海带又称江白菜、昆布,属于藻类植物,是我国丰富的水产资源之一,主要分布于我国沿海地区,大多来源于养殖[1]。相关研究表明海带具有多种功能性成分,例如多糖、氨基酸、微量元素、脂肪酸等,其中海带多糖含有褐藻胶、岩藻多糖和褐藻淀粉,具有抗氧化、降糖、降压、抗病毒、抗癌、降血脂、提高机体免疫力、调节肠道菌群等生物功能特性,被称为“长寿食品”[2-3],因而海带多糖除了有食用价值外,还具有功能活性。
目前,提取海带多糖的方法主要有水提法、酸提法、碱提法以及酶提法,提取方式有超声辅助提取、微波辅助提取等[4]。水提法能耗高、耗时长,Liu等[5]采用80 ℃加热3 h的条件水提岩藻多糖,得率为（4.63±0.40）%；酸提法耗时短、易操作,但易造成多糖分解。Sun等[6]使用柠檬酸提取海藻粉,80 ℃浸提两次,岩藻多糖得率为11.23%；碱提法得率高,但后续分离困难,Vauchel等[7]用4%的碳酸钠提取海藻中的褐藻酸钠,得率为38%；酶提法效率高,但成本较高,崔艳丽等[8]使用复合酶提取岩藻多糖,30 ℃条件下使用1%的酶提取1.5 h,得率为13.9%；超声辅助提取则是利用超声波破解细胞壁使得多糖溶出,可有效地提取海带多糖,宋海燕等[9]使用响应面优化鹿角藻中岩藻多糖的提取工艺,超声处理20 min后,91 ℃加热5 h,岩藻多糖得率为5.96%；微波辅助提取是通过微波诱导使物质细胞壁破裂,细胞内物质溶出,应瑞峰等[10]使用微波辅助提取巨藻中的褐藻酸盐,得率为18.24%。
低共熔溶剂（deep eutectic solvent,DES）是由一定摩尔比的氢键受体和氢键供体构成的两组分或多组分的低共熔混合体系,熔点低于任一组分,常温下为熔融态。DES属于新型的绿色溶剂体系,有着广阔的应用前景,制备简单快捷、成本低廉、毒性小,与其他的有机溶剂相比更加安全和环保[11]。对酚酸类、黄酮类、多糖类物质等均有良好的提取能力,在食品领域中的应用较为广泛。研究发现DES提取多糖的得率高、纯度高,杂质较少[12-13]。Nie等[14]采用一种DES对海带多糖进行提取,结果表明DES去除蛋白质和碳酸钙能力更强。本研究以海带为研究对象,选用超声辅助DES法进行海带多糖提取工艺的优化,并对其抗氧化活性进行评价,以期为海带及其多糖的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海带：产自福建连江,冲洗干净晾干后研磨成粉末,过60 目筛后置于干燥器中备用。
氯化胆碱、尿素、三乙二醇：上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐[2,2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） ,ABTS]（纯度均≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；甘油、乙二醇、乳酸、DL-苹果酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柠檬酸：天津市恒星化学试剂制造有限公司；脯氨酸、抗坏血酸：国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TG16-WS离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JEA502分析天平：上海浦春计量仪器有限公司；KQ-250E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DF-101S集热式磁力加热搅拌器：河南予华仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；101-2AB电热鼓风干燥箱、FW80高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；UV-2000紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 DES的制备
按照表1摩尔比制备含水量为20%的DES体系,80 ℃磁力搅拌至完全溶解,形成均匀透明的溶剂后备用。
表1 DES的种类及构成
Table 1 Types and composition of DES
编号DES-1 DES-2 DES-3 DES-4 DES-5 DES-6 DES-7 DES-8组成氯化胆碱∶尿素氯化胆碱∶三乙二醇氯化胆碱∶甘油氯化胆碱∶乙二醇氯化胆碱∶乳酸氯化胆碱∶柠檬酸氯化胆碱∶DL-苹果酸氯化胆碱∶脯氨酸∶苹果酸摩尔比1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 1∶1∶1
1.3.2 多糖标准曲线的制作
