磷脂（phospholipid，PL）分子是由一分子甘油、两分子脂肪酸、一分子磷酸基团和一个极性头基组成[1]。PL 独特的理化性质与分子头部的官能团性质和连接酰基链的结构（如不饱和水平，碳链的长度和酰基链的位置）直接相关[2]。一般来说，饱和脂肪酸主要占据sn-1 位置，而不饱和脂肪酸位于sn-2 位置[3]。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种人体必需的n-3 多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3PUFA），主要通过膳食摄入。当PL 的sn-2 位主要为DHA 时，则定义为DHA 磷脂（DHA-PL）。DHA-PL主要来源于海洋生物中，在海洋藻类、磷虾、贻贝、牡蛎、鱿鱼、海参、海胆以及一些鱼类及其副产品中广泛存在[4]。就鱼体部位而言，PL 在鱼卵、鱼头和内脏（如内脏）中含量相对较高。其中鱼卵是PL 形式n-3PUFA 的丰富来源，磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）是主要的脂质类别[5]。鱿鱼所含的PL 具有PC 含量高，DHA占比更丰富的特点。
PL 由于生物功能的多样性和工业应用的广泛性，已经受到越来越多关注。然而，天然PL 的多样性有限，且从自然界中分离出极少量的特定磷脂非常困难。但通过对PL 的定向结构性修饰，可获取一些自然界含量较低的稀有PL 或某些具有特定生理活性的功能PL[6]。这不仅能够满足PL 工业应用的市场需求，还能够根据脂肪酸链和极性基团的性质开发具有特定生理活性的新型PL，实现资源利用的最大化。
PL 的制备方法可分为化学介导法和生物酶法两种，然而化学方法往往需要使用一些具有安全隐患的化学试剂，且工艺复杂，反应条件剧烈，这都限制了它们在食品行业的应用。与化学方法相比，生物酶法修饰具有显著的优势。在修饰过程中条件温和，且大大减少有毒有害溶剂的使用，简化纯化步骤，减少最终产品中的溶剂残留，可为食品、化妆品和药品的结构型PL 提供更安全的替代品[7]。最重要的优势为酶具有底物特异性，通过使用特定的酶和底物，可以获得具有特殊生理活性的目标PL 产物[8]，使用化学方法则难以获得。
磷脂酶D（phospholipase D，PLD，EC 3.1.4.4）[9]能够催化磷脂酰基和含羟基受体结合形成新的磷脂，这种独特的酰基转移作用对磷脂的修饰至关重要，可催化自然界中资源丰富的PC 合成稀有PL[10]。与动植物来源的PLD 相比，微生物来源的PLD 具有更强的转酯能力以及更为广泛的底物选择谱，其中链霉菌来源的PLD 具有较高的转磷脂酰化活性和广泛的底物特异性，得到了广泛的研究[11-12]。PLD 最广泛地应用于新型磷脂的合成和开发方面。PLD 生物催化合成PL 最成熟的技术是将PC 中的胆碱头基与丝氨酸、甘油或乙醇胺的交换，合成常见的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺[13-17]。
目前，磷脂因其丰富的生理活性在食品、药品及化妆品等工业方面均具有广泛的应用。在药物递送方面，PL 已被广泛用于制备局部、口服和亲本药物递送系统的脂质体纳米制剂，具有提高生物利用度、降低毒性和增强膜通透性等优点。脂质体主要由PC 组成，并且还可能含有具有表面活性剂特性的混合脂肪酸链。从大西洋鲑鱼骨架中提取的PL 含有大量的PC（约85%），在药物递送中具有良好的应用前景[18]。在食品加工工业方面，PL 具有独特的两亲性和表面活性，被广泛应用发挥乳化剂、防飞溅、润湿、抗老化、改善储存稳定性与热敏感性等作用[19]。DHA-PL 的脂质体还可用于封装食品成分，亲水性和亲脂性物质都可以通过脂质体方法有效地包埋在PL 双层中[20]。PL 也经常用于许多化妆品配方中，其应用包括润肤剂和用于护肤、护发、化妆品和装饰产品中的特定成分[5]。
