农药主要用于控制危害农业、林业和畜牧业生产的有害生物（害虫、病原体、杂草、啮齿动物等）[1]。根据其来源，农药可分为矿物源农药（无机农药）、生物源农药和有机农药[2]，后者是通过化学合成制成的，占农药的大多数，如有机磷农药、有机氯农药、氨基甲酸酯农药、拟除虫菊酯农药[3]。研究表明，大部分残留农药会渗透或到达植物、环境介质和动物体内，而只有1% 的农药能有效控制目标植物上的害虫[4]。这些杀虫剂通过污染环境间接进入人体，并逐渐进入食物链，造成慢性中毒[5]。为了有效控制农药的使用、监测其分解过程，并解决农药在生产、销售和使用环节中产生的残留问题，我国出台了多种管理政策。为了保障食品安全和人体健康，有必要使用一种快速、准确、灵敏、有效的技术来筛查农药残留物。
目前有两种检测农药残留的方法：仪器分析和免疫测定。这两种方法各有优缺点，因此两者结合使用效果最佳[6]。由于仪器分析准度高，因此经常用于验证试验，但存在耗时、耗力等弊端[7]。免疫测定依靠抗原和抗体的特异性结合，不需要使用大型仪器，具有灵敏度高、检测成本低、操作简单等优点[8]。常见的免疫测定方法包括酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、荧光免疫测定（fluorescence immunoassay，FIA）和荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）、化学发光免疫测定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、免疫层 析（immunochromatographic analysis，IC）和放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）。其中，ELISA 是应用最广泛的一种免疫测定方法[9]。随着农业和畜牧业中农药残留检测技术的发展，检测方法和设备也变得更加简便、快捷和精确。本综述介绍几种检测农药残留的免疫测定技术的使用和比较，以期为快检市场的发展提供理论依据。
1 农药残留免疫检测方法
1.1 ELISA 的应用
ELISA 属于固相酶联免疫法，可以利用体内分子与抗原分子之间的抗特异性结合，实现对目标物质的分离和检测。在分离过程中，只有目标蛋白才能与固体载体结合，得到特殊的标记物，从而满足物质定性和定量分析的需要[10]。
ELISA 作为检测生物标记物的主要技术之一，因其成本低、使用方便，自20 世纪以来得到了迅速发展。它被应用于检测食品成分或医学检查等不同领域[11]。目前，ELISA 已成为一种成熟的检测技术，有许多用于检测农药的ELISA 试剂盒已投入商业使用。由于农药是小分子物质，通常采用竞争性ELISA 法检测[12]，其检测原理如图1 所示。样本中的抗原及预包被的酶标抗原，竞争性地与固相抗体结合。样品中的抗原越多，信号就越弱，设备能检测到的酶标抗原就越少[13]，最后通过酶标仪读取吸光度值进行定性分析。
图1 ELISA 检测原理（竞争ELISA）
Fig.1 Detection principle of ELISA（competitive ELISA）
ELISA 常用于检测农药残留。竞争性ELISA 是检测小分子农药残留、兽药残留等最广泛使用的方法，其在农药残留检测中的应用见表1。
表1 ELISA 农药残留检测方法
Table 1 ELISA for the screening of pesticide residues
农药喹硫磷毒死蜱吡虫啉螺螨酯样本柑橘、鲜橙白菜、黄瓜芥蓝中草药柑橘、水方法ic-ELISA ic-ELISA dc-ELISA ic-ELISA IC50 值/（ng/mL）4.18 0.80 0.08 25.46参考文献[14][15][16][17]
