三七[Panax notoginseng（Burk） F.H.Chen]为五加科（Araliaceae）人参属植物[1],广泛生长在中国、缅甸和尼泊尔等地[2],其主要功效部位为根和根茎,具有极高的药用价值[3]。我国含三七的中药制剂超过300 种[4],如云南白药、丹参滴丸、血塞通等,这间接反映了三七的巨大生产需求。三七的代谢产物是其发挥生理作用的物质基础[5],目前已从三七中分离出200多种化合物,其中多糖是三七中含量较高的一类生物活性大分子物质[6],具有多种生物活性,包括免疫调节[7]、抗肿瘤[8]、抗氧化[9]、抗病毒[10]和降糖降脂[11-12]等,并且具有毒副作用小的特点,因此对三七多糖的开发利用越来越受到研究者的重视[13]。
提取是天然多糖在医药和功能性食品行业应用的重要环节,不同提取方法会对多糖的得率、理化特性、结构特性及生物活性有显著影响[14-15]。目前三七多糖的提取方法主要包括传统水浸提法[16]、超声辅助提取法[17]、酶提取法[18]、微波辅助提取法[19]等。其中酶提取法不仅能破坏细胞壁释放胞内多糖,还能水解糖蛋白,并且对多糖的特征官能团骨架结构没有造成损伤,因此酶提取是一种温和、绿色、高效的提取方法[20]。
在生活中,人体与外界污染、辐射等多种环境因素相互作用,产生自由基。然而,过量的自由基会导致癌症、衰老和其他疾病。多糖具有抗氧化作用,能清除体内过量的自由基[21]。有研究显示,多糖的广泛生物活性与自身抗氧化能力密切相关[22]。综上所述,本研究选用α-淀粉酶提取三七多糖（Panax notoginseng polysaccharides,PNP）,通过单因素试验和正交试验探究各工艺因素对PNP提取率的影响,确定最佳提取工艺,对优化提取后的PNP进行理化性质和单糖组成测定,并对PNP的抗氧化活性进行研究,以期为PNP的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三七：市售；α-淀粉酶（酶活10 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖标准品、苯酚：美国Sigma-Aldrich公司；浓硫酸、三氯甲烷、浓盐酸、30%过氧化氢：天津市大茂化学试剂厂；聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量/浓度测定试剂盒：大连美仑生物技术有限公司；半乳糖醛酸标准品、间羟基联苯、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP）、L-抗坏血酸：上海麦克林生化科技有限公司；乙醇、四硼酸钠、水杨酸、三氯化铁：天津市凯通化学试剂有限公司；铁氰化钾：天津市华盛化学试剂有限公司；三氯乙酸：天津市瑞金特化学品有限公司；氢氧化钠：天津市光复科技发展有限公司；三氟乙酸、硫酸亚铁：天津市欧博凯化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2′-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate,ABTS）：福州飞净生物科技公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（723N）：上海仪电分析仪器有限公司；电子分析天平（BY101）：沈阳龙腾电子有限公司；涡旋振荡仪（XW-80A）：上海精科科技有限公司；旋转蒸发仪（RE-52A）：上海亚荣生化仪器厂；台式离心机（80-2）：常州市金坛大地自动化仪器厂；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：巩义市予华仪器有限责任公司；手动单道可调移液器（TopPette）：大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；酶标仪（Multiskan-FC）：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；高效液相色谱仪（1260）：美国安捷伦公司；真空冷冻干燥机（Virtis Wizard 2.0）：美国SP Scientific公司；高速多功能粉碎机（800Y）：武义海纳电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 单因素试验
1.3.1.1 酶解温度对PNP提取率的影响
称取三七粉末置于烧杯中,加入150 mL pH4的邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液,α-淀粉酶添加量为3%,分别在20、30、40、50、60 ℃下恒温水浴加热2 h,并不断搅拌。酶解完成后,100 ℃水浴灭酶5 min,将酶解后的悬浮液以4 000 r/min离心20 min,取上清液加入4 倍无水乙醇沉淀48 h,下层沉淀真空冷冻干燥,得到PNP,并计算提取率。
1.3.1.2 酶解时间对PNP提取率的影响
选择酶解时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,酶解温度50 ℃,其他试验条件按照“1.3.1.1”项下方法进行。