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[15],在490 nm测定吸光度,绘制多糖标准曲线,方程为y=0.006 66x-0.024 76,R2=0.998 57。
1.3.3 海带多糖的提取及其含量测定
参考倪玉娇等[15]的提取方法,取1.0 g海带粉末于样品瓶,加入一定质量的DES溶剂,于一定温度下超声,8 000 r/min离心10 min,取上清液,加入4倍体积无水乙醇于4 ℃环境中醇沉过夜后,8 000 r/min离心10 min收集沉淀,用无水乙醇洗涤沉淀2 次后,继续8 000 r/min离心10 min收集沉淀,沉淀物加水溶解定容至100 mL,测量其多糖提取量[16]。依标准曲线方程计算海带多糖提取量,公式如下。
式中：X为海带多糖提取量,mg/g；C为海带多糖浓度,mg/mL；V为提取液体积,mL；N为稀释倍数；m为样品海带质量,g。
1.3.4 单因素试验及响应面优化试验
探究DES-5含水量（10%、20%、30%、40%、50%）、DES-5摩尔比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、固液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 （g/mL）]、温度（60、70、80、90、100 ℃）、超声时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）对海带多糖提取量的影响。
基于单因素试验结果,选取温度、摩尔比、含水量为考察因素,利用Box-Behnken DES-5设计三水平三因素的响应面优化试验,如表2所示。
表2 响应面因素水平设计
Table 2 Design of response surface factors and levels
水平-1因素0 1 A温度/℃80 90 100 B DES-5摩尔比1∶1 1∶2 1∶3 C DES-5含水量/%10 20 30
1.3.5 多糖的抗氧化活性
1.3.5.1 DPPH自由基清除能力
参考Zhang等[17]的方法并进行适当修改。将1.0 mL不同质量浓度的海带多糖溶液（0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/mL）溶于2.0 mL体积分数 95%乙醇溶液的DPPH （0.1 mmol/L）中,以抗坏血酸为阳性对照,在室温下摇匀,避光保存30 min后,于517 nm处测定吸光度。每组样品3 次平行试验。DPPH自由基清除率（R1,%）计算公式如下。
式中：A0为空白组的吸光度（蒸馏水代替多糖溶液）；A1为样品组的吸光度；A2为对照组的吸光度（体积分数95%乙醇溶液代替DPPH溶液）。
1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力
参考Yeung等[18]的方法并进行适当修改。将7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的硫酸钾（1∶1,体积比）避光反应12～16 h,生成ABTS+自由基。用去离子水稀释,当ABTS工作液在734 nm处吸光度为0.70±0.02时待用。将1.0 mL多糖溶液（0.4、1.2、2.0、2.8、3.6 mg/mL）溶于4.0 mL ABTS溶液后,以抗坏血酸为阳性对照,在避光条件下孵育6 min,于734 nm处测定样品吸光度。每个样品进行3 次重复试验。ABTS+自由基清除率（R2,%）计算公式如下。
式中：A0为空白组的吸光度（蒸馏水代替多糖溶液）；A1为样品组的吸光度；A2为对照组（蒸馏水代替ABTS溶液）的吸光度。
1.3.5.3 羟基自由基清除能力（hydroxy free radical scavenging activity,HRSA）
参照文献[19]的方法,略有改动。将提取的海带多糖配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL溶液,1 mL样品溶液加入2 mL 6 mmol/mL硫酸亚铁溶液和1 mL 6 mmol/mL过氧化氢溶液,混合均匀,静置10 min,加入2 mL 6 mmol/mL的水杨酸-乙醇溶液和2 mL去离子水,混匀后在30 ℃静置30 min后,5 000 r/min离心5 min,取上清液于510 nm波长处进行混合溶液吸光度测定,平行测定3 次,取平均值。以同等浓度的VC作阳性对照。羟基自由基清除率（R3,%）计算公式如下。
式中：A1为样品组的吸光度；A2为对照组的吸光度；A0为空白组的吸光度。
1.3.5.4 铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）