本试验挖掘来源于链霉菌（Streptomyces sp. TLI_146）的PLD，异源表达宿主为大肠杆菌BL21（DE3），利用镍离子亲和层析法获得纯酶后对其酶学性质进行研究。从鱿鱼卵中提取DHA 磷脂酰胆碱（DHA phosphatidylcholine，DHAPC）作为底物，在PLD 的催化下探究与不同甘油酯的反应条件，以期为其功能研究和应用开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱿鱼卵：市售；大肠杆菌DH5α 感受态细胞、大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞：北京擎科生物科技股份有限公司；氯化钠、盐酸、柠檬酸、柠檬酸三钠、硫酸铵、甘油、葡萄糖、α-乳糖、乙醇、醋酸、咪唑、氯仿、甲醇、二氯甲烷、丙酮、甘油、4-氨基安替比林、曲拉通、苯酚、胆碱氧化酶、过氧化氢酶（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；磷脂酰胆碱（分析纯）、三乙胺（色谱纯）：德国默克公司；硫酸卡那霉素（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；环戊基甲醚（分析纯）、正己烷（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；单辛酸甘油酯（glycerol monocaprylate，GMC）、单癸酸甘油酯（glycerol monodecanoate，GMD）、单月桂酸甘油酯（glycerol monolaurate，GML）、单棕榈酸甘油酯（glycerol monopalmitate，MP）、单硬脂酸甘油酯（glycerol monostearate，MG）（均为分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。
1.2 仪器与设备
PCR 仪（Applied Biosystems VeritiPro）、冷冻离心机（5804R）：德国艾本德股份公司；恒温水浴锅（DK-98-1）：天津泰斯特仪器有限公司；生物净化台（BCM-1000）：苏州净化设备有限公司；恒温摇床（QYC2112）：上海福玛实验设备有限公司；超声波细胞破碎仪（SCIENTZ-IID）、冷冻干燥机（SCIENTZ-10N）：宁波新芝生物科技股份有限公司；全波长酶标仪（Multiskan Sky）、傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet iS10）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高效液相色谱仪（LC-20AT）、蒸发光散射探测器（ELSD-16）：日本岛津公司；旋转蒸发仪（N-1300）：东京理化器械株式会社。
1.3 方法
1.3.1 目的基因的挖掘
在PDB 数据库中以来源于抗生素链霉菌的2ZE4 PLD 基因序列为参考模板，利用National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库检索并进行序列比对，筛选出具有潜在PLD 活性的基因片段，命名为Sp-TLI146（GenBank：PKV 83864.1）。根据宿主大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）的密码子偏好性，对该基因序列进行密码子优化，在E.coli 中进行高效表达。使用SignalP-5.0 网站（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）对PLD 蛋白质序列进行信号肽预测；使用NCBI 网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对PLD 蛋白的结构域在线预测；使用ClustalX 软件和ESPript 在线网站（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）进行多序列比对；使用NovoPro（https：//www.novopro.cn/tools/）预测蛋白质的分子量和等电点。
1.3.2 重组质粒的获取及转化
选用pET28a（+）作为载体，在Snap Gene 软件上构建大肠杆菌重组质粒pET28a-Sp-TLI146 的质粒图谱，由北京擎科生物科技股份有限公司进行重组质粒的全基因合成。将构建成功的重组质粒pET28a-Sp-TLI146 采用热激法转入到E.coli BL21（DE3）中。
挑取平板中的大肠杆菌单菌落至10µL 的无菌水中，取2µL 进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）阳性克隆验证，PCR 体系采用2×Flash PCR MasterMix（Dye），结束后使用琼脂糖凝胶电泳验证。