1.3.1.3 酶添加量对PNP提取率的影响
选择酶添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%,酶解温度50 ℃,酶解时间2 h,其他试验条件按照“1.3.1.1”项下方法进行。
1.3.2 正交试验
根据单因素试验结果,以酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶添加量（C）为因素,设计正交试验,进一步优化PNP酶解辅助提取工艺。
表1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平因素C酶添加量/%1 2 3 A酶解温度/℃40 50 60 B酶解时间/h 2.0 2.5 3.0 3 4 5
1.3.3 PNP提取率
PNP提取率（P,%）计算公式如下。
式中：m1为PNP质量,g；m2为三七粉末质量,g。
1.3.4 PNP粗提物理化性质测定
1.3.4.1 总糖含量测定
配制1 mg/mL葡萄糖标准溶液,按比例稀释为100、90、80、70、60、50、40 μg/mL,分别吸取0.2 mL溶液至试管中,分别添加0.2 mL 5%苯酚和1 mL浓硫酸,充分振荡混匀,反应30 min后,使用紫外可见分光光度计在490 nm处测量吸光度,绘制葡萄糖标准曲线,以相同体积的蒸馏水作为空白组。葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.004 2x+0.126 4,r=0.999 1。
配制1 mg/mL PNP溶液,加水稀释成80、60 μg/mL两个浓度PNP母液,其他操作与上述葡萄糖标准溶液一致,PNP粗提物总糖含量（T,%）计算公式如下。
式中：C2为PNP实际测得浓度,μg/mL；C1为PNP母液浓度,μg/mL。
1.3.4.2 糖醛酸含量测定
称取半乳糖醛酸标准品2 mg,加水定容至2 mL,并按照比例稀释成0、20、40、60、80、100 μg/mL半乳糖醛酸溶液,分别吸取0.2 mL半乳糖醛酸溶液,置冰水中加入1.2 mL四硼酸钠-硫酸溶液混匀,后转沸水浴加热5 min,再置冰水浴冷却至室温,再次加入20 μL间羟基联苯溶液,混匀后静置5 min,于波长520 nm处测定吸光度,绘制半乳糖醛酸标准曲线,以相同体积的蒸馏水作为空白组。半乳糖醛酸标准曲线回归方程为y=0.016 8x-0.000 7,r=0.999。
称取PNP配制成100 μg/mL和50 μg/mL的样品溶液,其他操作如上述半乳糖醛酸溶液一致,PNP粗提物糖醛酸含量（Q,%）计算公式如下。
式中：C2为PNP实际测得浓度,μg/mL；C1为PNP母液浓度,μg/mL。
1.3.4.3 蛋白质含量测定
配制2 mg/mL的蛋白标准BSA母液,将其分别稀释至1 500、1 000、750、500、250、125、25 μg/mL,将PNP配制为500 μg/mL溶液,并按照试剂盒要求配制工作液,吸取各浓度蛋白标准溶液和PNP溶液20 μL,依次加入到酶标板中,再依次添加工作液200 μL,在37 ℃的条件下放置30 min,振荡,经酶标仪测定在562 nm处各样品吸光度,绘制标准曲线,半乳糖醛酸标准曲线回归方程为y=0.016 8x-0.000 7,r=0.999。以相同体积的蒸馏水作为空白组,PNP粗提物蛋白质含量（B,%）计算公式如下。
式中：C2为PNP实际测得浓度,μg/mL；C1为PNP母液浓度,μg/mL。
1.3.5 单糖组成测定
称取2 mg PNP,加水溶解后,用2.5 mol/L三氟乙酸水解2 h,氮气吹干后,加入0.3 mL氢氧化钠溶液和0.6 mL PMP-甲醇溶液,充分混匀,置于70 ℃水浴锅中反应30 min。冷却后加入250 μL盐酸中和,再加入等量的三氯甲烷,混匀后,吸取上层水溶液,过0.22 μm滤膜,在高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography,HPLC）上进行分析。
制备单糖标准混合物,其中包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖,采用上述相同的方法进行PMP柱前衍生化处理。
HPLC色谱条件：色谱柱DiKMA C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）,以乙酸铵缓冲液-乙腈（82∶18,体积比）为流动相,流速为1 mL/min,检测波长为245 nm,柱温为35 ℃,进样量为5 μL。
1.3.6 抗氧化活性测定
1.3.6.1 DPPH自由基清除率测定
参照文献[23]的方法,稍作调整,分别配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的抗坏血酸样品溶液和PNP样品溶液,按体积比1∶1加入40 μg/mL DPPH-乙醇工作液,充分混匀后,避光放置30 min显色,在517 nm处测定样品组吸光度A1；将各浓度样品溶液与无水乙醇按1∶1体积比混匀,按同样方法测定对照组吸光度A2；将无水乙醇与DPPH-乙醇工作液按1∶1体积比混匀,按同样方法测定空白组吸光度A0,DPPH自由基清除率（D,%）计算公式如下。