吕丽兰等[14]建立了一种基于单克隆抗体的竞争性间接ELISA 方法，用于识别喹硫磷，其IC50 为4.178 ng/mL，与高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测结果具有一致性。此外，Hongsibsong 等[15]建立了间接竞争ELISA（indirect competition ELISA，ic-ELISA）方法用于检测蔬菜中的毒死蜱，其IC50 为0.80 ng/mL。该技术具有交叉反应小、灵敏度高等优点。此外，Zhang 等[16]开发了另一种直接竞争酶联免疫吸附测定（direct competitive enzymelinked immunosorbent assay，dc-ELISA）法，用于测定药材中的吡虫啉，其检测范围为0.03～0.29 ng/mL。由此可见，ELISA 方法的检测限能够低于农药检测水平，其结果与仪器检测的结果相当，Jin 等[17]的研究也证明了这一观点。
ELISA 具有高通量、高灵敏度、操作简单、反应时间短等特点，酶联免疫法是目前最流行、最便捷的检测方法。然而，它也有一些缺点，包括重现性低、容易出现由自身抗体引起的假阳性以及其他一些干扰因素，这些都可能对这些检测方法的使用构成限制[18]。因此，能够代替或优化传统ELISA 方法的快检技术是目前研究的重点。
1.2 FIA 与TRFIA 的应用
图2 为FIA 的检测原理，首先用荧光素标记已知抗原或抗体，然后将其用作探针，再通过荧光着色进行定量检测[19]。
图2 FIA 检测原理
Fig.2 Detection principle of FIA
目前，已有多种FIA 被用于评估农药残留，其具体应用见表2。
表2 FIA/TRFIA 农药残留检测方法
Table 2 FIA/FPIA for the screening of pesticide residues
农药氰戊菊酯方法FIA IC50/IC10 值/（ng/mL）12参考文献[20]吡虫啉杀螟松三唑磷样本白菜、莴苣、梨、苹果水、大米、苹果白菜苹果、梨、黄瓜和大米FIA（ALP）FIA（Nb-ALP）QDs-based FIA 1.30 5.78×10-3 5.08×10-4[21][22][23]
Xu 等[20]对不同水果、蔬菜样本中的氰戊菊酯残留进行检测，其检测限达12 ng/mL，为开发用于检测氰戊菊酯的FIA 方法奠定了基础。此外，Li 等[21]开发了用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）标记吡虫啉的特异性荧光信号响应程序，避免了纳米材料-抗体共轭物合成费力的缺点，其灵敏度是传统ELISA 方法的几十倍。
利用不同的荧光底物，其检测结果也不尽相同。例如，Lv 等[22]利用锚定二氧化锰的金纳米团簇（gold nanoclusters anchored manganese dioxide，AuNCs-MnO2）复合材料和纳米抗体连接的碱性磷酸酶（nanobodylinked alkaline phosphatase，Nb-ALP）开发了一种杀螟松检测方法，其IC10 为5.78×10-3 ng/mL。Liao 等[23]基于CdSe/ZnS 量子点（quantum dots，QDs）建立了一种新型荧光免疫测定（fluorescence immunoassay，FLISA）技术用于识别三唑磷农药，其IC50 为0.46 ng/mL。
然而，传统的荧光免疫分析受到背景荧光以及激发光源发出的杂散光的干扰，大大降低了其检测灵敏度[24]。随后出现了时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassays，TRFIA）。TRFIA 是一种非同位素免疫测定技术，它利用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特性，采用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间，实现信号分辨，可有效排除非特异性荧光的干扰，大大提高分析灵敏度[25]。作为荧光标记物，铕（Eu3+）螯合物是一种镧系元素。利用这类荧光物质荧光寿命长的特点，在短寿命天然来源的背景荧光完全衰减后再进行测量，得到的信号完全是长寿命镧系元素螯合物的荧光，从而有效地排除了干扰。