1.3.3 重组质粒的诱导表达与纯化
取重组pET28a-Sp-TLI146 大肠杆菌菌液接入溶菌肉汤培养基（luria-bertani，LB）中[1%接种量，0.05%硫酸卡那霉素，活化8～12 h，37 ℃，200 r/min]。在ZYP-5052 培养基中加入活化好的菌株（1% 接种量，0.05%硫酸卡那霉素），诱导蛋白表达（20 ℃，220 r/min，44 h）。发酵完毕后离心（4 ℃，8 000 r/min，10 min），去除上清液，加入适量去离子水吹打混匀，涡旋振荡后在冰浴状态下超声破碎（300 W，30 min），离心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），收集上清液即为PLD 粗酶液。粗酶液经镍离子亲和层析柱吸附后用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白电泳检测蛋白质的表达情况和纯化效果。
1.3.4 PLD Sp-TLI146 水解酶活测定
采用比色法对重组PLD Sp-TLI146 的水解酶活进行测定。PLD 水解活力定义为每分钟水解释放1µmol胆碱所需要的酶量为一个单位。反应底物为PC，加入10 µL 0.1 mol/L pH6.0 柠檬酸缓冲液、5 µL 0.1 mol/L氯化钙缓冲液、15 µL7.5% 曲拉通，加入酶液100 µL后于37 ℃反应20 min，沸水浴5 min 终止反应，冷却至室温后加入0.2 mL 显色液于37 ℃反应3 h，反应结束后于500 nm 处测定吸光度。
显色液的配制：向100 mL pH 8.0 的1 mol/L Tris-盐酸缓冲液加入200 mg 4-氨基安替比林、1 mL 曲拉通、50 mg 苯酚、50 U 胆碱氧化酶、100 U 过氧化氢酶。
1.3.5 PLD Sp-TLI146 酶学性质探究
1.3.5.1 最适温度及温度稳定性
为考察温度对PLD Sp-TLI146 水解活力的影响，分别将该酶置于35、40、45、50、55、60、65、70 ℃条件下反应20 min，按照酶联比色法进行水解酶活的测定。
为考察PLD Sp-TLI146 温度的稳定性，将该酶分别置于40、45、50、55、60 ℃下孵育0、1、2、4、8、12、24、48、60 h，每组反应做3 个平行。按照酶联比色法测定水解酶活，对残余酶活（X，%）进行计算，其计算公式如下。
式中：A1为孵育不同时间时酶水解酶活，µmol/µL；A0为0 h 时酶水解酶活，µmol/µL。
1.3.5.2 最适pH 值及pH 值稳定性
为考察pH 值对PLD Sp-TLI146 水解酶活的影响，改变比色法测定酶活条件中的缓冲盐溶液及相应的pH 值，分别在pH 值为3.0、4.0、5.0、6.0 的柠檬酸盐缓冲液，pH 值为6.0、7.0、8.0 的磷酸盐缓冲液，pH 值为8.0、9.0 的Tris-盐酸缓冲液和pH 值为9.0、10.0 的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行反应，每组反应做3 个平行，结束后在500 nm 测定吸光度。
为考察PLD Sp-TLI146 水解酶活对pH 值的稳定性，将该酶液置于上述不同pH 值缓冲液环境中，并在4 ℃冰箱内过夜孵育，每组反应做3 个平行。孵育结束后按照酶联比色法测定水解酶活，对残余酶活进行计算，计算公式同1.3.5.1。
1.3.5.3 金属离子的影响
为探究金属离子对PLD Sp-TLI146 水解酶活的影响，改变酶联比色法测定水解酶活反应体系中金属离子种类，分别为0.1 mol/L 的Ca2+、Na+、K+、Mn2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+，按照酶联比色法测定水解酶活，对残余酶活进行计算，计算公式同1.3.5.1。
1.3.6 双相反应体系合成DHA 磷脂酰单甘油酯
