γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）广泛存在于动物、植物和微生物体内，是一种非蛋白质水溶性天然氨基酸[1]；在哺乳动物中枢神经系统中作为一种重要抑制性神经递质[2]，具有降血压[3]、预防糖尿病[4]、治疗癫痫[5-6]、控制哮喘[7]、改善睡眠和记忆[8]、治疗抑郁症[9]和预防肥胖[10]等多种生物活性，并被广泛研究，具有开发为功能性食品的潜力。
谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）是微生物体内产生GABA 的关键酶，是一种磷酸吡哆醛类酶[11]，能催化L-谷氨酸或其盐α 位不可逆地脱羧形成γ-氨基丁酸[12-13]。目前许多学者已经获得GAD 并对其性质进行研究，例如于平等[14]克隆了大肠杆菌的GADA 在大肠杆菌BL21 中表达并对其酶学性质进行了初步研究；Park 等[15]从新分离的短乳杆菌中克隆了编码谷氨酸脱羧酶的基因；乌云达来等[16]对乳酸乳球菌GAD 进行克隆表达，并对其酶学性质进行研究。而不同来源的谷氨酸脱羧酶在酶学性质上有一定差异。
近年来，多种微生物被发现都具有产生GABA 的能力[17]，而乳酸菌作为食品安全级（generally recognized as safe，GRAS）微生物，因其具有较高的产生GABA 潜能[18]而被广泛用于生产GABA[11，19]，其中研究较多的乳酸菌种类有短乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和粪肠球菌等。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，L. plantarum）作为GRAS 微生物，被广泛开发利用于食品研究中。郑香峰等[20]研究表明植物乳杆菌能清除食物中赭曲霉素A；孔婧等[21]研究得知植物乳杆菌能显著提高发酵乳抑菌性。因L.plantarum 具有产γ-氨基丁酸的能力，多种乳酸菌类饮料[22]通过添加植物乳杆菌以获得功能活性。因此使得利用植物乳杆菌来源的GABA 制备功能性食品成为可能。但是植物乳杆菌作为兼性厌氧菌，需控制氧气浓度，并且生长条件较为苛刻，导致生长调控较为困难，因此限制了其工业化大规模制备GABA。大肠杆菌具有生长速率快、培养密度高等优点，可作为GABA 工程菌的宿主菌用于GABA 的大规模发酵制备，同时大肠杆菌表达分泌的GAD 也易于分离与纯化，有利于研究GAD 的各种酶学性质。
本研究从植物乳杆菌CPRGJ 中得到gad 基因，并通过热激法转入大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）BL21 中，构建E. coli BL21-pET28a-gad 表达系统，初步优化重组酶诱导表达条件，并利用镍柱亲和层析将重组GAD 分离纯化后，对该酶酶学特性进行研究，以期为深入了解谷氨酸脱羧酶的酶学性质及GABA 的制备提供试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌CPRGJ、质粒pET-28a：湖北工业大学生物工程与食品学院微生物制剂研究团队保藏；感受态细胞E.coli BL21、E.coli DH5α、细菌基因组DNA 提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒、pMD18T 载体克隆试剂盒、改良Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒、蛋白Marker、rTap：日本Takara 生物工程有限公司；L-谷氨酸（L-Glu）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；γ-氨基丁酸标品、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphatemonohydrate，PLP）、卡那霉素（kanamycin，Kan）、氨苄青霉素（ampicillin，Amp）：美国SIGMA 公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物：南京金斯瑞公司。
1.2 仪器与设备