Li 等[26]利用Eu3+标记的多克隆抗体，分别建立了直接竞争TRFIA（direct competition TRFIA，dc-TRFIA）和间接竞争TRFIA（indirect competition TRFIA，ic-TRFIA）方法来检测氯噻酮。结果表明，ic-TRFIA 的灵敏度更高。Xu 等[27]也建立了一种dc-TRFIA，可同时检测13 种有机磷农药，检测限低于10 ng/mL。综上所述，TRFIA 的优点包括灵敏度高、稳定性强、能够消除荧光背景干扰等[28]。然而，它也具有昂贵和耗时等弊端[29]。因此，如何降低对荧光素的干扰，以及如何降低检测成本是未来研究的重点内容。
1.3 CLIA 的应用
Chen 等[30]于1977 年提出了化学发光免疫分析法。其原理是在抗原或抗体上标记发光物质以触发免疫反应，通过反应器激发发光物质产生不稳定的激发态中间产物，当激发态中间产物回到稳定的基态时释放光子，然后使用自动发光分析仪检测光信号[31]，具体见图3。
图3 CL（EIA）检测原理
Fig.3 Detection principle of CL（EIA）
常用的化学发光标记包括鲁米诺（luminal）及其衍生物[32]，其被应用于不同样本的农残检测，具体见表3。
表3 CL（EIA）农残检测方法
Table 3 CL（EIA）for the screening of pesticide residues
农药甲基对硫磷和吡虫啉克百威西维因甲硫威啶虫脒样本人参、花旗参方法CL LOD 值/（ng/mL）0.33参考文献[33]果汁CLEIA [35]白菜、黄瓜CLEIA 0.03 0.007 0.004 0.70[36]
Ouyang 等[33]以luminal/H2O2 为基础建立了一种电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）方法来检测甲基对硫磷和吡虫啉，在最佳条件下的检出限（limit of detection，LOD）为0.33 ng/mL。ECL 具有灵敏度高、操作简便、检测时间短等优点。但是，用发光物质标记的抗原或抗体会改变免疫反应特性，发光标记率的重复性较差[34]。然而，CLEIA 能很好地解决基质干扰问题，Mickova 等[35]的试验结果也充分说明了这一点。此外，该方法获得的LOD 值也明显较低。例如，Zhu等[36]建立了一种检测蔬菜中啶虫脒残留量的CLEIA方法，LOD 值为0.70 ng/mL。
由于CLEIA 法特异性和灵敏度高，不仅被用于药品和兽药残留领域，还被用于水样和食品中农药残留的检测[37]。然而尽管CLEIA 具有即时发光和发光强度适中的特点，但未来通过增强发光系统的强度，CLEIA 的应用范围可能会更广，并能产生更精确和可重复的结果[38]。
1.4 IC 的应用
IC 技术是20 世纪发达国家兴起的一种结合免疫学技术和色谱技术的快速检测分析方法，主要用于检测血清蛋白[39]，其反应原理如图4 所示。
图4 IC 检测原理（胶体金）
Fig.4 Detection principle of IC（AuNPs）
基于免疫试剂的抗原-抗体特异性结合，检测线（T 线）上涂有捕获抗原或捕获抗体，结合垫上结合有颜色的纳米材料标记的抗体。当要检测的样品加入样品垫时，免疫试剂通过层析相互结合。T 线区域有无信号色以及信号强度可用于确定结果。可根据T 线区域信号的颜色和强度来确定结果[40]。胶体金纳米颗粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）作为一种标记物已被广泛应用于疾病检测、食品安全检测、人类和动物医学临床实验等相关领域，胶体金技术具有广泛的应用前景[41]。基于免疫层析法对不同种类农药的检测结果见表4。
表4 IC 农残检测方法
Table 4 IC for the screening of pesticide residues
农药莠去津吡唑醚菌酯菌核净甲基醚菌酯甲基硫菌灵甲基对硫磷对硫磷甲基对硫磷杀螟松对硫磷样本水小麦方法IC IC参考文献[43][44]水 水橙子、黄瓜、番茄IC LFIC LFIC[46][47][48]大米、蔬菜、苹果QB-IC LOD 值/（ng/mL）3.00 2.50 2.00 8.80 0.50 1.70 3.44 3.98 12.49 6.25[49]
