[8],高温会抑制反应正向进行,可能会发生反应物的解离或产物的解离,从而降低螯合反应的效率[22]。此外,较高的温度会影响螯合物的结构,可能会不稳定,导致配位键的断裂,螯合物部分分解,高温还可能引发氨基酸或小肽发生脱氨反应,对螯合能力和产物得率产生负面影响[23],这与陈濠[24]的研究结果一致。因此,选取螯合温度40、50、60 ℃进行后续响应面试验。
2.2.3 螯合时间对螯合能力和螯合物得率的影响
螯合时间对螯合能力和螯合物得率的影响见图4。
图4 螯合时间对肽锌螯合物螯合能力和螯合物得率的影响
Fig.4 Effect of chelating time on chelating ability and yield of peptide-zinc chelate
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图4可知,延长螯合时间,螯合能力先上升后缓慢下降,在30 min时螯合能力最高,为（86.23±1.47） mg/g；而螯合物得率在30 min后缓慢上升,但差异不显著（P>0.05）,这说明核桃谷蛋白-2肽和锌离子的螯合过程反应速率很快,30 min时反应已经达到平衡状态。在整个反应进程中,开始时反应物充足,反应速率较快,随着时间的延长,反应物逐渐被消耗,因此反应速率减慢,直至反应达到动态平衡,反应物的浓度不再发生明显变化,螯合能力和螯合物得率也趋于稳定。但是时间过长,螯合物受到反应环境影响,极易发生改变,进而降低其螯合能力[25]。因此,选取螯合时间20、30、40 min进行后续响应面试验。
2.2.4 不同肽锌质量比对螯合能力和螯合物得率的影响
肽锌质量比对螯合能力和螯合物得率的影响见图5。
图5 肽锌质量比对肽锌螯合物螯合能力和螯合物得率的影响
Fig.5 Effect of peptide-to-zinc mass ratio-on chelating ability and yield of peptide-zinc chelate
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
如图5所示,多肽和硫酸锌的比例对反应的影响较大,随着肽比例的增加,二者均呈先增加后减小的趋势。当肽锌质量比在1∶2～2∶1范围内时,随着肽与锌质量比的变化,螯合能力和产物得率不断上升,且在质量比为2∶1时,达到最大值,螯合能力为（78.00±1.62） mg/g,螯合物得率为（49.78±3.72）%,表明在一定范围内,提高肽的比例可以增强螯合反应的效果。能与多肽结合的锌是定量的,当反应体系中锌离子的含量较低时,部分肽分子无法形成稳定的螯合物,结构极不稳定,从而影响产物的螯合能力；反之,当增加锌含量时,体系的硫酸锌过量,锌离子可能会与其他分子或离子发生反应,降低产物得率[26-27]。因此,选择肽锌质量比1∶1、2∶1、3∶1进行后续响应面试验。
2.3 响应面优化结果与分析
2.3.1 响应面试验结果
响应面试验方案及结果如表2所示。
表2 响应面试验方案及结果
Table 2 Response surface test scheme and results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A螯合温度/℃40 60 40 60 50 50 50 50 40 60 40 60 50 50 50 50 40 60 40 60 50 50 50 50 50 50 50 50 50 B螯合时间/min 20 20 40 40 30 30 30 30 30 30 30 30 20 40 20 40 30 30 30 30 20 40 20 40 30 30 30 30 30 C螯合pH值6.00 6.00 6.00 6.00 5.00 7.00 5.00 7.00 6.00 6.00 6.00 6.00 5.00 5.00 7.00 7.00 5.00 5.00 7.00 7.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 D肽锌质量比2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 1∶1 1∶1 3∶1 3∶1 1∶1 1∶1 3∶1 3∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 1∶1 1∶1 3∶1 3∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1 2∶1螯合能力/（mg/g）79.63 81.90 84.50 83.85 96.53 92.63 99.13 78.00 86.78 94.25 88.40 96.85 95.55 91.00 77.35 83.20 82.88 100.10 90.03 78.98 84.83 87.75 81.25 85.15 106.93 109.2 106.28 105.63 104.65
2.3.2 响应面试验结果分析
利用 Design-Expert 12软件对表2数据进行分析,得到核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的螯合能力与各因素之间的多元二次回归拟合方程为Y=106.54+1.98A+1.24B-5.42C-1.17D-0.73AB-7.07AC+0.245AD+2.6BC+0.245BD-4.31CD-9.77A2-13.8B2-7.62C2-6.85D2。对响应面回归模型进行显著性检验及方差分析,结果如表3所示。
表3 响应面回归模型的显著性检验及方差分析
Table 3 Significance test and variance analysis of response surface regression model