使用Floch 法[21]提取鱿鱼卵中的DHAPC 作为底物。有机相：选取环戊基甲醚溶解底物DHAPC，底物浓度20 mg/mL；水相：50 mmol/L 的无水CaCl2 溶于20 mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）。底物分别为GMC、GMD、GML、MP、MG 和甘油，底物浓度30 mg/mL。在棕色反应瓶中以有机相∶水相=1∶1（体积比）加入底物混合振荡反应（40 ℃，12 h，220 r/min）。反应结束后，离心（4 ℃，10 min，8 000 r/min）收集上层反应溶液，去除有机相后分别得到DHA 磷脂酰单辛酸甘油酯（DHA phosphatidyl monocaprylate，DHAPL-GMC）、DHA磷脂酰单癸酸甘油酯（DHA phosphatidyl monodecanoate，DHAPL-GMD）、DHA 磷脂酰单月桂酸甘油酯（DHA phosphatidyl monolaurate，DHAPL-GML）、DHA 磷脂酰单棕榈酸甘油酯（DHA phosphatidyl monopalmitate，DHAPL-MP）、DHA 磷脂酰单硬脂酸甘油酯（DHA phosphatidyl monostearate，DHAPL-MG）、DHA 磷脂酰甘油（DHA phosphatidylglycerol，DHAPG）。反应产物使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）检测。
HPLC-蒸发光散射检测：流动相A 为正己烷∶异丙醇∶醋酸∶三乙胺=81.42∶17∶1.5∶0.08（体积比）；流动相B 为异丙醇∶水∶醋酸∶三乙胺=84.42∶14∶1.5∶0.08（体积比）；色谱柱选择YMC DIOL 柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），柱温设置为55 ℃，流速为1 mL/min。
FTIR：波数范围分别为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，共扫描64 次。
1.3.7 DHA 磷脂酰单甘油酯的反应体系研究
以DHAPC 为底物，GMC、GMD、GML、MP、MG 及甘油为副底物，PLD 为催化剂，通过对底物摩尔比n（DHAPC∶甘油酯）及n（DHAPC∶甘油）、反应温度、有机相与水相的比例以及加酶量进行调控，来确定DHA磷脂酰单甘油酯的最佳合成条件。通过HPLC 检测反应体系中DHA 磷脂酰单甘油酯、DHAPC、和PA 的峰面积以计算其转化率（Y，%），其计算公式如下。
式中：S1 为反应t 时间后DHA 磷脂酰单甘油酯的峰面积；St 为反应t 时间后剩余的PC 的峰面积；S2 为反应t 时间后副产物的峰面积。
1.4 数据处理
试验结果以平均值±标准偏差进行统计，应用Origin 2018 软件作图，SPSS 27 进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 Sp-TLI146 序列分析结果
Sp-TLI146 的NCBI 保守结构域分析、SignalP-5.0的信号肽预测及多序列比对分析结果见图1。
图1 Sp-TLI146 序列分析结果
Fig.1 Sequence analysis results of Sp-TLI146
A.NCBI 保守结构域分析和SignalP-5.0 的信号肽预测；B.多序列比对分析结果。
Sp-TLI146 来源于链霉菌属Streptomyces sp. TLI_146，其开放阅读框总长度为1 587 bp，编码529 个氨基酸序列，经预测其蛋白分子量为66.78 kDa，等电点为6.25。由图1 可知，经过网站SignalP 5.0 预测，此蛋白序列的N 端含有一段17 个氨基酸残基组成的信号肽；NCBI 保守结构域分析发现此蛋白序列内部包含两段PLD 家族的保守结构域，说明其为PLD 家族。根据保守氨基酸分析及多序列比对结果可知，PLD Sp-TLI146 具有两段PLD 高度保守的HKD 催化活性中心，其关键催化位点为His191、Lys193、Asp198 以及His463、Lys465、Asp470。
2.2 PLD Sp-TLI146 的克隆表达与纯化分析结果
PLD Sp-TLI146 的克隆表达与纯化分析结果见图2。
图2 PLD Sp-TLI146 克隆表达与纯化结果
Fig.2 Results of cloning expression and purification of PLD Sp-TLI146
