雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是自然界中广泛存在的绿藻,属于团藻目红藻科。雨生红球藻营养价值极高[1],已被广泛应用于食品和饲料行业[2]。雨生红球藻中除了含有较高含量的虾青素,还有10%～15%的藻多糖。
目前雨生红球藻主要用于提取虾青素,提取虾青素后的藻渣通常成为废弃物,但藻渣中仍有较高含量的多糖。大量研究证明,微藻中提取的多糖具有降血脂生物活性且毒副作用低[3]。左绍远等[4]研究发现钝顶螺旋藻多糖能够明显降低糖尿病大鼠血清总胆固醇和甘油三酯含量。Dvir等[5]对紫球藻多糖进行降血脂活性研究,结果表明,紫球藻多糖显著降低了血清胆固醇水平。汪伦记等[6]发现二形栅藻藻渣多糖能显著降低高血脂症大鼠血清中甘油三酯（triglyceride,TG）水平（P<0.01）,具有较好的降血脂作用。因此,从雨生红球藻藻渣中提取具有良好生物活性的多糖,不仅可以减少其对生态环境的污染,还可以提高资源利用率,提高雨生红球藻的应用价值。
本试验以提取虾青素后的雨生红球藻藻渣为原料,采取单因素及响应面相结合的方法对藻渣多糖的提取条件进行优化,进一步提高其多糖提取率,并对提取的多糖进行降血脂试验,以期为雨生红球藻多糖的进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）藻渣：肽爱生物科技（西安）有限公司；胰脂肪酶（932 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；奥利司他（98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠（分析纯）：美国Alfa Aesar公司。
1.2 仪器与设备
UV-1800紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司； HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；Nicolet IS10傅里叶变换红外光谱仪：美国Thermo Fisher 公司；IC413C恒温培养箱：日本雅马拓公司。
1.3 雨生红球藻藻渣多糖的提取
雨生红球藻藻渣与2% NaOH溶液按照1∶25（g/mL）的料液比混匀,200 W超声破碎10 min,80 ℃水浴2 h,8 000 r/min离心10 min取上清液,加入无水乙醇醇沉12 h,离心（8 000 r/min、10 min）取沉淀得到多糖提取物。
1.4 多糖提取率测定
采用蒽酮硫酸法对藻渣多糖含量进行测定[7]。葡萄糖粉末置于恒温培养箱5 h至恒重,分别制备葡萄糖标准溶液和蒽酮硫酸溶液,取100 μL葡萄糖溶液加入300 μL 蒽酮-硫酸溶液,混匀后100 ℃水浴10 min,测定OD620并绘制葡萄糖标准曲线。
吸取一定质量浓度多糖溶液与蒽酮硫酸溶液按质量比1∶3混匀,100 ℃水浴10 min,96孔板中每孔200 μL,检测在620 nm处吸光度。根据标准曲线计算雨生红球藻藻渣多糖提取率（T,%）,计算公式如下。
式中：C为标准葡萄糖浓度,μg/mL；V为粗提液体积,mL；N为稀释倍数；m为雨生红球藻藻渣质量,mg。
1.5 雨生红球藻藻渣多糖提取条件优化
1.5.1 单因素试验设计
考察NaOH质量分数（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]、提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、超声功率（100、150、200、250、300 W）、超声时间（0、5、10、15、20 min）对多糖提取率的影响[8]。
1.5.2 Plackett-Burman试验设计
Plackett-Burman试验是在Box-Behnken中心组合试验前,根据单因素试验结果,筛选显著因子的一种试验设计方法。在单因素试验结果基础上,对提取过程中5 个因素分别设计高水平（1）和低水平（-1）[9],试验设计见表1,根据各因素对多糖提取率显著性分析,以多糖提取率为响应值,对试验结果进行方差分析[10]。
表1 Plackett-Burman试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design
因素水平-1 1 A NaOH质量分数/%2.0 3.0 B料液比/（g/mL）1∶20 1∶30 C提取时间/h 2.0 3.0 D超声功率/W 200 300 E超声时间/min 5 15
1.5.3 Box-Behnken试验设计
根据单因素试验结果,设计Box-Behnken试验,试验设计见表2[11]。
表2 响应面试验因素及水平