注：*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）。
方差模型自由度14 A B C D AB显著性*****AC AD BC BD CD A²B²C²D²残差失拟项误差总和平方和2 466.72 46.85 18.6 352.08 16.31 2.13 199.8 0.240 1 27.04 0.240 1 74.22 619.4 1 234.51 376.45 304.09 134.06 122.36 11.7 2 600.78 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 F值18.4 4.89 1.94 36.77 1.70 0.222 6 20.87 0.025 1 2.82 0.025 1 7.75 64.69 128.92 39.31 31.76 P值<0.000 1 0.044 1 0.185 1<0.000 1 0.212 9 0.644 3 0.000 4 0.876 4 0.115 0 0.876 4 0.014 6<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1***********10 4 28均方176.19 46.85 18.6 352.08 16.31 2.13 199.8 0.240 1 27.04 0.240 1 74.22 619.4 1 234.51 376.45 304.09 9.58 12.24 2.92 4.18 0.090 1
由表3可以看出,该响应面的模型极显著（P<0.01）,失拟项不显著,模型R2=0.948 5,且R2Adj=0.896 9,说明响应面回归模型与实际试验拟合良好,可以用来分析和预测核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的最佳制备工艺。模型变异系数是衡量模型精密度和可靠性的重要评价指标,数值越小代表模型越可靠,本模型变异系数为3.41%,表明模型高度可靠。精密度为13.783 6>4,说明该模型合理可行。综合以上分析,该响应面回归模型和实际试验之间拟合度较好,模型的可行性和精确度较高,可以用来分析和预测核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的最佳制备条件。由F值可知,锌螯合能力受各因素影响程度大小依次为螯合pH值（C）>螯合温度（A）>螯合时间（B）>肽锌质量比（D）,其中螯合pH值（C）对锌螯合能力的影响极显著（P<0.01）,螯合温度（A）对锌螯合能力的影响显著（P<0.05）。
2.3.3 响应面多因素交互作用分析
各因素的交互作用对螯合能力的影响3D响应曲面及等高线见图6。
图6 各因素的交互作用对螯合能力的影响3D响应曲面及等高线
Fig.6 3D response surface and contour map of effect of interaction of various factors on chelating ability
三维响应曲面和等高线能直观反映交互作用对响应值的影响程度,曲面形状越陡峭,等高线越密集,则影响越显著,等高线越接近椭圆,两个因素的交互作用越强[28]。由表3和图6可知,交互项AC影响极显著（P<0.01）、CD影响显著（P<0.05）,且曲面形状陡峭,等高线均近似椭圆形,表明螯合温度和螯合pH值、螯合pH值和肽锌质量比之间的交互作用对核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的螯合能力具有显著影响。
2.3.4 最佳条件的确定及验证试验
根据响应面分析得出制备核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的最佳条件,在螯合温度52.88 ℃、螯合时间29.89 min、螯合pH值5.49、肽锌质量比2.08∶1的条件下,预测核桃谷蛋白-2肽与锌螯合的能力为108.16 mg/g。根据实际情况,将试验条件调整为螯合温度52 ℃、螯合时间30 min、螯合pH值5.50,肽锌质量比2∶1。为了验证响应面分析结果的可靠性,在此条件下重复3 次试验,最终得到核桃谷蛋白-2肽锌螯合物的螯合能力为（104.98±5.53） mg/g,与预测值较为接近。这证明了通过响应面优化螯合条件,可以制备具有高锌含量的核桃谷蛋白-2肽锌螯合物,且结果较为可靠。
3 结论
本研究从脱脂核桃粕蛋白质中依次分离出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2 5 种组分蛋白质,含量大小顺序为谷蛋白-2>谷蛋白-1>球蛋白>清蛋白>醇溶蛋白；5 种组分蛋白质均具有一定的与锌结合能力,但差别较大,谷蛋白-1的最高,谷蛋白-2 次之,醇溶蛋白最差。综合考量蛋白含量和螯合能力,选择核桃谷蛋白-2作为制备肽锌螯合物的最佳原料。为确定多肽与锌螯合的最佳参数,通过单因素结合响应面试验,并结合实际需求进行了优化。最终确定的最佳螯合条件为螯合温度52 ℃、螯合时间30 min、螯合pH值5.50、肽锌质量比2∶1,此时核桃谷蛋白-2肽与锌的螯合能力达到（104.98±5.53） mg/g,螯合物得率为70.53%,与响应面模型的预测值相符,该研究可为开发核桃肽锌螯合物相关产品提供技术支撑,也可实现核桃粕的高值化利用。
[1]UDECHUKWU M C, COLLINS S A, UDENIGWE C C.Prospects of enhancing dietary zinc bioavailability with food-derived zinc-chelating peptides[J].Food & Function, 2016, 7(10): 4137-4144.