1.3.6.2 ABTS+自由基清除率测定
参照文献[24]的方法,稍作调整。分别配制一系列浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的抗坏血酸样品溶液和PNP样品溶液,各吸取1 mL后加入ABTS工作液3 mL,充分混匀,置于阴暗环境下反应6 min,在734 nm处测定样品组吸光度A1；将ABTS工作液更换为无水乙醇后,测定对照组吸光度A2；将各浓度样品溶液更换为无水乙醇后,测定空白组吸光度A0,ABTS+自由基清除率（A,%）计算公式如下。
1.3.6.3 羟基自由基清除率测定
参照文献[25]的方法,稍作调整。分别吸取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的抗坏血酸样品溶液和PNP样品溶液1 mL,然后依次加入1 mL 10 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液,充分混匀后室温放置10 min,向其中加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,再次混匀,常温避光放置30 min,在510 nm处测定样品组吸光度A1；以蒸馏水代替H2O2溶液,其余步骤相同,测定对照组吸光度A2；以蒸馏水代替各浓度样品溶液,其余步骤相同,测定空白组吸光度A0,羟基自由基清除率（O,%）计算公式如下。
1.4 数据处理
每组试验均重复3 次,采用Office 2019和SPSSAU进行作图和数据分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 酶解温度对PNP提取率的影响
酶解温度对PNP提取率的影响见图1。
图1 不同酶解温度下PNP的提取率
Fig.1 Extraction rate of PNP at different enzymolysis temperatures
由图1可知,PNP提取率随酶解温度增加呈先增加后降低趋势,当酶解温度升高到50 ℃后,PNP提取率快速降低,这是因为较高的温度会加速多糖从细胞中扩散出去,引起热不稳定性,且温度过高会导致酶活性受到破坏,从而使得PNP提取率下降,因此选择40、50、60 ℃进行正交优化试验。
2.1.2 酶解时间对PNP提取率的影响
酶解时间对PNP提取率的影响见图2。
图2 不同酶解时间下PNP的提取率
Fig.2 Extraction rate of PNP under different enzymolysis time
由图2可知,当酶解时间从1.0 h延长至2.5 h时,其提取率也相应增加,2.5 h时多糖提取率达到最大值,为5.39%,随后提取率开始急剧下降。这是因为过长的酶解时间可能会导致提取液饱和而不能进一步提取多糖,还会破坏多糖导致提取率降低。因此选择2.0、2.5、3.0 h进行正交优化试验。
2.1.3 酶添加量对PNP提取率的影响
酶添加量对PNP提取率的影响见图3。
图3 不同酶添加量下PNP的提取率
Fig.3 Extraction rate of PNP with different enzyme dosages
由图3可知,随着酶添加量的增加,PNP的提取率逐渐增加,当酶添加量增加到4%时,提取率达到最大值,然后酶添加量继续增加,提取率下降。这可能是因为过高的酶含量会减少组织内部的扩散距离,导致酶与底物的接触概率增加,多糖随酶浓度的增加而不断溶解,但当酶到达一定浓度时,可酶解的多糖达到极限,多糖的提取率没有提高,并且过高的酶添加量会导致加工成本过高,因此选择3%、4%、5%进行正交优化试验。
2.2 正交试验
正交试验结果见表2,方差分析结果见表3。
表2 正交试验的结果
Table 2 Results of orthogonal test
试验号A酶解温度/℃B酶解时间/h C酶添加量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 PNP提取率/%4.83 4.27 4.11 6.43 3.07 3.78 6.35 3.04 6.21 K2 K3 k1 k2 k3 R 13.21 13.28 15.60 4.40 4.43 5.20 0.80 17.61 10.38 14.10 5.87 3.46 4.70 2.41 11.65 16.91 13.53 3.88 5.64 4.51 1.75
表3 方差分析结果
Table 3 Results of analysis of variance
方差来源自由度A B C离差平方和1.233 8.715 4.736 2 2 2均方0.617 4.357 2.368 F值10.699 75.604 41.090 P值0.085 0.013 0.024
由表2正交试验极差分析可知,影响结果的因素主次顺序为酶解时间>酶添加量>酶解温度,由正交试验所得最佳工艺为酶解温度60 ℃、酶解时间2.0 h、酶添加量4%,此最佳工艺组合并不在正交试验组中,通过验证试验进行三七多糖提取并计算提取率,得到该工艺条件下三七多糖提取率为6.45%,优于正交试验中的最优组,表明该提取工艺稳定,合理可行。由表3方差分析可知,酶解时间和酶添加量P值均小于0.05,表明其显著影响PNP提取率。
2.3 PNP粗提物理化性质测定