参照文献[20]的方法,略有改动,1 mL样品溶液（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH6.6）和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液,50 ℃水浴20 min,冷却至室温后加入2.5 mL 0.1 g/mL的三氯乙酸溶液,混匀静置10 min,取2.5 mL上清液加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.001 g/mL的氯化铁溶液混匀,静置反应10 min,在700 nm波长处测定吸光度,吸光度表示铁离子还原能力,以相同浓度的VC作阳性对照。
1.4 数据处理
本试验数据以平均值±标准差表示。单因素方差分析评估显著性,组间数据在0.05水平的显著性差异通过SPSS 19.0软件采用Duncan（D）进行分析。P值为0.05作为显著性的阈值。
2 结果与分析
2.1 DES的筛选
不同类型DES对海带多糖提取的影响如图1所示。
图1 DES类型对海带多糖提取量的影响
Fig.1 Extraction yield of Laminaria japonica polysaccharides from different types of deep eutectic solvents
不同字母表示样品间具有显著性差异（P<0.05）。
由图1可知,氯化胆碱-乳酸构成的DES-5对海带多糖的提取效果最好,海带多糖提取量为（31.57±2.02） mg/g,高于其它种类；其次为DES-8（由氯化胆碱-脯氨酸-苹果酸构成）,多糖提取量为（24.48±0.19） mg/g；多糖提取量最少的是DES-2（由氯化胆碱-三乙二醇构成）,为（9.45±0.96） mg/g。综上,DES溶剂依照类型对海带多糖提取效果依次为酸性DES>碱性DES>中性DES。分析其原因,可能是酸性溶剂体系容易破坏细胞壁的结构,溶剂体系的黏度适中,溶质分散均匀,多糖易于溶出；碱类DES溶剂破坏细胞壁的能力弱于酸类,提取量相对较少[21]；而中性类溶剂不利于多糖溶出。故选取DES-5为后续提取海带多糖的提取溶剂,做进一步探究使用。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 DES-5含水量对海带多糖提取量的影响
固定固液比1∶30 （g/mL）、温度70 ℃、超声时间1.0 h、DES-5摩尔比1∶2,探究含水量对海带多糖提取量的影响,结果如图2所示。
图2 DES-5不同含水量对海带多糖提取量的影响
Fig.2 Effect of DES-5 different water content on Laminaria japonica polysaccharide extraction
不同字母表示样品间具有显著性差异（P<0.05）。
由图2可知,随着DES-5含水量的增加,海带多糖提取量呈先增加后减少的趋势,当含水量达20%时,海带多糖提取量最高,为（36.91±0.93） mg/g。原因可能为含水量过少时,提取液有较高的黏度和糊状稠度,溶质与溶剂接触不充分,多糖溶出有一定困难,含水量高于20%后,DES溶剂与多糖的氢键作用逐渐减弱,多糖的溶出量随之减少[22]。因此选择DES-5含水量10%、20%、30%进行响应面优化试验。
2.2.2 DES-5摩尔比对海带多糖提取量的影响
固定固液比1∶30（g/mL）、温度70 ℃、超声时间1.0 h、DES-5含水量为20%,探究DES-5摩尔比对海带多糖提取量的影响,结果如图3所示。
图3 不同DES-5摩尔比对海带多糖提取量的影响
Fig.3 Effect of different molar ratio of DES-5 on Laminaria japonica polysaccharide extraction
不同字母表示样品间具有显著性差异（P<0.05）。
由图3可知,随着体系中乳酸量的增加,多糖提取量呈先增加后减小的趋势,当DES-5摩尔比为1∶2时,海带多糖提取量最高,为（39.54±0.10） mg/g,可能因为随着乳酸含量增加,溶剂体系黏度降低,促进了多糖的渗出,但乳酸含量达到一定程度时,氢键供体和氢键受体数量不平衡,酸性增强,导致多糖部分降解[22]。因此选择DES-5摩尔比1∶1、1∶2、1∶3进行响应面优化试验。
2.2.3 固液比对海带多糖提取量的影响
固定DES-5含水量20%、温度70 ℃、超声时间1 h、DES-5摩尔比1∶2,探究固液比对海带多糖提取量的影响,结果如图4所示。
图4 不同固液比对海带多糖提取量的影响
Fig.4 Effect of different solid-to-liquid ratio on Laminaria japonica polysaccharide extraction
不同字母表示样品间具有显著性差异（P<0.05）。