A.Sp-TLI146-pET28a 重组质粒图谱；B.阳性克隆验证结果；C.PLD Sp-TLI146 酶的蛋白电泳图；M1.15 000 bp DHA marker；图2B 中的1～6 为重组质粒条带；M2.5～245 kDa marker；图2C 中的1～7 为重组蛋白条带。
由图2 可知，在SnapGene 软件上成功构建PLD pET28a-Sp-TLI146 的质粒图谱，随后进行全基因合成。对成功转入E. coli BL21（DE3）的单菌落进行阳性验证。将验证成功的重组质粒工程菌在ZYP-5052 培养基中进行发酵表达得到粗酶液。利用Ni-NTA 对其C端6×His 标签的特异吸附能力，对其进行镍离子亲和层析纯化。该酶可以在80 mmol/L 和100 mmol/L 咪唑缓冲液洗脱下来，且在63～75 kDa 处有单一条带，表明此重组蛋白可以成功纯化得到纯酶并用于接下来的研究。
2.3 PLD Sp-TLI146 的水解酶活测定结果
根据Bradford 法[22]中对水解酶活的检测方法，在595 nm 测定吸光度后计算得出重组PLD Sp-TLI146 蛋白浓度为0.342 6 mg/mL。经过比色法检测后该酶的水解酶活为0.57µmol/µL，其比酶活为15.38 U/mg。相比较来源于Streptomyces sp.的PLD 分别在Bacillus subtilis，Pichia pastoris 和Corynebacterium glutamicum 异源表达后，酶活仅有0.14、0.22 U/mg 和0.25 U/mg[14]。
2.4 PLD Sp-TLI146 的最适温度及温度稳定性分析结果
PLD Sp-TLI146 相对酶活随温度的变化见图3。
图3 PLD Sp-TLI146 最适温度
Fig.3 Optimum temperature of PLD Sp-TLI146
由图3 可知，温度对PLD Sp-TLI146 的酶活具有较大的影响，温度为65 ℃时，PLD Sp-TLI14 的水解酶活力达到最高值2.00 µmol/µL。在50～65 ℃范围内，相对酶活仍高于60%。总体来看，PLD Sp-TLI146 在整个温度范围内酶活变化较大，说明它对于温度的变化较为敏感。同样是海洋来源的链霉菌Streptomyces klenkii 的PLD 最适温度也较高，为60 ℃，当温度高于60 ℃后，酶活急速下降[23]。
PLD Sp-TLI146 的温度稳定性结果见图4。
图4 PLD Sp-TLI146 的温度稳定性
Fig.4 Temperature stability of PLD Sp-TLI146
由图4 可知，该酶在40、45、50 ℃放置10 h 后仍保持原活性的80%以上，在55、60 ℃放置10 h 后相对酶活明显下降，在60 ℃放置24 h 后几乎完全失活。而在40、45、50、55 ℃放置60 h 后仍具有一定的活性，说明此重组PLD Sp-TLI146 酶表现出良好的热稳定性，有利于工业化应用。
2.5 PLD Sp-TLI146 的最适pH 值及pH 稳定性分析结果
PLD Sp-TLI146 相对酶活随pH 值的变化见图5。
图5 PLD Sp-TLI146 的最适pH 值
Fig.5 Optimal pH of PLD Sp-TLI146
由图5 可知，PLD Sp-TLI146 在pH6.0 的磷酸-磷酸钠缓冲液中相对酶活最高，在pH 4.0 ～8.0 之间相对酶活均高于70%，在pH 值低于4.0 或者高于9.0 的酸碱条件下，PLD Sp-TLI146 的相对酶活均不高。这与大多数关于PLD 的报道一致[13，23-25]。
PLD Sp-TLI146 的pH 值稳定性结果见图6。
图6 PLD Sp-TLI146 的pH 值稳定性
Fig.6 pH stability of PLD Sp-TLI146
由图6 可知，PLD Sp-TLI146 在pH6.0～9.0 范围内相对酶活超过80%，而当pH 值低于5.0 时，相对酶活降低明显，说明酸性条件对Sp-TLI146 的酶活有较大影响，相对来看，Sp-TLI146 在中性及碱性环境中的稳定性比在酸性环境中更好，除此之外，在相同pH 值的不同缓冲溶液中，PLD Sp-TLI146 表现出不同的pH 值稳定性。
2.6 金属离子对PLD Sp-TLI146 活性的影响
