葡萄酒的有机酸是葡萄酒pH值的主要决定因素,并影响葡萄酒的外观、微生物稳定性和化学稳定性,其对味道（特别是酸味）有直接的影响。L-酒石酸、L-苹果酸、柠檬酸、L-乳酸、琥珀酸和乙酸占葡萄酒中有机酸的95%以上,除乙酸外,其余是非挥发性的有机酸[1]。L-酒石酸和L-苹果酸在葡萄生长早期形成,一般在葡萄酒酒精发酵后浓度最高。葡萄果实柠檬酸含量约为0.10～0.15 g/L,柠檬酸和琥珀酸是酒精发酵的典型产物。L-乳酸在葡萄酒中的含量约为0～3 g/L,是苹果酸-乳酸发酵的副产物,口感比苹果酸更加圆润柔和,能够降低葡萄酒pH值,起到抑制有害细菌的作用；还可以进一步与葡萄酒中的硫酸盐结合形成稳定的乳酸盐,减少一氧化硫的产生,从而降低葡萄酒在储存过程中可能出现的变质风险,有助于增强葡萄酒的储存稳定性[1]。葡萄酒有机酸含量受葡萄品种、气候、种植方式、发酵条件等因素影响[2],葡萄的感官品质以及葡萄酒的品质、风味和稳定性,在很大程度上取决于葡萄浆果中糖分和有机酸的含量和组成[3],其中有机酸是影响葡萄酒协调性和稳定性的重要化合物,过低的酸度会导致酒味沉闷,不易贮藏,过高的酸度会导致酒体粗犷消瘦[4-5]。
大量的生产实践表明,新疆产区葡萄果实表现出“糖高酸低”且成熟迅速的特点,葡萄酒在贮藏期间容易出现颜色退化过快、香气和口感过早衰退现象,这与该地气候干燥、昼夜温差大、水分容易蒸发有密切关系,糖度过高致使酒精度偏高,酸度过低则会使葡萄酒颜色黯淡无光,口感单调、不清新[6-7]。目前,在气候温暖的地区,葡萄酒酸度不足通常是通过添加符合标准的有机酸进行矫正。另外,酿酒师会选择基于离子交换的物理酸化或与未达到商业收获期采收的葡萄酿造的葡萄酒混合补充酸度[8],但由于对劳动力和设备的额外要求以及某些情况下会影响人们的选择,如用早熟的葡萄酿造的葡萄酒会产生生青味,人们更喜欢成熟浆果香气,因此,这些方法受到一定的限制。相比之下,使用微生物来增加葡萄酒的酸度是低成本且简便的解决方法[9]。
耐热克鲁维酵母是一种高产乳酸的非酿酒酵母,在葡萄酒酿造中能够实现有效增酸,同时降低pH值,其产乳酸能力高于乳酸菌。此外,耐热克鲁维酵母高产乳酸的性质会促进乳酸乙酯的合成,乳酸乙酯能够赋予葡萄酒水果香气以及奶油香气,对于葡萄酒香气也具有积极的贡献。ConcertoTM CT10属于耐热克鲁维酵母,它不仅可以高产乳酸增加酸度,还能高产具有新鲜草莓香气的异丁酸乙酯[10]。目前,新疆产区酿酒葡萄“糖高酸低”使葡萄酒潜在品质表现不全,耐热克鲁维酵母在葡萄酒中的实际应用价值尚未被重视。因此,通过耐热克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵赤霞珠干红葡萄酒,探讨其对赤霞珠干红葡萄酒有机酸含量和感官品质的影响,以期为解决新疆产区酿酒葡萄因“糖高酸低”导致该产区酒体潜在品质表现不全面的问题提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
25 °Brix赤霞珠葡萄：于2021年9月26日采自新疆天山北麓产区张裕巴保男爵酒庄；商业酿酒酵母FX10：法国拉氟德公司；耐热克鲁维酵母ConcertoTM CT10：丹麦科汉森集团；L-酒石酸、L-苹果酸、柠檬酸、L-乳酸、琥珀酸（纯度均≥98%）、果胶酶（500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国赛默飞世尔科技有限公司；偏重亚硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；超纯水：Milli-Q系统制备。
1.2 仪器与设备