Table 2 Factors and levels of response surface design
水平-1因素0 1 X1提取时间/h 2.0 2.5 3.0 X2料液比/（g/mL）1∶20 1∶25 1∶30 X3超声功率/W 200 250 300
1.6 雨生红球藻藻渣多糖除蛋白
取一定质量最优条件下制备的雨生红球藻藻渣多糖于超纯水混匀,加入一定质量的三氯乙酸搅拌2 h,4 ℃过夜,8 000 r/min离心10 min取上清液,无水乙醇醇沉12 h,离心（8 000 r/min、10 min）取沉淀,冷冻干燥,以除去雨生红球藻藻渣多糖中的蛋白质。
1.7 藻渣多糖紫外光谱测定
配制浓度1 mg/mL的雨生红球藻藻渣多糖溶液,紫外分光光度计扫描200～400 nm处的吸光度。
1.8 藻渣多糖红外光谱测定
采用溴化钾压片法进行多糖的红外光谱测定,将1 mg雨生红球藻藻渣多糖与100 mg干燥的溴化钾混匀,研磨后压成透明的薄片,利用红外光谱仪在4 000～500 cm-1范围内进行扫描。
1.9 胰脂肪酶抑制率测定
吸取5 mL磷酸缓冲液和4 mL橄榄油乳化液放入100 mL的锥形瓶中混匀,40 ℃水浴5 min。加入1 mL 0.02 g/mL胰脂肪酶保温5 min。再加入15 mL乙醇。滴加1～2滴酚酞,用0.002 5 mol/L NaOH滴定至溶液呈粉红色,记录NaOH消耗体积。1 mL蒸馏水替换胰脂肪酶作空白组,奥利司他作阳性对照[12]。胰脂肪酶活（U,%）计算公式如下。
式中：A为试验组消耗NaOH的平均体积,mL；B为空白组消耗NaOH的体积,mL；M为NaOH浓度,mol/mL；W为胰脂肪酶的取样量,g；T为反应时间,min。
胰脂肪酶活性抑制率测定：预热结束后,向试验组和空白组加入抑制剂1 mL,再向试验组加1 mL胰脂肪酶,空白组加1 mL蒸馏水反应5 min。抑制率（R,%）计算公式如下。
式中：U为胰脂肪酶活,%；D为抑制后胰脂肪酶活,%。
1.10 数据处理
Plackett-Burman和响应面试验及方差分析采用Design-Expert 10.0.7软件。本试验所作图谱均采用OriginPro 9.1软件作图,且每个试验均进行3次重复。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
葡萄糖标准曲线见图1。
图1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 Standard curve of glucose
如图1所示,葡萄糖标准曲线为y=0.011 35x+0.057 63,其中R2=0.999 74。
2.2 单因素试验结果分析
NaOH质量分数对多糖提取率的影响见图2。
图2 NaOH质量分数对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of NaOH mass fraction on the polysaccharide yield
由图2可知,随着NaOH质量分数的增加,多糖提取率呈先上升后下降的趋势,当NaOH质量分数为2.5%时,多糖提取率达到最大值。一方面,碱液提取有助于破坏细胞壁聚合物分子结构；另一方面,多糖在碱性条件下更易分离[13]。适当的碱液有利于多糖从细胞中释放出来,从而提高多糖提取率。NaOH质量分数大于2.5%时,多糖提取率开始下降。可能是NaOH质量分数过高,破坏了多糖结构进而对多糖提取造成一定损失。因此,根据试验结果,选择NaOH质量分数2.5%为中心试验点。
料液比对多糖提取率的影响见图3。
图3 料液比对多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the polysaccharide yield
由图3可知,在料液比为1∶15（g/mL）时,多糖提取率为3.73%,可能是溶剂添加量较低,碱液与多糖接触不充分,不利于物料内多糖分散到溶剂中,导致提取不彻底。料液比为1∶20～1∶25（g/mL）时,多糖提取率迅速增加；当料液比为1∶25（g/mL）时,多糖提取率最高,为5.24%。料液比为1∶25（g/mL）之后,多糖提取率逐渐下降。当料液比为1∶30（g/mL）时,雨生红球藻藻渣多糖提取率为5.17%,当料液比为1∶35（g/mL）时,雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.96%。可能是碱液过多,导致多糖降解,从而降低了多糖的提取率。因此,根据试验结果,选择料液比1∶25（g/mL）为中心试验点。
超声功率对多糖提取率的影响见图4。
图4 超声功率对多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic power on the polysaccharide yield