为考察金属离子对PLD Sp-TLI146 水解活力的影响，改变酶联比色法测定水解酶活反应体系中金属离子的种类，结果见图7。
图7 金属离子对PLD Sp-TLI146 酶活的影响
Fig.7 Effect of metal ions on the enzymatic activity of PLD Sp-TLI146
由图7 可知，发现Ca2+、K+、Na+对PLD Sp-TLI146具有明显的促进作用，使相对酶活提高30%左右；Ba2+、Zn2+、Fe3+离子对酶的活力表现出明显的抑制作用。
2.7 DHA 磷脂酰单甘油酯高效液相色谱分析
PLD Sp-TLI146 催化后，产物DHA 磷脂酰单甘油酯HPLC 分析结果见图8。
图8 DHA 磷脂酰单甘油酯产物HPLC 分析
Fig.8 HPLC analysis of DHA phosphatidyl monoglyceride products
A.DHAPC 与DHA 磷脂酰单甘油酯；B.DHAPC 与DHAPG。
在以双相体系作为反应系统的转酯反应中，DHAPC 作为酰基供体，甘油及甘油酯是PLD 的第二底物。由图8 可知，DHAPC 的出峰时间为11.5 min，在添加过量的甘油酯和甘油后，体系中DHAPC 几乎没有峰出现，说明DHAPC 几乎完全消耗。进一步分析可知，每种产物的出峰时间并不相同，DHAPL-GMC出峰时间为9 min，DHAPL-GMD 出峰时间为8.3 min，DHAPL-GML 出峰时间为7.9 min，DHAPL-MP 出峰时间为6.8 min，DHAPL-MG 出峰时间为6.5 min。DHAPG 的出峰时间为13.3 min，这与DHAPG 的标品出峰时间是相吻合的，说明DHAPG 能够成功合成。总体来看，经过HPLC 的验证，能够初步确认PLD Sp-TLI146 可以催化DHAPC 与单酰基甘油酯和甘油生成新的DHA 磷脂酰甘油酯化合物。
2.8 DHA 磷脂酰单甘油酯傅里叶变换红外光谱分析
DHA 磷脂酰单甘油酯傅里叶变换红外光谱结果见图9。
图9 DHA 磷脂酰单甘油酯的FTIR
Fig.9 FTIR of DHA phosphatidyl monoglycerides
由图9 可知，反应结束后，由DHAPC 中三甲基季铵的伸缩振动体现的968 cm-1 处的特征吸收峰消失，说明甘油酯与DHAPC 发生了转酯反应，替换了DHAPC 中的胆碱基团。
2.9 底物摩尔比对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响
为选择合适的底物用量，对每种底物摩尔比进行考察，5 种甘油酯底物摩尔比对转化率的影响见图10。
图10 DHA 磷脂酰单甘油酯在不同底物摩尔比条件下的底物转化率
Fig.10 Substrate conversion of DHA phosphatidyl monoglyceride at different substrate molar ratios
由图10 可知，DHAPL-GMC、DHAPL-GMD、DHAPLGML、DHAPL-MP 的底物摩尔比为先增加后降低的趋势。与Bogojevic 等[26]在探究底物摩尔比因素对磷脂酰单甘油酯的合成影响时的结果相似。GMC、GMD、MP 的最适底物摩尔比均为1∶2，其底物转化率分别为95.05%、93.77% 和90.85%；当GML 的底物摩尔比为1∶4 时，DHAPL-GML 的转化率为90.94%。MG 具有随着底物摩尔比增加底物转化率逐渐增加的趋势，在MG 底物摩尔比为1∶5 时，产物转化率可达98.12%。
DHAPG 不同，甘油底物摩尔比对转化率的影响见图11。
图11 DHAPG 在不同底物摩尔比条件下的底物转化率
Fig.11 Substrate conversion of DHAPG at different substrate molar ratios
由图11 可知，对于DHAPG，随着甘油量的增加，底物转化率不断增大，但增加到一定量时，DHAPG 的底物转化率不随着甘油的添加而增大，当甘油的底物摩尔比达到1∶22 时，DHAPG 的转化率为96.25%。与Chen 等[16]研究结果相似（转化率96.4%）。
2.10 温度对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响
温度对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响结果见图12。