[2]WANI A L, PARVEEN N, ANSARI M O, et al.Zinc: An element of extensive medical importance[J].Current Medicine Research and Practice, 2017, 7(3): 90-98.
[3]CHASAPIS C T, NTOUPA P S A, SPILIOPOULOU C A, et al.Recent aspects of the effects of zinc on human health[J].Archives of Toxicology, 2020, 94(5): 1443-1460.
[4]王俊强.大豆肽钙螯合物的结合机理及其性质研究[D].无锡:江南大学, 2019.WANG Junqiang.Study on binding mechanism and properties of calcium-binding soy peptides[D].Wuxi: Jiangnan University, 2019.
[5]杨玉蓉, 李安平, 钟政昌, 等.桃仁多肽螯合亚铁的抑菌活性及结构表征[J].食品科学, 2019, 40(5): 57-62.YANG Yurong, LI Anping, ZHONG Zhengchang, et al.Antibacterial activity and structural characterization of peach kernel peptideferrous chelate[J].Food Science, 2019, 40(5): 57-62.
[6]张智, 刘慧, 刘奇, 等.玉米肽-锌螯合物结构表征及抗氧化活性分析[J].食品科学, 2017, 38(3): 131-135.ZHANG Zhi, LIU Hui, LIU Qi, et al.Structural characteristics and antioxidant activity of corn peptide-Zn complex[J].Food Science,2017, 38(3): 131-135.
[7]王晓萍, 郭晓娜, 朱科学, 等.固定化金属亲和层析富集麦胚蛋白金属螯合肽的研究[J].中国粮油学报, 2015, 30(3): 101-105.WANG Xiaoping, GUO Xiaona, ZHU Kexue, et al.Enrichment of metal chelating peptides from wheat germ protein by immobilizedmetal ion affinity chromatography[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2015, 30(3): 101-105.
[8]富天昕, 张舒, 盛亚男, 等.绿豆多肽锌螯合物的制备及其结构与体外消化的分析[J].食品科学, 2020, 41(4): 59-66.FU Tianxin, ZHANG Shu, SHENG Yanan, et al.Preparation, structure and in vitro digestibility of zinc-chelating mung bean peptide[J].Food Science, 2020, 41(4): 59-66.
[9]孙小东.核桃蛋白肽改善骨质疏松活性评价和钙螯合肽的制备与结构表征[D].昆明: 昆明理工大学, 2021.SUN Xiaodong.Evaluation of osteoporosis improvement activity of walnut protein peptide and preparation and structure characterization of calcium chelating peptide[D].Kunming: Kunming University of Science and Technology, 2021.
[10]林栋, 孙倩, 马立志, 等.核桃多肽-硒螯合物制备工艺优化及其抗氧化活性研究[J].食品科技, 2019, 44(11): 302-307.LIN Dong, SUN Qian, MA Lizhi, et al.Optimized preparation and antioxidant activity of selenium-chelating polypeptides from walnut protein hydrolysate[J].Food Science and Technology, 2019, 44(11):302-307.
[11]SZE-TAO K W C, SATHE S K.Walnuts (Juglans regia L): Proximate composition, protein solubility, protein amino acid composition and proteinin vitro digestibility[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(9): 1393-1401.
[12]阚建全.食品化学[M].3版.北京: 中国农业大学出版社, 2016.KAN Jianquan.Food chemistry[M].3rd ed.Beijing: China Agricultural University Press, 2016.
[13]邓欣伦.核桃蛋白—多糖界面相互作用及其对乳浊液性质影响的研究[D].广州: 华南理工大学, 2016.DENG Xinlun.Walnut protein-polysaccharide interactions at the oil/water interface: Effect on the properties of emulsion[D].Guangzhou: South China University of Technology, 2016.