由图4可知,随着溶剂体积的增加,多糖提取量呈先增加后逐渐平稳的趋势,当固液比1∶40（g/mL）,此时提取量为（35.18±0.34）mg/g。原因可能是,当溶剂用量占比较少时,海带粉与DES-5溶剂接触机会小,随着固液比中溶剂用量的增加,二者接触面增大,接触更充分[4],当固液比为1∶40（g/mL）时,海带多糖的提取量趋向于稳定状态,另外溶剂的过多使用易造成浪费和提取成本的提高,同时给后续的分离及应用带来困难[5]。因此固液比固定为1∶40（g/mL）。
2.2.4 温度对海带多糖提取量的影响
固定DES-5摩尔比1∶2、DES-5含水量20%、固液比1∶40 （g/mL）、超声时间1.0 h,探究温度对海带多糖提取量的影响,结果如图5所示。
图5 不同温度对海带多糖提取量的影响
Fig.5 Effect of different temperature on Laminaria japonica polysaccharide extraction
不同字母表示样品间具有显著性差异（P<0.05）。
由图5可知,随着温度的升高,多糖提取量呈现逐渐增加的趋势,当温度为90 ℃,多糖提取量为（38.41±0.76） mg/g。由于升高温度导致样品中多糖溶出速率增加和溶剂扩散速率增大,从而海带多糖提取量提高,然而,较高的温度会导致海带多糖活性成分下降,并且能耗高[18]。因此选取80、90、100 ℃进行响应面优化试验。
2.2.5 超声时间对海带多糖提取量的影响
固定DES-5含水量20%、固液比为1∶40 （g/mL）、温度90 ℃、DES-5摩尔比1∶2,探究超声时间对海带多糖提取量的影响,结果如图6所示。
图6 不同超声时间对海带多糖提取量的影响
Fig.6 Effect of different ultrasonic extraction time on Laminaria japonica polysaccharide extraction
不同字母表示样品间具有显著性差异（P<0.05）。
由图6可知,当超声时间为2.0 h时,提取量最大,为（48.86±0.08）mg/g。海带多糖提取量的变化呈现先增加后降低的趋势,原因可能为超声时间过短,海带多糖尚未充分溶出；随超声时间的延长,多糖部分受热分解,结构遭到破坏,提取量呈现稍微下降的趋势[6],同时延长超声时间会导致生产效率的下降。因此选择超声时间2.0 h为宜。
2.3 响应面优化设计
2.3.1 响应面试验设计及结果
以海带多糖提取量为评价指标,设计三因素三水平分析试验,试验结果如表3所示。
表3 响应面设计及结果
Table 3 Response surface design and results
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A温度/℃80 100 80 100 80 100 80 100 90 90 90 90 90 90 90 90 90 B DES-5摩尔比1∶1 1∶1 1∶3 1∶3 1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 1∶1 1∶3 1∶1 1∶3 1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 1∶2 C DES-5含水量/%20 20 20 20 10 10 30 30 10 10 30 30 20 20 20 20 20多糖提取量/（mg/g）36.37±0.21 43.13±0.85 25.96±0.79 43.03±0.25 26.81±0.50 47.86±0.26 33.04±0.10 34.47±0.67 42.01±0.49 39.05±0.18 45.05±0.33 30.96±0.17 55.67±0.29 56.93±0.56 53.54±0.72 57.39±0.24 58.81±0.96
2.3.2 回归模型显著性检验及方差分析
运用响应面软件对表3数据进行拟合,以多糖提取量作为响应值,得到二次多项回归方程：多糖提取量=-1 041.769 25+21.805 58A+10.168 50B+8.573 97C+0.257 75AB-0.049 050AC-0.278 25BC-0.115 34A2-7.811 50B2-0.093 890×C2。
海带多糖提取量响应面试验的回归模型方差分析见表4。
表4 海带多糖提取量响应面试验回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model in response surface test of Laminaria japonica polysaccharide extraction
注：**表示影响极显著,P<0.01；*表示影响显著,P<0.05。