LC-20AB高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器：日本岛津公司；GL-20G-II离心机、TGL-16G高速离心机：上海安亭科学仪器有限公司；WineScanTMFlex葡萄酒成分快速分析仪：丹麦福斯有限公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；LE203E电子天平、FE22 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Milli-Q系统：上海默克化工技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 葡萄酒酿造
将酿酒葡萄赤霞珠除梗破碎后分别置于15 个5 L玻璃发酵罐中,添加80 mg/L偏重亚硫酸钾,30 min后添加200 mg/L果胶酶,冷浸渍24 h后,分别接种活化好的耐热克鲁维酵母CT10 150、200、250 mg/L（CT150、CT200、CT250）,只接种酿酒酵母FX10 200 mg/L（CK）,同时接种耐热克鲁维酵母CT10和酿酒酵母FX10各200 mg/L（TF200）,以CK作为对照组,发酵温度保持20～25 ℃,每个处理做3 次平行试验。当葡萄酒比重下降至1.000时,除CK、TF200外,分别接种200 mg/L酿酒酵母FX10,当葡萄酒比重下降至0.994时视为酒精发酵结束进行取样,苹果酸-乳酸发酵后装瓶,陈酿半年后分别取样进行检测。
1.3.2 基础理化指标测定
使用葡萄酒成分快速分析仪测定,取澄清酒样20.0 mL于试管中,将其置于分析仪探头下方测定酒精度、pH值、残糖含量、总酸含量及挥发酸含量。
1.3.3 有机酸含量测定
样品处理：取5.0 mL酒样于10.0 mL离心管中,于12 000 r/min、4 ℃离心15 min,取上清液,用超声波去除样品内小气泡,用0.45 μm滤膜过滤,用流动相稀释10倍后进行分析。
色谱条件：色谱柱为Diamonsil ODS（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相为0.02 mol/L 磷酸二氢钾-乙腈（98∶2,体积比）,用磷酸调pH值至2.3,采用等度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长为210 nm,柱温30 ℃,进样量10.0 μL。
定量方法：以峰面积为横坐标,有机酸浓度为纵坐标,绘制有机酸标准曲线,按回归方程计算葡萄酒中5 种有机酸的含量。有机酸的标准曲线为L-酒石酸：y=2×106x+40 227,R=0.999 7；L-苹果酸：y=1×106x+27 857,R=0.999 4；L-乳酸：y=511 891x+30 363,R=0.999 1；柠檬酸：y=1×106x+28 742,R=0.999 9；琥珀酸：y=391 291x+15 536,R=0.997 0。
1.3.4 CIELab参数测定
CIELab参数的测定参考董荣等[11]的方法。
1.3.5 感官评价方法
由10名葡萄酒专业人员依据《中国葡萄酒品评标准》[12]对葡萄酒进行评价,评价标准见表1。
表1 葡萄酒感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of wine
评价指标颜色香气单宁典型性等级优V1良V2合格V3不合格V4优V1良V2合格V3不合格V4优V1良V2合格V3不合格V4优V1良V2合格V3不合格V4评分标准酒体澄清透亮,呈现深紫红色,酒体饱满、层次感丰富酒体澄清透亮,呈现紫红色,酒体较为丰满、细腻酒体澄清、略失光,呈现淡宝石红色,酒体饱和度略低酒体浑浊、失光,有明显黄褐色和色素沉淀香气浓郁复杂,具有果香、花香、奶油香,新鲜草莓香气突出,无明显的挥发酸气味香气较协调,具有果香、花香、奶油香,具有新鲜草莓香气,无明显的挥发酸气味香气薄弱,具有果香味,花香、奶油香较弱,无明显的挥发酸气味香气很弱,没有果香、花香、奶油香,有明显挥发酸气味单宁充沛,入口圆润,酒体结构紧实单宁强健,入口较为丝滑,酒体口感平衡略带沙粒感、生青感,口感较为柔顺单宁粗犷、僵硬、干涩,酒体失去平衡香气浓郁复杂,口感圆润丰满,酸度适宜,具有典型的赤霞珠醇香香气较浓郁,口感柔顺,酸度较为适宜,具有赤霞珠醇香香气舒适,口感较为单一,酸度略尖锐,赤霞珠醇香略淡果香不明显,口感粗犷、酸味不平衡、尖硬,没有典型性