由图4可知,超声功率为100～250 W时,多糖提取率逐渐升高,其中超声功率为150～200 W时多糖提取率增加速度缓慢,200～250 W时多糖提取率急速增加,当超声功率为250 W时,多糖提取率最高,为5.10%；随着超声功率继续增加,细胞破裂基本完全,多糖的溶出趋于饱和,再继续增大超声功率,多糖溶出也不会再增加,反而会导致其他非糖物质溶出,对多糖结构造成破坏,导致多糖提取率降低[14]。因此,根据试验结果,选择超声功率250 W为中心试验点。
超声时间对多糖提取率的影响见图5。
图5 超声时间对多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic time on the polysaccharide yield
由图5可知,不采用超声辅助提取得到的多糖提取率最低,超声时间为0～5 min时,多糖提取率由3.27%迅速提升到4.19%,说明超声辅助提取有利于细胞破碎,使多糖提取率提高。随着超声时间的延长,多糖提取率随之增大,当超声时间为10 min时,多糖提取率为4.24%,此时雨生红球藻藻渣多糖提取率达到最大值。在15 min时雨生红球藻藻渣多糖提取率迅速下降,提取率为3.83%,在20 min时雨生红球藻藻渣多糖提取率为3.08%,在细胞完全破碎的条件下,继续延长超声时间,会对多糖的提取造成一定的损失,从而降低多糖提取率。因此,根据试验结果,选择超声时间10 min为中心试验点。
提取时间对多糖提取率的影响见图6。
图6 提取时间对多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of extraction time on the polysaccharide yield
由图6可知,雨生红球藻藻渣多糖提取率存在最大值,当提取时间为1.0 h时雨生红球藻藻渣多糖提取率为1.74%,当提取时间为1.5 h时雨生红球藻藻渣多糖提取率为2.86%,当提取时间为2.0 h时雨生红球藻藻渣多糖提取率为3.16%,当提取时间为2.5 h时出现最大值,此时雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.68%,当提取时间为3.0 h时,雨生红球藻藻渣多糖提取率开始降低,此时雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.64%,可能是提取时间过短导致雨生红球藻藻渣多糖的提取不彻底,另外,碱液与多糖的接触时间过长,可能会破坏多糖结构,使部分多糖降解,对多糖提取率造成影响[15]。因此,根据试验结果,选择提取时间2.5 h为中心试验点。
2.3 Plackett-Burman试验设计及结果
根据单因素结果设计Plackett-Burman试验[16],结果见表3。
表3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments
试验号因素A NaOH质量分数1 2 3 4 1 1-D超声功率-1 E超声时间-1-1 1 1 B料液比1-1 1-1 C提取时间-1-1-1 1 1 1-1 1 1多糖提取率/%4.748 3.734 4.594 3.591
续表3 Plackett-Burman试验设计及结果
Continue table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments
因素试验号5 6 7 8 9 10 A NaOH质量分数-1 E超声时间-1 1 1-1 B料液比-1-1 1-1 C提取时间1-1 1-1-1 D超声功率-1 1-1-1-1 1 1-1 1-11 12-1-1-1 1 1 1-1 1 1 1 1 1 1 1 1 1-1多糖提取率/%3.766 3.964 4.716 3.952 4.757 4.183 3.689 4.169
根据表3分析可得,第9组的多糖提取率最高,雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.757%。
对试验结果进行显著性及方差分析,结果见表4。
表4 Plackett-Burman试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman experiment results
注：*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）。