来源模型A温度B DES-5摩尔比C含水量AB AC BC自由度显著性*******A2 B2****C2 F值66.04 85.73 30.36 5.96 8.5 30.78 9.9 179.13 82.16 118.7 P值<0.000 1<0.000 1 0.000 9 0.044 7 0.022 5 0.000 9 0.016 2<0.000 1<0.000 1<0.000 1****残差失拟方差误差总和平方和1 858.54 268.08 94.94 18.64 26.57 96.24 30.97 560.14 256.92 371.17 21.89 6.13 15.76 1 880.43 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均值206.5 268.08 94.94 18.64 26.57 96.24 30.97 560.14 256.92 371.17 3.13 2.04 3.94 0.52 0.691 7
根据表4可知,由F值可得到三者对多糖提取量影响的主次顺序为温度>DES-5摩尔比>DES-5含水量,且温度、DES-5摩尔比影响极显著,DES-5含水量影响显著。模型均方差P<0.000 1,表明该回归模型极显著；R2=0.988 4,R2Adj=0.973 4,R2Pre=0.934 7,信噪比22.973,回归方程拟合度和可信度均较高,能很好地对多糖提取量进行预测,即该模型可用于海带多糖提取工艺的优化。
2.3.3 交互作用分析
各因素交互作用对海带多糖提取量的影响见图7。
图7 因素交互作用对海带多糖提取量的影响
Fig.7 Response surface plots for the interaction effects on the extraction yield of Laminaria japonica polysaccharide
由图7可知,响应面陡峭,等高线图呈椭圆形,说明两者交互作用对海带多糖提取量影响显著。温度-DES-5摩尔比、温度-含水量响应面均陡峭趋势,等高线图呈椭圆形,表明两两交互作用对海带多糖的提取均有显著影响,与表4方差分析结果一致。
2.3.4 多糖提取工艺参数的验证
根据响应面软件分析优化出的工艺为温度92.6 ℃、DES-5摩尔比1∶1.84、DES-5含水量18.74%,预测多糖提取量为57.59 mg/g。基于实际操作情况,调整为温度93 ℃、DES-5摩尔比1∶2、DES-5含水量20%,经过验证试验,测得海带多糖提取量为（58.34±0.67）mg/g,与预测结果相近,该工艺条件可用于提取海带多糖。
2.4 抗氧化活性分析
不同浓度的海带多糖对ABTS+自由基、DPPH自由基、羟基自由基的清除能力和铁离子还原能力如图8所示。
图8 不同浓度海带多糖的抗氧化能力和还原能力
Fig.8 Antioxidant capacity and reducing capacity of Laminaria japonica polysaccharides in different mass concentrations
（a）ABTS+自由基清除率；（b）DPPH自由基清除率；（c）羟基自由基清除率；（d）FRAP。
由图8可知,海带多糖的抗氧化能力随着浓度提高而增强。当海带多糖浓度为3.0 mg/mL时,其ABTS+自由基的清除率最高,为96.05%；DPPH自由基的清除率最高,为71.04%。海带多糖清除DPPH自由基的半抑制质量浓度（IC50值）为1.53 mg/mL,而ABTS+自由基的IC50值为0.91 mg/mL,由此表明,海带多糖对ABTS+自由基的清除活性更高。当海带多糖浓度为3.5 mg/mL时,羟基自由基清除率为96.01%、FRAP为1.12,表明海带多糖同时具有羟基自由基清除能力和铁离子还原能力。
前期研究表明,多糖可通过清除自由基来防止氧化应激[23-24],本研究也证实了该结论。图8结果表明海带多糖具有抗氧化能力。此外,研究发现多糖的抗氧化性与抑制自由基链反应的还原能力有关[25]。结果表明海带多糖有较强的铁离子还原能力,可能是因海带多糖中的糖醛酸含量丰富,醛羟基与Fe3+反应。综上所述超声辅助DES提取的海带多糖具有抗氧化的潜力,可作为抗氧化剂开发使用。
3 结论
本研究借助超声辅助DES法提取海带多糖,选取氯化胆碱-乳酸构成的DES为提取溶剂,在单因素研究的基础上,固定超声时间2 h、固液比1∶4 （g/mL）,通过响应面优化得到海带多糖最优提取工艺为温度93 ℃、DSE-5摩尔比1∶2、含水量20%,此条件下海带多糖的提取量为（58.34±0.67） mg/g；抗氧化试验表明,海带多糖对DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力的IC50值分别为1.53 mg/mL和0.91 mg/mL,当海带多糖浓度为3.5 mg/mL时FRAP为1.12,羟基自由基的清除率为96.01%,均展现出良好的抗氧化活性,本研究为进一步开发和利用海带多糖资源提供了理论依据和技术参考。
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