1.3.6 模糊数学感官评价模型的建立
参照彭昕等[13]的方法建立模糊数学感官评价模型。设U为因素集,以葡萄酒的颜色、香气、单宁、典型性为评价指标,分别记U1、U2、U3、U4,得U={U1,U2,U3,U4}；设V为葡萄酒的评语集,以每项因素集中的优、良、合格、不合格作为评价等级集,得V={V1,V2,V3,V4},对优、良、合格、不合格依次赋予分值90、75、60、55,即V={90,75,60,55}；设X为权重集,颜色、香气、单宁、典型性的权重系数分别为0.3、0.2、0.3、0.2,得X={0.3,0.2,0.3,0.2}。评价小组对每个样品的每一因素进行逐级评价,对每个样品4 个因素中的每个因素评价等级的投票结果进行归一化处理,建立单因素评价矩阵A={V1*,V2*,V3*,V4*},其中V1*为V1的投票结果与总投票数的比值,分别统计每个因素Ui所对应的模糊评判矩阵Rij=（ri1,ri2,...,rij）∈f（V）,可以得到每个样品的因素模糊综合评判矩阵。建立模糊数学评价模型Bi=X·Ri（i=CK、CT150、CT200、CT250、TF200）,式中：X为权重集；Ri为模糊综合评价矩阵。不同处理组葡萄酒的模糊综合评判总分为Yi=V×Bi（i=CK、CT150、CT200、CT250、TF200）。
1.4 数据处理
结果以平均值±标准差表示,使用IBM SPSS Statistics 26进行统计分析,Origin 2021、Microsoft Excel 2021作图。
2 结果与分析
2.1 葡萄酒基础理化指标
葡萄酒基础理化指标测定结果如表2所示。
表2 葡萄酒基础理化指标
Table 2 Basic physical and chemical indexes of wine
注：同列同一取样时间不同小写字母代表差异显著（p<0.05）。
bb pH值3.75±0.04a 3.43±0.04c 3.32±0.05d 3.28±0.02d 3.60±0.02b 3.86±0.03a 3.66±0.04b 3.56±0.02c 3.42±0.01d 3.81±0.04a取样时间酒精发酵结束处理CK CT150 CT200 CT250 TF200 CK CT150 CT200 CT250 TF200酒精度/% vol 14.57±0.07a 14.56±0.04a 14.02±0.30a 14.27±0.40a 14.24±0.28a 15.56±0.03a 14.90±0.17c 14.63±0.08d 14.51±0.09d 15.29±0.10b残糖含量/（g/L）3.12±0.02b 3.23±0.03a 3.03±0.03c 2.92±0.02d 2.95±0.02d 3.06±0.03ab 3.14±0.06a 2.94±0.06b 2.81±0.05c 2.78±0.02c/(g/L)2.5总酸含量/（g/L）7.20±0.07e 8.83±0.01c 9.30±0.14b 10.30±0.07a 7.56±0.01d 6.05±0.06e 6.88±0.03c 7.95±0.06b 8.81±0.06a 6.26±0.06d 2.0 a c量d b含1.5 d c酸1.0陈酿半年L-乳0.5 e 0挥发酸含量/（g/L）0.44±0.02a 0.34±0.02b 0.28±0.01c 0.24±0.01d 0.37±0.07b 0.52±0.02a 0.47±0.01b 0.35±0.01c 0.31±0.01d 0.43±0.02b CKCT150CT200CT250TF200组别