K10219D 酶标仪：美国BioTek Instruments 公司；HH-4 数显恒温水浴锅：常州市金坛友联仪器研究所；Heraeus Fresco 17/21 台式高速离心机：美国Thermo Scientific 公司；Veriti 9902 梯度PCR 仪：美国Applied Biosystens 公司；DYY-6C 电泳仪：北京市六一仪器厂；GBox F3 凝胶成像仪：美国SYNGENE 公司；NGCTM 3rd Story Expansion Frame 蛋白纯化仪：美国Bio-RAD Laboratories 公司；HisTrapTM HP 镍柱：瑞典GE Healthcare Bio-Science 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种的培养与缓冲液的配制
植物乳杆菌CPRGJ 的保存和培养均用MRS 培养基；E.coli BL21 保存和培养用LB 培养基[23]；筛选转化子用含有30 µg/mL 卡那霉素的LB 固体培养基（含2%琼脂）。
MRS 培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、乙酸钠2 g/L、吐温80 1%，pH7.0～7.4。
Ni+柱亲和层析缓冲液：结合缓冲液为50 mmol/L磷酸盐缓冲液、100 mmol/L NaCl、40 mmol/L 咪唑，pH7.4；洗脱缓冲液为50 mmol/L 磷酸盐缓冲液、100 mmol/L NaCl、300 mmol/L 咪唑，pH7.4。
底物反应液：取6.562 g 无水乙酸钠溶于90 mL 无菌水中，用乙酸调pH 值至4.8 后定容至100 mL，并加入1.839 g 的L-Glu（0.25 mol/L）和6.179 mg 的PLP（0.25 mmol/L）。
1.3.2 谷氨酸脱羧酶的克隆
以L. plantarum CPRGJ 全基因组DNA 为模板进行PCR 扩增得到gad 基因，引物见表1。
表1 gad 基因PCR 扩增引物
Table 1 Primers for PCR amplification of gad gene
引物名称gad-F gad-R引物核苷酸序列5′-TACCTACCATCCAGATTGC-3′5′-CGTCAGAATTAGGATGATGC-3′
PCR 体系：10×PCR buffer（含Mg2+）5.0 µL、gad-F（10µmol/L 1.0µL、gad-R（10µmol/L）1.0µL、dNTPmix 4.0 µL、模板1.0 µL、rTap 1.0 µL 及ddH2O 37.0 µL。PCR 产物利用DNA 凝胶回收试剂盒回收后，用pMD18T Vector Cloning Kit 进行TA 克隆，得到pMD18T-gad。通过热激法将其转入E. coli DH5α，在含有100µg/mL Amp 的LB 固体培养基培养16 h 后挑取单菌落进行菌落PCR 扩增，经过电泳检测后挑选合适样品送至武汉擎科生物技术有限公司进行检测，并由其进行密码子优化，构建得到质粒pET28a-gad。
1.3.3 E.coli BL21-pET28a-gad 的构建
将质粒pET28a-gad 通过热激法转入E.coli BL21中，并在含有30µg/mL 卡那霉素的平板上培养，得到E.coli BL21-pET28a-gad，挑选合适阳性克隆子送样至武汉擎科生物技术有限公司测序。
1.3.4 谷氨酸脱羧酶的诱导表达
将活化后的E. coli BL2-pET28a、E. coli BL2-pET28a-gad 按2%（体积分数）接种量接入新鲜的LB培养基（含30 µg/mL Kan）中，37 ℃、200 r/min 振荡培养，其OD600 达到0.4～0.6 时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG 诱导表达，以不加IPTG 为空白对照，22 ℃、200 r/min 诱导12 h。
1.3.5 重组酶的纯化
1.3.5.1 粗酶液的制备
收集诱导GAD 表达后菌液，10 000 r/min 离心10 min，用PBS（pH7.4）冲洗3 次后将沉淀重悬于1/10体积的结合缓冲液中，超声破碎（工作3 s，间歇5 s，功率200 W，共99 次）后7 000 r/min 离心15 min，分别收集上清液和沉淀（PBS 洗涤3 次）备用，进行表达结果十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）的验证以及重组酶的纯化。
1.3.5.2 重组GAD 的纯化
1.3.5.1 制备的粗酶液，取上清液过0.22 µm 水系滤膜，用蛋白纯化仪进行镍柱亲和层析纯化，具体操作参考NGCTM 3rd Story Expansion Frame 蛋白纯化仪操作说明书，经上样、清洗、洗脱后收集单一出峰时间段的洗脱液，得到纯酶进行SDS-PAGE 鉴定。