郭桥[42]开发了一种AuNPs 免疫层析试纸条，用于测定多菌灵的残留，其LOD 值为1.92 ng/mL。Shim等[43]也利用了类似的技术来检测水样中的阿特拉津，大约10 min 内就得出了结果。此外，在Lin 等[44]的研究中，AuNPs 免疫层析技术显示出很强的特异性，并且与仪器分析结果一致。
除胶体金外，胶体碳、磁性纳米材料、稀土纳米材料和量子点也被用作免疫层析应用中的纳米标记物[45]。Blažková 等[46]利用胶体碳免疫层析技术检测水样中的甲硫威残留物，LOD 值为0.50 ng/mL。Liu 等[47]利用基于磁性Fe3O4 纳米复合材料的方法检测了甲基对硫磷，LOD 值为1.70 ng/mL。Zou 等[48]建立了基于上转换纳米颗粒的侧流免疫层析（lateral flow immunochromatographic，LFIC）方法，得到对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松的LOD 值分别为3.44、3.98、12.49 ng/mL。Liu 等[49]使用量子点作为标记物检测不同样品中的对硫磷，LOD 值为6.25 ng/mL。不同的纳米探针均具有很高的特异性，适用于免疫层析研究，但灵敏度高、成本低、特异性好的纳米材料才是免疫层析技术的关键。
免疫层析技术是一类使用纳米级标记探针作为示踪剂和标记物的检测技术。除了操作简单、反应迅速、耗时短，它还具有成本低、特异性强等特点，尤其适合现场检测[50]。然而，基于纳米标记物的试纸具有材料合成步骤繁琐、条件苛刻、耗时耗能、稳定性和单一分散性等特点[51]。因此，实现多目标检测、提高检测精度、增强检测性能和减少交叉干扰仍是未来研究的重点。
1.5 RIA 的应用
在RIA 中，未标记抗原和用放射性物质标记的抗原与抗体竞争性结合，形成放射性抗原-抗体复合物和非放射性抗原-抗体复合物。然后，通过离心、沉淀等方法，将抗原抗体复合物与游离抗原分离，并与标准曲线比较，分别测定其放射性强度，从而定量检测未标记的抗原[52]。RIA 反应原理见图5。
图5 RIA 检测原理
Fig.5 Detection principle of RIA
RIA 具有高灵敏度和高特异性的优点，因此被广泛应用于农业、畜牧业、制药业等多个行业。Ercegovich 等[53]开发了一种灵敏度为0.1µg/mL 的RIA 方法，用于对硫磷农药残留的定量检测。Knopp 等[54]也使用RIA 来检测水样中除草剂的含量。此外，以单克隆抗体为载体的RIA 也被用于百草枯的定量检测，其结果均表现出具有良好的特异性[55]。由此可见RIA 在鉴定农药含量方面表现出良好的灵敏度。
然而，RIA 存在诸多缺点。首先，其同位素半衰期短，进而导致试剂盒保质期短。其次，放射性元素标记难以在实验室进行，操作难度大，还可能在标记和分析过程中造成放射性污染。此外，检测仪器昂贵，进一步提高了RIA 的检测成本[56]。随着其他非放射性元素标记免疫技术的发展，RIA 在农兽药残留分析中的应用受到很大限制，甚至有被淘汰的可能[57]。
2 展望
随着免疫学、分子生物学和分析化学领域的持续进步，新型农药残留检测手段层出不穷，为监测工作提供了更多可能性。免疫测定法，主要依赖于抗原与抗体间的相互作用，具有良好的特异性和灵敏度、检测时间短、操作相对简单等优点，因而成为农药残留检测中的一种快检手段。其检测限能够达到权威组织所规定的标准，体现了其在实际应用中的可靠性。然而，尽管免疫测定法具有诸多优点，但仍存在一些问题亟待解决，特别是假阳性率较高以及检测范围单一的问题。因此，需要对免疫测定法进行更为深入和系统的研究。如何减少预处理时间、降低检测成本、实现多元检测，是农药残留快速检测技术的主要研究方向，以推动免疫测定在农残检测领域中的应用及持续发展。
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