由表2可知,酒样符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》对于干型红葡萄酒的规定。酒精发酵结束后,各处理组间酒精度没有存在显著差异；残糖的含量为2.92～3.23 g/L；挥发酸含量为0.24～0.44 g/L,与对照组相比均有所降低；与对照组相比,总酸含量增加了0.36～3.10 g/L,pH值降低了0.15～0.47,表明接种耐热克鲁维酵母CT10进行混菌发酵均能使葡萄酒增酸。陈酿半年后,各处理组的酒精度均低于CK且存在显著差异（p<0.05）,这可能与耐热克鲁维酵母CT10在葡萄酒发酵前期消耗了大量营养物质有关[14]。陈酿半年后,接种耐热克鲁维酵母CT10的干红葡萄酒仍能够维持较高水平的总酸含量和较低的pH值,CT150、CT200、CT250与对照组存在显著差异（p<0.05）,表明混菌发酵不仅能在葡萄酒酒精发酵结束时实现有效增酸,更能在陈酿期间使葡萄酒保持良好的酸性环境。
2.2 葡萄酒有机酸含量分析
葡萄酒有机酸含量分析结果如图1所示。
图1 葡萄酒有机酸总含量及L-乳酸、琥珀酸含量
Fig.1 Content of total organic acids，L-lactic acid，and succinic acid in wine
A.酒精发酵结束有机酸总含量；B.陈酿半年有机酸总含量；C.L-乳酸含量；D.琥珀酸含量。不同小写字母表示组间差异显著,p<0.05。
由图1A、图1B可知,L-酒石酸含量几乎保持稳定,在酿酒过程中L-酒石酸不被代谢,但沉淀、氧化反应等物理化学机制会导致其损失。柠檬酸含量在陈酿半年后略微下降,但处理组之间没有明显差异,这可能是苹果酸-乳酸发酵的另外一个重要途径即柠檬酸代谢形成双乙酰、乙偶姻和2,3-丁二醇导致的[15]。酒精发酵结束后,各处理组之间的有机酸总含量存在显著差异（p<0.05）,与对照组相比,混菌发酵葡萄酒中有机酸总含量增加9.68%～24.40%,L-乳酸含量增加了0.59～1.39 g/L,L-乳酸含量随着耐热克鲁维酵母CT10接种量增加而增加,而在耐热克鲁维酵母CT10接种量相同的情况下,CT200葡萄酒中L-乳酸增加了1.16 g/L,TF200葡萄酒中L-乳酸增加了0.59 g/L,TF200在所有处理组中增酸效果最差,这可能是由于耐热克鲁维酵母CT10的耐酒精度较低,与酿酒酵母同时接种进行发酵,在发酵初期就导致其失活,因此,耐热克鲁维酵母CT10与酿酒酵母FX10混菌发酵葡萄酒时,延迟接种酿酒酵母比同时接种增酸效果更佳。
由图1B可知,陈酿半年后,混菌发酵葡萄酒中有机酸总含量增加14.36%～44.58%,结合图1A、图1B和图1C分析,与酒精发酵结束相比,陈酿半年后L-苹果酸含量均呈下降趋势,而L-乳酸含量呈现上升趋势,与对照组相比,L-乳酸含量增加了18.03%～64.88%,这是由于苹果酸-乳酸发酵通常在酒精发酵期间或酒精发酵结束时进行,在一种或者多种乳酸菌的作用下,通过苹果酸-乳酸酶将酒体中酸涩感较强的L-苹果酸脱羧基降解为较柔和的L-乳酸,同时释放出CO2[16-17]。L-乳酸对葡萄酒的酸度起着重要调节作用,葡萄酒中适量的L-乳酸可以帮助平衡和增强酸味,使葡萄酒口感更加平衡和鲜活。
琥珀酸的感官表现为酸、咸、苦,过量的琥珀酸积累会影响葡萄酒的感官品质。酵母菌株的选择影响葡萄酒中琥珀酸的积累。由图1D可知,酒精发酵结束时,CT250葡萄酒中琥珀酸含量均略高于其他处理组,但处理组之间并没有存在显著差异,表明接种耐热克鲁维酵母CT10进行发酵对葡萄酒中琥珀酸的积累影响不大。
综合分析,在酒精发酵结束时,CT250葡萄酒中有机酸总含量增加了24.40%,L-乳酸含量增加了1.39 g/L,且在陈酿半年后仍能维持较高的L-乳酸含量,该处理组的增酸效果最佳。
2.3 CIELab参数及可视化表征