来源模型自由度A B C D E残差均方2.06 1.67 0.048 0.12 0.22 3.008×10-5 0.018 F值22.85 92.59 2.67 6.64 12.38 1.672×10-3 P值0.000 8<0.000 1 0.153 5 0.042 0 0.012 5 0.968 7显著性******总和平方和2.06 1.67 0.048 0.12 0.22 3.008×10-5 0.11 2.16 5 1 1 1 1 1 6 11
根据表4分析,模型F值为22.85,P<0.01,表明因素对结果影响极显著,根据F值可知各因素影响先后顺序为A>D>C。因此,固定超声时间10 min、NaOH质量分数2.5%,进一步研究料液比、提取时间、超声功率之间的交互作用。
2.4 响应面结果与分析
利用Design-Expert软件的Box-Behnken法设计响应面试验方案,结果见表5。
表5 Box-Behnken试验设计与结果
Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments
试验号因素X3超声功率1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X1提取时间-1 1-1 1-1 1-1 X2料液比-1-1 1 1 0 0 0 0-0 0 0 0-1-1 1 1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1-1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0多糖提取率/%4.452 4.471 4.414 4.496 3.512 3.688 3.862 3.004 3.382 4.115 4.091 3.908 5.844 5.591 5.461 5.934 5.477
根据表5试验结果,运用Design-Expert 10.0.7软件对响应值进行分析,得到回归方程为Y=5.66-0.073X1+0.076X2+0.012X3+0.016X1X2-0.26X1X3-0.21X2X3-0.77X12-0.43X22-1.37X32。
由表6可知,回归模型的P=0.000 1（P<0.01）,对结果影响极显著,失拟项P=0.358 8（P>0.05）不显著,说明该模型充分拟合试验数据,且受未知因素影响小[17],不同因素对多糖提取率的影响顺序为料液比>提取时间>超声功率。该模型变异系数CV为5.28%<10%,R2为0.710 3与R2Adj为0.813 2具有较好的一致性,即差值小于0.2,说明试验结果可靠性高,具有良好的相关性[18]。建立三维数学模型预测因子交互作用与提取率的关系[19]可知,3 个因素中任意两个因素的交互作用,均有最大值存在。
表6 回归方程及方差分析
Table 6 Analysis of variance of the regression equation
注：**表示影响极显著（P<0.01）。
来源模型X1 X2 X3 X1X2 X1X3 X2X3 X12 X22 X32自由度F值25.68 0.76 0.84 0.021 0.018 4.84 3.22 45.34 14.21 143.77 P值0.000 1 0.411 2 0.390 1 0.889 3 0.897 2 0.638 0.115 7 0.000 3 0.007 0<0.000 1显著性********残差失拟项纯误差总和平方和12.77 0.042 0.046 1.152×10-3 0.992 2×10-3 0.27 0.18 2.51 0.79 7.94 0.39 0.20 0.19 13.16 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方1.42 0.042 0.046 1.152×10-3 0.992 2×10-3 0.27 0.18 2.51 0.79 7.94 0.055 0.067 0.047 1.43 0.883 3
当超声功率固定时,料液比与提取时间交互作用见图7。
图7 料液比与提取时间的交互作用
Fig.7 The interaction between solid-to-liquid ratio and extraction time
由图7可知,提取时间一定时,随着料液比增加,雨生红球藻藻渣多糖提取率先增大后减小,造成这一现象的主要原因可能是增大溶剂体积,增大了溶剂溶质接触的面积,使得更多的多糖被提取出来,但过多的溶剂并没有显著提高提取率,反而造成了资源的浪费；在料液比一定时,随着提取时间的延长,多糖提取率先增加后降低,这是因为多糖长时间在碱性环境中易分解；提取时间控制在2.4～2.6 h,此时反应产物较稳定,最优提取时间为2.5 h。由等高线图可知提取时间方向等高线较为密集,表明料液比对雨生红球藻藻渣多糖提取率的影响比提取时间大。
当提取时间固定时,料液比与超声功率交互作用见图8。