1.3.6 重组酶酶学性质测定
1.3.6.1 GAD 最适温度及温度稳定性
将pH4.8 的底物反应液与300µL 酶液混合，分别在30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下反应2 h 并测定酶活力，将酶活力最高组设置为100%；并在30、35、40、45、50、55、60、65 ℃温度下孵育2 h 后加入底物反应液反应测得剩余酶活力，将没有孵育的GAD 的酶活力设置为100%，测得温度稳定性。
1.3.6.2 GAD 的最适反应pH 值及pH 稳定性
将300 µL 酶液与pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 的底物反应液混合于45 ℃反应2 h 测定酶活力，将酶活力最高组设置为100%；并在各pH 值下孵育2 h 后加入底物反应液反应测得剩余酶活力，将没有孵育的GAD 的酶活力设置为100%，测得pH 稳定性。
1.3.6.3 PLP 浓度对GAD 活力影响
将300 µL 酶液与含有PLP 终浓度为0、50、100、150、200、250、300µmol/L 的底物反应液混合，45 ℃水浴反应2 h 测定酶活力，将酶活力最高组设置为100%。
1.3.6.4 有机溶剂对GAD 活力影响
在底物反应液中分别加入终浓度1% 的甲醇、乙醇、丙三醇、丙酮、正丁醇、叔戊醇、乙腈、正己烷、正庚烷与300µL 酶液在45 ℃水浴反应2 h 测得酶活力，以不加有机试剂的样品为对照，设置为100%。
1.3.6.5 金属离子对GAD 活力影响
在底物反应液中加入含有Zn2+、Na+、K+、Li+、Mg2+、Ca2+、Co2+的金属离子溶液，使金属离子终浓度为1 mmol/L，再加入300µL 酶液在45 ℃水浴反应2 h 测得酶活力，以不加金属离子的样品为对照，对照组酶活力设置为100%。
1.3.6.6 米氏常数
在L-Glu 的浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L 的底物缓冲液中加入300µL 酶液后，45 ℃反应60 min 后测得产物含量，采用Lineweaver Burk 方程得到Km 和Vmax。
1.3.7 指标测定方法
1.3.7.1 γ-氨基丁酸的测定
GABA 的测定使用Berthelot 比色法[24]，Berthelot反应是利用苯酚和次氯酸钠与游离的氨发生反应后生成有色化合物，在630 nm 处有响应值[25]，在Berthelot反应中，ω-氨基酸的反应灵敏度很高，而α-氨基酸响应低[26]，因此谷氨酸和GABA 在反应中响应差别大，可用于测定GABA 含量。
取0.5 mL 样品按顺序加入pH9.0、0.2 mol/L 的硼酸缓冲液0.2 mL、质量分数6% 的苯酚1 mL、有效氯占比为7% 的NaClO 溶液0.5 mL，充分振荡后煮沸7 min，迅速冰水浴冷却9 min，加入60% 乙醇溶液2 mL，用酶标仪测定630 nm 处吸光值。GABA 标准曲线同样由此方法获得，GABA 标准曲线的线性回归方程为y=1.630 4x-0.000 08，决定系数R2=0.999 1，x 为GABA 的质量浓度，y 为OD630 下的吸光值。
1.3.7.2 蛋白浓度的测定
蛋白浓度按Modified Bradford Protein Assay Kit 的方法测定。蛋白浓度标准曲线由此法获得，蛋白质浓度标准曲线的线性回归方程为y=0.078 3x+0.171 9，相关系数R2=0.991 2，x 为蛋白质浓度，y 为OD595 下的吸光值。根据蛋白质质量浓度标准曲线得到纯化后重组酶蛋白浓度为2.139 mg/mL。
1.3.7.3 谷氨酸脱羧酶酶活测定
由于GAD 能催化L-谷氨酸或其盐的不可逆α-脱羧反应形成γ-氨基丁酸，因此可通过进行酶催化反应产生GABA 的量来表达酶活力。酶活的测定方法参考李云等[27]的方法，并进行调整，2.7 mL 底物反应液（0.1 mol/L L-Glu 和0.2 mmol/L PLP 溶于0.2 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液）加入300µL 酶液，37 ℃水浴2 h 后煮沸5 min 终止反应，10 000 r/min 离心10 min，用比色法测得GABA 含量。酶活（U）定义：在该条件下每小时产生1µg 的γ-氨基丁酸所需的酶量为一个酶活单位。
1.4 数据处理