红葡萄酒呈现红色主要是因为花色苷的存在,花色苷在酸性的葡萄酒环境中以多种形态存在,并且它们之间存在转化,其中一部分花色苷以红色的烊盐离子的形式存在,同时还存在紫色或者蓝色的醌式碱、无色的半缩醛和浅黄色的查尔酮[18]。当葡萄酒的pH值在3左右时,花色苷的辅色效应最强,随着pH值升高,较多的花色苷会转变为无色的甲醇假碱,导致减色效应加剧[19]。颜色是评价葡萄酒品质的重要特征,在CIELab参数中,L*值表示明度,a*值表示红/绿色度值,b*值表示蓝/黄色度值,C*ab值为饱和度,表示色彩的集中程度,Hab值为色调角,表示色彩的整体倾向[20],在0°～90°时,色调角越大,表示葡萄酒黄化程度越严重。葡萄酒CIELab参数如表3所示,葡萄酒颜色可视化表征如图2所示。
图2 葡萄酒颜色可视化表征
Fig.2 Visual characterization of wine color
A.酒精发酵结束葡萄酒彩度分布；B.酒精发酵结束葡萄酒明度分布；C.陈酿半年葡萄酒彩度分布；D.陈酿半年葡萄酒明度分布。
表3 葡萄酒CIELab参数
Table 3 CIELab parameters of wine
注：同列同一取样时间不同小写字母代表差异显著（p<0.05）。
取样时间酒精发酵结束陈酿半年处理组CK CT150 CT200 CT250 TF200 CK CT150 CT200 CT250 TF200 L*值68.75±0.10a 65.46±0.01c 63.17±0.21d 60.04±0.06e 66.55±0.14b 60.22±0.03a 58.42±0.07c 56.59±0.11d 53.30±0.16e 59.17±0.03b a*值42.63±0.16d 43.97±0.06b 44.20±0.20b 47.17±0.11a 43.35±0.18c 37.13±0.17e 38.30±0.11d 39.95±0.01b 42.61±0.10a 39.37±0.08c b*值11.36±0.01a 10.52±0.03b 9.72±0.07c 7.03±0.04d 9.71±0.11c 15.29±0.16a 14.82±0.06b 14.03±0.07c 13.09±0.03d 14.16±0.10c C*ab值44.12±0.15c 45.21±0.06b 45.26±0.18b 47.69±0.12a 44.42±0.15c 40.16±0.22e 41.07±0.09d 42.34±0.04b 44.58±0.10a 41.84±0.11c Hab值14.92±0.07a 13.46±0.02b 12.40±0.14c 8.48±0.03d 12.63±0.19c 22.38±0.11a 21.15±0.13b 19.35±0.08d 17.08±0.01e 19.78±0.09c
由表3可知,酒精发酵结束时,各处理组葡萄酒间L*值存在显著差异（p<0.05）,且对照组和其他处理组的a*值、b*值、Hab值存在显著差异（p<0.05）,与对照组相比,各处理组葡萄酒的L*值降低了3.20%～12.67%,a*值增加了1.69%～10.64%,C*ab值增加了0.70%～8.08%,使得葡萄酒颜色更鲜艳饱满,具有更丰富的层次感。陈酿半年后b*值和Hab值呈现上升趋势,L*值、a*值和C*ab值呈现下降趋势,表明陈酿半年后的葡萄酒颜色更暗,色彩饱和度（C*ab值）降低,与酒精发酵结束相比,黄色色度值（b*值）更高,与之对应的是红色色度值（a*值）降低,葡萄酒出现黄化现象。与对照组相比,各处理组葡萄酒的b*值降低了3.07%～14.42%,Hab值降低了5.48%～23.72%,表明混菌发酵有效减缓了陈酿期间葡萄酒的黄化,有利于保持葡萄酒的颜色稳定性。结合图2分析,酒精发酵结束时,CT250葡萄酒的a*值较高,b*值和L*值较低,此时葡萄酒呈现出深紫红色,相比其他处理组,具有更明显的紫色调,色彩饱和度高、层次感丰富。陈酿半年后,对照组CK的黄化程度最为严重,其L*值和b*值较高,说明此时该葡萄酒颜色较为单薄,且具有较为明显的黄色调。不管在酒精发酵结束或者陈酿半年后,混菌发酵的葡萄酒的颜色都能得到明显的提升,其中CT250葡萄酒的颜色比其他处理组葡萄酒颜色提升效果更明显。