图8 料液比与超声功率的交互作用
Fig.8 The interaction between solid-to-liquid ratio and ultrasonic power
由图8可知,料液比一定时,随着超声功率的增大,雨生红球藻藻渣多糖提取率先增大后减小,过高的超声功率可能导致超声波的剪切强度增加,进而导致糖苷键化学结构发生断裂[20],使得多糖提取率降低,因此,250 W为最佳超声功率；超声功率一定时,随着提取溶剂的增加,多糖提取率呈先升高后降低趋势,料液比为1∶25（g/mL）时多糖提取率有最大值,继续增加溶剂体积,雨生红球藻藻渣多糖提取率开始下降,表明此时细胞内外多糖物质已达溶解平衡。由等高线图可知料液比方向等高线较为密集,表明料液比对雨生红球藻藻渣多糖提取率的影响比超声功率大。
当料液比固定时,提取时间与超声功率交互作用见图9。
图9 提取时间和超声功率的交互作用
Fig.9 The interaction between extraction time and ultrasonic power
由图9可知,提取时间一定时,随着超声功率的增大,雨生红球藻藻渣多糖提取率呈先上升后下降趋势；超声功率一定时,最佳提取时间为2.5 h,当提取时间为3.0 h时,雨生红球藻藻渣多糖提取率开始降低,推测原因可能是过多的溶剂在提取有效成分的同时,也会增加其他可溶性成分的溶出,过长的浸提时间可能导致部分多糖降解为低聚糖、寡糖或单糖,造成多糖提取率下降[21]。由等高线图可知提取时间方向等高线较为密集,表明提取时间对雨生红球藻藻渣多糖提取率的影响比超声功率大。
2.5 响应面结果验证
根据软件预测雨生红球藻藻渣多糖最佳提取方案为料液比1∶24.763 （g/mL）、超声功率250.113 W、提取时间2.543 h,得到多糖提取率为5.666%。根据实际将条件调整为料液比1∶25 （g/mL）、超声功率250 W、提取时间2.5 h,在此条件下,得到多糖提取率为（5.744±0.030）%,这和预测值5.666% 较接近,因此该模型可较好地预测和模拟雨生红球藻藻渣多糖的提取率及最佳的提取工艺。
2.6 藻渣多糖紫外光谱分析
藻渣多糖紫外光谱见图10。
图10 雨生红球藻藻渣多糖紫外光谱分析
Fig.10 UV spectrum of polysaccharide from Haematococcus pluvialis residue
如图10所示,多糖溶液在260～280 nm处并无蛋白质及核酸特征吸收峰,说明除去了多糖中杂质。
2.7 藻渣多糖的红外光谱分析
藻渣多糖的红外光谱见图11。
图11 雨生红球藻藻渣多糖红外光谱
Fig.11 Spectrum of polysaccharide from Haematococcus pluvialis residue
如图11所示,3 405.28 cm-1处出现的吸收峰是由于OH—的伸缩振动引起的[22],2 931.28 cm-1是C—H的特征吸收峰[23],1 645.45 cm-1附近的吸收峰为C O的非对称伸缩振动峰,说明存在糠醛酸[24-25]；在1 155.12、1 081.40、1 024 cm-1处分别是C—O—C、C—O—H、C—C的伸缩振动吸收峰,说明雨生红球藻藻渣多糖具有吡喃环结构[26-27]；D-吡喃葡萄糖的吸收峰在930.87 cm-1,849.80 cm-1是α-型糖苷键的特征吸收峰[28-29]。综上所述,雨生红球藻藻渣多糖为含有吡喃环结构α-型多糖。
2.8 藻渣多糖对胰脂肪酶抑制作用
藻渣多糖对胰脂肪酶抑制作用见图12。
图12 雨生红球藻藻渣多糖对胰脂肪酶的抑制率
Fig.12 Inhibition rate of polysaccharide from Haematococcus pluvialis residue on pancreatic lipase
由图12可知,随着多糖浓度的增加雨生红球藻藻渣多糖对胰脂肪酶抑制作用呈上升趋势,多糖浓度从0.5 mg/mL增加到3 mg/mL时,对胰脂肪酶的抑制率迅速上升,从3 mg/mL增加到5 mg/mL时,增长速度减缓。当多糖浓度为5 mg/mL时,其对胰脂肪酶抑制率可达到（94.19±0.02）%。
3 结论
本试验对雨生红球藻藻渣多糖的提取工艺及降血脂活性进行研究。结果表明,藻渣多糖最佳提取条件为NaOH质量分数2.5%、超声功率250 W、提取时间2.5 h、超声时间10 min、料液比1∶25 （g/mL）,在此条件下,多糖的提取率为（5.744±0.030）%。提取的藻渣多糖有较好的降血脂活性,多糖浓度在5 mg/mL时,对胰脂肪酶活性抑制率达到（94.19±0.02）%。
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