引物设计由Primer premier 5 设计，采用Excel 2019 对数据进行整理，用Origin 2018 对数据进行作图，每组试验重复3 次。
2 结果与分析
2.1 GAD 的克隆以及表达载体的构建
以CPRGJ 全基因组为模板通过PCR 得到gad 全长基因，用TA 克隆得到E. coli BL21-pMD18T-gad 后测得gad 全序列，进行密码子优化后构建得到质粒pET28a-gad，并构建E. coli BL21-pET28a-gad，进行双酶切验证。重组质粒pET28a-gad 双酶切图见图1。
图1 重组质粒pET28a-gad 双酶切图
Fig.1 Double digestion map of recombinant plasmid pET28a-gad
M.蛋白Marker；1.重组质粒pET28a-gad。
如图1 所示，酶切后得到两条大小分别大约为5 348 bp 和1 428 bp 的条带，这与预期条带大小相同，说明表达系统构建成功。
2.2 谷氨酸脱羧酶的诱导表达
对E. coli BL2-pET-28a、E. coli BL2-pET-28a-gad菌液进行IPTG 诱导表达，通过超声破碎后收集对应的上清液和沉淀进行SDS-PAGE，结果见图2。
图2 E.coli BL2-pET-28a、E.coli BL2-pET-28a-gad 诱导表达SDS-PAGE
Fig.2 SDS-PAGE of the induced expression of E.coli BL2-pET-28a and E.coli BL2-pET-28a-gad
M.蛋白Marker；泳道1.E.coli BL21-pET28a 加IPTG 诱导沉淀；泳道2.E.coli BL21-pET28a 加IPTG 诱导上清液；泳道3.E.coli BL21-pET28a 未诱导沉淀；泳道4.E.coli BL21-pET28a 未诱导上清液；泳道5.E.coli BL21-pET28a-gad 加IPTG 诱导沉淀；泳道6.E.coli BL21-pET28a-gad 加IPTG 诱导上清液；泳道7.E.coli BL21-pET28agad 未诱导沉淀；泳道8.E.coli BL21-pET28a-gad 未诱导上清液。
重组蛋白的大小为53.36 kDa，由图2 泳道1～4可知，不含gad 的菌体无论是否经IPTG 诱导，在53.36 kDa 附近均没有条带，说明E. coli BL21-pET28a没有产生GAD 的能力；泳道5、6 在53.36 kDa 附近有明显条带，而泳道7、8 未有明显条带，说明添加IPTG有利于谷氨酸脱羧酶的表达，诱导表达成功的GAD 大部分在上清液中，沉淀中有少部分以包涵体形式存在。
2.3 镍柱亲和层析纯化重组酶
由于质粒pET-28a 自身带有His 标签，故采用镍柱亲和层析的方法进行纯化。将粗酶液经0.22µm 水系滤膜过滤后，通过蛋白纯化仪进行镍柱亲和层析，收集280 nm 单一出峰时间的洗脱液进行SDS-PAGE 鉴定，结果见图3。
图3 重组蛋白SDS-PAGE
Fig.3 SDS-PAGE of the recombinase
M.蛋白Marker；泳道1.纯化后重组蛋白；泳道2.未纯化重组蛋白。
由图3 可知，泳道2 在53.36 kDa 附近有明显条带，表明重组基因成功表达；泳道1 在53.36 kDa 附近的条带较单一且亮度明显，说明纯化效果较好且纯度较高，故选用纯化后重组蛋白进行后续酶学性质研究。
2.4 GAD 最适温度及温度稳定性
温度对GAD 活力影响和GAD 温度稳定性见图4。
图4 温度对GAD 活力影响及温度稳定性
Fig.4 Effect of temperature on GAD activity and temperature stability
A.温度对GAD 活力的影响；B.温度稳定性。
由图4 可知，GAD 在45 ℃时具有最高活性，且在保温2 h 后在30～50 ℃维持70% 以上的相对酶活，当温度高于50 ℃时，酶的活力和稳定性都会下降，可能是酶的热变性使得部分的酶失活导致[14]，因此GAD 的最适温度为45 ℃。栾建军[28]从豆豉中分离得到的植物乳杆菌来源GAD 最适温度是35 ℃；于平等[14]研究大肠杆菌来源谷氨酸脱羧酶A 的最适温度为50 ℃，说明不同来源的GAD 的最适温度有一定差异。
2.5 GAD 的最适反应pH 值及pH 稳定性
将酶液与不同pH 值的底物反应液混合在相同条件下反应后，得到谷氨酸脱羧酶最适pH 值以及pH 稳定性见图5。
图5 GAD 最适反应pH 值及pH 稳定性