2.4 模糊数学感官评价分析
感官评价结果见表4。
表4 葡萄酒模糊感官评价投票结果
Table 4 Voting results for fuzzy sensory evaluation of wine products in different groups
评价指标颜色优V1良V2合格V3不合格V4香气单宁典型性处理CK CT150 CT200 CT250 TF200 CK CT150 CT200 CT250 TF200 CK CT150 CT200 CT250 TF200 CK CT150 CT200 CT 250 TF200 3 2 2 6 4 5 2 1 6 4 4 0 1 5 0 5 1 3 5 1 5 3 5 4 5 4 3 5 3 4 3 5 5 5 4 5 4 3 4 4 2 5 3 0 1 1 5 4 1 2 3 5 4 0 5 0 5 4 1 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
通过对表4中CK葡萄酒的分析,建立了颜色、香气、单宁、典型性4 个单因素的评价矩阵：ACK颜色=（0.30,0.50,0.20,0.00）；ACK香气=（0.50,0.40,0.10,0.00）；ACK单宁=（0.40,0.30,0.30,0.00）；ACK典型性=（0.10,0.40,0.50,0.00）。由上述结果得到CK对照组的模糊综合评价矩阵如下。
同理可得到其他处理组的模糊综合评价矩阵。根据模糊数学评价模型建立方法得到CK的模糊数学评价模型如下。
同理可得到其他处理组的模糊数学评价模型。根据模糊综合评判总分的计算方法得到CK的模糊综合评判总分：Yck=（90,75,60,55）×（0.33,0.40,0.27,0.00）=75.90。
同理可得到其他处理组的模糊综合评价总分为YCT150=69.30,YCT200=72.00,YCT250= 82.65,Y TF200=72.90。
由模糊综合评价总分可知,CT250葡萄酒的模糊综合评价得分最高为82.65,CK次之为75.90,CT150葡萄酒的模糊综合评价得分最低为69.30。结合感官评定投票结果可知,CT250葡萄酒的颜色、香气、单宁的“优”评定投票都为所有处理组中最高的,典型性仅次于CK处理组。综上所述,接种250 mg/L耐热克鲁维酵母CT10后延迟接种200 mg/L酿酒酵母FX10能够提高赤霞珠干红葡萄酒的颜色、香气及单宁品质,对提高赤霞珠干红葡萄酒的感官品质具有积极的作用,但对于耐热克鲁维酵母CT10与酿酒酵母FX10混合发酵中与葡萄酒品质直接相关的分子机制有待进一步研究。
3 结论
通过探究不同接种方式及接种量耐热克鲁维酵母CT10与酿酒酵母FX10混合发酵对赤霞珠干红葡萄酒有机酸含量及感官品质的影响。结果表明,混菌发酵使得葡萄酒总酸含量显著增加,pH值和挥发酸显著降低。与对照组相比,在酒精发酵结束时,混菌发酵的赤霞珠干红葡萄酒中L-乳酸含量增加0.59～1.39 g/L,a*值提高了1.69%～10.64%；陈酿半年之后,混菌发酵的葡萄酒中L-乳酸含量增加了18.03%～64.88%,b*值降低了3.07%～14.42%。结合模糊数学感官评价综合分析,接种250 mg/L耐热克鲁维酵母CT10后,延迟接种200 mg/L酿酒酵母FX10进行混合发酵使赤霞珠干红葡萄酒颜色鲜艳饱满,香气浓郁复杂,果香、花香、奶油香突出,单宁充沛,口感平衡,达到了增酸及提高葡萄酒感官品质的效果,确定接种250 mg/L耐热克鲁维酵母CT10后,延迟接种200 mg/L酿酒酵母FX10为赤霞珠干红葡萄酒最佳工艺条件,对于解决新疆产区葡萄酒“糖高酸低”的产业问题具有重要意义。
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