[14]郑亚军, 王贤, 侯雅馨, 等.莜麦谷蛋白-1酶解物螯合亚铁离子影响因素的研究[J].食品研究与开发, 2021, 42(6): 33-37.ZHENG Yajun, WANG Xian, HOU Yaxin, et al.Effects of different factors on ferrous-chelating ability of naked oat glutelin-1 hydrolysates[J].Food Research and Development, 2021, 42(6): 33-37.
[15]XUE Y T, DING X, WU X Y, et al.Optimization of preparation process and antioxidant activity of the chelate of a Hericium erinaceus polysaccharide with zinc[J].Journal of Food Measurement and Characterization, 2021, 15(2): 2039-2048.
[16]LIAO W Z, LAI T, CHEN L Y, et al.Synthesis and characterization of a walnut peptides-zinc complex and its antiproliferative activity against human breast carcinoma cells through the induction of apoptosis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(7): 1509-1519.
[17]孙南耀.红豆ACE抑制肽的制备及初步纯化和螯合特性的研究[D].南昌: 南昌大学, 2016.SUN Nanyao.The preparation and preliminary purification of ace inhibitory peptides from red bean and study on its chelating properties[D].Nanchang: Nanchang University, 2016.
[18]WANG X, GAO A, CHEN Y, et al.Preparation of cucumber seed peptide-calcium chelate by liquid state fermentation and its characterization[J].Food Chemistry, 2017, 229: 487-494.
[19]王贤.小米糠多肽—亚铁螯合物的制备、结构表征与稳定性研究[D].临汾: 山西师范大学, 2021.WANG Xian.Study on preparation, structure characterization and stability of millet bran peptide-iron chelate[D].Linfen: Shanxi Normal University, 2021.
[20]SUN N, JIN Z Q, LI D M, et al.An exploration of the calcium-binding mode of egg white peptide, Asp-His-Thr-Lys-Glu, and in vitro calcium absorption studies of peptide-calcium complex[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(44): 9782-9789.
[21]邹文昊天.大豆肽锌和大豆肽亚铁螯合物的制备及其特性研究[D].南昌: 南昌大学, 2022.ZOU Wenhaotian.Preparation and properties of soybean peptide zinc chelate and soybean peptide ferrous chelate[D].Nanchang:Nanchang University, 2022.
[22]HOU H, WANG S K, ZHU X, et al.A novel calcium-binding peptide from antarctic krill protein hydrolysates and identification of binding sites of calcium-peptide complex[J].Food Chemistry, 2018,243: 389-395.
[23]蒋雨涵.葡萄籽蛋白与多肽制备及其Ca2+螯合物性质研究[D].天津: 天津科技大学, 2020.JIANG Yuhan.Studies on preparation of grape seed protein and peptide and properties of their Ca2+ chelate[D].Tianjin: Tianjin University of Science & Technology, 2020.
[24]陈濠.灵芝蛋白肽—硒螯合物的制备及性质研究[D].福州: 福建农林大学, 2016.CHEN Hao.Preparation and property research of ganodorma lucidum peptide-selenium chelate[D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2016.
[25]康云, 刘昆仑.米糠肽-铁锌螯合物制备工艺研究[J].食品安全质量检测学报, 2021, 12(16): 6579-6585.KANG Yun, LIU Kunlun.Study on preparation technology of rice bran peptide-iron-zinc chelate[J].Journal of Food Safety & Quality,2021, 12(16): 6579-6585.
[26]WANG Z Y, CHENG S Z, WU D, et al.Hydrophobic peptides from oyster protein hydrolysates show better zinc-chelating ability[J].Food Bioscience, 2021, 41: 100985.
[27]WANG X Q, ZHANG Z, XU H Y, et al.Preparation of sheep bone collagen peptide-calcium chelate using enzymolysis-fermentation methodology and its structural characterization and stability analysis[J].RSC Advances, 2020, 10(20): 11624-11633.
[28]赵立娜, 陈紫红, 陈濠, 等.响应面法优化菌草灵芝多肽-硒螯合物的制备工艺[J].食品科学, 2017, 38(14): 187-192.ZHAO Lina, CHEN Zihong, CHEN Hao, et al.Optimization of chelation of Juncao Ganoderma lucidum peptides with selenium by response surface methodology[J].Food Science, 2017, 38(14): 187-192.