PNP粗提物理化指标测定结果见表4。
表4 PNP的理化性质
Fig.4 Standard curve of galacturonic acid %
总糖含量67.33±0.46糖醛酸含量13.47±0.44蛋白质含量12.00±0.23
由表4所示,PNP粗提物总糖含量为67.33%、糖醛酸含量为13.47%、蛋白质含量为12.00%。三七多糖总糖含量测定结果显示,其含量较高,表明多糖成分丰富。糖醛酸含量适中,有助于维持多糖结构的稳定性。蛋白质含量亦不低,为多糖的生物活性提供了物质基础。综合分析,三七多糖成分含量符合标准,具有较高的生物活性及功能价值。
2.4 单糖组成测定
9 种单糖混合标准品组成测定结果见图4。样品单糖组成色谱图见图5。
图4 9 种混合标准品单糖组成色谱图
Fig.4 Chromatogram of nine mixed monosaccharides composition
1.甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.木糖；8.阿拉伯糖；9.岩藻糖。
图5 PNP单糖组成色谱图
Fig.5 Chromatogram of monosaccharide composition of PNP
PNP单糖组成分析见表5。
表5 PNP单糖组成分析
Table 5 Analysis of monosaccharide composition of PNP
单糖种类鼠李糖半乳糖醛酸葡萄糖半乳糖阿拉伯糖保留时间/min 18.92 27.82 32.63 38.11 41.01摩尔百分比/%1.31 6.33 79.06 8.23 5.07
由图4、图5和表5可知,单糖标品混合物按照出峰的时间依次为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖,PNP中含有葡萄糖79.06%、半乳糖8.23%、半乳糖醛酸6.33%、阿拉伯糖5.07%、鼠李糖1.31%。三七为人参属植物,而人参属植物中含有丰富的淀粉粒,这种情况会干扰果胶的提取[26],所以通过α-淀粉酶的酶解作用后,从PNP中提取出大量的淀粉样多糖,还会促进一部分果胶类多糖的释放,因此,PNP的单糖组成以葡萄糖为主,还会有一部分的半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖。
2.5 抗氧化活性测定
2.5.1 DPPH自由基清除活性
DPPH自由基清除活性测定结果见图6。
图6 DPPH自由基清除率
Fig.6 DPPH radical scavenging rate
由图6可知,在0.2～1.0 mg/mL范围内,抗坏血酸对DPPH自由基的清除率高达87.83%～92.13%,在此浓度范围内的PNP对DPPH自由基的清除率为22.03%～36.28%。结果表明,PNP对DPPH自由基的清除能力随浓度升高,呈缓慢平稳升高趋势,并呈现出一定程度的浓度依赖性。
2.5.2 ABTS+自由基清除活性
ABTS+自由基清除活性见图7。
图7 ABTS+自由基清除率
Fig.7 ABTS+ radical scavenging rate
由图7可知,PNP对ABTS+自由基具有一定的清除能力。当浓度在0.2～1.0 mg/mL范围内,PNP对ABTS+自由基清除率表现出明显的浓度依赖性,虽然PNP的ABTS+自由基清除能力不及抗坏血酸,但清除率增长幅度较抗坏血酸明显。
2.5.3 羟基自由基清除活性
羟基自由基清除率测定结果见图8。
图8 羟基自由基清除率
Fig.8 Hydroxyl radical scavenging rate
由图8可知,在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内,抗坏血酸和PNP的羟基自由基清除率均不断升高,但是抗坏血酸始终高于PNP。在1.0 mg/mL浓度下,PNP对羟基自由基的清除能力最强,说明PNP对羟基自由基具有清除作用。
3 结论
本研究采用单因素和正交试验对PNP的酶解辅助提取工艺进行优化,对各因素各水平的变化趋势以及出现的原因进行了讨论,最后确定最佳工艺为酶解温度60 ℃、酶解时间2 h、酶添加量4%,此时提取率为6.45%。对优化提取后的PNP进行理化性质和单糖组成测定,结果总糖含量为67.33%、糖醛酸含量为13.47%、蛋白质含量为12.00%、单糖组成及摩尔百分比分别为葡萄糖79.06%、半乳糖8.23%、半乳糖醛酸6.33%、阿拉伯糖5.07%、鼠李糖1.31%,理化性质测定结果与单糖组成结果基本相一致,其原因可能为α-淀粉酶对PNP解聚反应具有诱导作用,释放大量淀粉样多糖及部分果胶样多糖。PNP对DPPH·、ABTS+·和羟基自由基均有清除作用,清除能力低于抗坏血酸,并且清除率均与浓度呈正相关,当浓度达到1.0 mg/mL时,清除率最高,还会有继续上升的可能性,说明PNP具有抗氧化作用。由此,未来可深入研究酶解辅助提取PNP的分子量、特征官能团和糖苷键连接等,明确其结构,探究PNP中发挥抗氧化作用的主要结构单元,并且进行更加严谨的抗氧化活性测定,为PNP的开发利用提供一定的数据支持和参考。
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