Fig.5 GAD optimum reaction pH and pH stability
A.最适反应pH 值；B.pH 值稳定性。
由图5 可知，当pH 值在4.0～5.0，随着pH 值的增加GAD 活力增加，当pH 值高于5.0 后酶活力开始下降，从pH6.5 开始，酶活力变化不大。当pH 值为5.0时GAD 有最高酶活，这与已报道的乳酸菌GAD 最适pH 值在3.0～6.0 结果相符[29]，GAD 在pH4.0～6.0 能保持60%以上酶活，当pH 值高于5.5，酶稳定性下降，当pH7.5 时，相对酶活只有4.12%，说明GAD 有较强的pH 依赖性且pH 活性范围较窄（4.0～5.5）。
2.6 PLP 浓度对GAD 活力影响
GAD 是PLP 依赖性酶，PLP 作为谷氨酸脱羧酶的辅因子，能促进GAD 折叠，提高GAD 活力[30]。因此本文研究不同终浓度的PLP 对GAD 活力影响，结果见图6。
图6 辅酶PLP 浓度对GAD 活力影响
Fig.6 Effect of PLP concentration on GAD enzyme activity
由图6 可知，当PLP 浓度为0µmol/L 时仍具有酶活力，推测PLP 在酶催化过程起到辅助作用。随着PLP 浓度增加，酶活力增加，浓度在250 µmol/L 时出现拐点，说明在一定范围内添加PLP 有利于GAD 的催化反应，且最适的PLP 浓度为250µmol/L。
2.7 有机溶剂对GAD 活力影响
有机溶剂能影响酶催化反应的平衡点，调节底物的专一性，从而调节酶催化速率。为探究有机溶剂对GAD 的影响，在底物反应液中加入终浓度为1%的各有机溶剂，在相同条件下反应后测得酶活力，结果见图7。
图7 有机溶剂对GAD 活力影响
Fig.7 Effect of organic solvents on GAD enzyme activity
由图7 可知，丙三醇、丙酮对GAD 影响不大，甲醇、乙醇对GAD 活力有促进作用，正丁醇、叔戊醇、乙腈、正己烷、正庚烷对GAD 活力均有抑制作用，其中正丁醇抑制作用最强，此时的相对酶活仅有58.42%，说明大部分有机溶剂对水相中的酶活力有影响，其中甲醇和乙醇可以成为酶活力调节的促进剂。
2.8 金属离子对GAD 活力影响
金属离子能作为改变生物体内的酶催化反应的促进剂或抑制剂，为探究金属离子对GAD 活力影响，在底物反应液中加入终浓度为1 mmol/L 的金属离子反应后测得酶活力，结果如图8 所示。
图8 金属离子对GAD 活力影响
Fig.8 Effect of metal ions on GAD enzyme activity
由图8 可知，金属离子对GAD 活力有抑制作用，但无强抑制效果，于平等[14]认为金属离子的抑制作用可能是GAD 分子中某些官能团共价结合，影响了酶分子活性中心结构所致。
2.9 米氏常数
米氏常数是指当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，其值是酶催化反应中重要的动力学常数。通过测定不同底物浓度下的产物的量，利用Lineweaver Burk 方程，可得到底物浓度倒数1/[S]与反应速率倒数1/[V]的关系，结果如图9 所示。
图9 重组GAD Lineweaver Burk 方程
Fig.9 Lineweaver Burk plot of recombined GAD
由图9 可得出GAD 的米氏常数Km为19.988 mmol/L，Vmax 为0.263 mmol/（L·min）。
3 结论
本研究以植物乳杆菌CPRGJ 全基因组为模板，通过PCR 扩增得到谷氨酸脱羧酶全长基因gad，通过TA克隆构建E.Coli DH5α-pMD18T-gad，测序的gad 全长后进行密码子优化并构建质粒pET28a-gad，将重组质粒转入E.Coli BL21 中进行诱导表达并探究其酶学性质。GAD 最适反应温度为45 ℃，在温度低于50 ℃时GAD 具有较好的热稳定性；最适pH 值为5.0，当pH值在4.0～6.0 之间时具有良好稳定性；PLP 摩尔浓度为250 µmol/L 时能有效地促进酶反应；有机试剂正丁醇对GAD 有较强的抑制作用；金属离子对GAD 有抑制作用，但无强抑制效果。GAD 的米氏常数Km 为19.988 mmol/L，Vmax 为0.263 mmol/（L·min）。重组酶在酸性条件下具有稳定酶活力，且相对耐高温。本研究为深入了解谷氨酸脱羧酶的酶学性质及γ-氨基丁酸的制备，进而更有效地将其利用到功能性食品的开发研究中提供了参考。
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