图12 DHA 磷脂酰单甘油酯在不同温度条件下的底物转化率
Fig.12 Substrate conversion of DHA phosphatidyl monoglycerides at different temperatures
由图12 可知，DHAPL-GMC、DHAPL-GMD、DHAPLGML 的产物转化率随着温度升高逐渐增加，后趋于平缓，当温度增加到40～45 ℃时，转化率几乎没有变化，在40 ℃时，转化率分别为98.49%、98.42%、95.79%。DHAPL-MP 和DHAPL-MG 的转化率随着温度的升高先增加后降低，DHAPL-MP 在40 ℃时转化率最高（97.15%），DHAPL-MG 在35 ℃时转化率最高（75.56%）。对于DHAPG，当温度从40 ℃升高时，DHAPG 的转化率没有明显的变化，所以DHAPG 反应的最适温度为40 ℃，转化率为88.96%。然而，DHA-MG 的转化率在35 ℃后下降趋势尤为明显，说明此产物不适宜在高温状态下反应，且其酶催化效率对温度的变化较为敏感。
2.11 有机相/水相比对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响
有机相/水相比对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响结果见图13。
图13 DHA 磷脂酰单甘油酯在不同有机相/水相体积比条件下的底物转化率
Fig.13 Substrate conversion of DHA phosphatidyl monoglycerides under different organic phase/aqueous phase comparison conditions
由图13 可知，当环戊基甲醚与水相的体积比为1∶2 时，DHAPL-GMC、DHAPL-GMD 转化率最高，分别为92.39%和90.71%，当水相体积逐渐增加时，转化率随之下降。DHAPL-GML、DHAPL-MP、DHAPG 的最适有机相/水相比为1∶3，转化率分别为90.44%、82.49%、90.78%。更进一步来看，当有机相/水相体积比不同时，DHAPL-MG 和DHAPG 的转化率有波动现象，但是当水相比例逐渐增加时，DHAPL-MP 的转化率下降速度幅度较大，说明有机相与水相的体积比对于Sp-TLI146 催化DHAPC 产生这几种DHA 磷脂酰单甘油酯的影响较大。与Wu 等[27]对于有机相/水相因素的研究结果不同，当有机相与水相的体积比由1∶3 变化到3∶1 时，对于磷脂酰糖苷的转化率影响并不大，均在90%左右。
2.12 PLD 添加量对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响
PLD 添加量对DHA 磷脂酰单甘油酯的合成影响结果见图14。
图14 DHA 磷脂酰单甘油酯在不同PLD 添加量条件下的底物转化率
Fig.14 Substrate conversion of DHA phosphatidyl monoglycerides under different PLD addition conditions
由图14 可知，DHA 磷脂酰单甘油酯的底物转化率是随着PLD 的添加量增加逐渐增大的，当PLD 的添加量在10 mg 时，底物转化率达到了峰值，所以选定最佳PLD 添加量为10 mg。
3 结论
本研究从链霉菌中克隆获得一个PLD 的编码基因Sp-TLI146，并将其在E.coli BL21（DE3）中实现异源表达，获得了具备优良转酯活性的PLD Sp-TLI146。试验验证该酶表现出较强的温度适应性和弱酸性适应能力，最适温度为65 ℃，在50～65 ℃范围内，相对酶活力仍高于60%；最适pH 值为6.0（磷酸-磷酸钠缓冲液），在pH4.0～8.0 时，相对酶活均高于70%。进一步从鱿鱼卵中成功提取并纯化到DHAPC，将其作为底物以该PLD Sp-TLI146 作为催化剂与6 种甘油酯进行转酯反应，成功构建所有底物的最优反应体系，最优条件下产物的转化率均可达到90% 以上。本研究获得了一个具有较高转酯活性的PLD，并利用该酶催化合成了新型结构型DHA 磷脂酰单甘油酯，反应工艺简单且高效，为稀有的功能性PL 的大量制备及其功能活性研究奠定了基础。另外，本研究中所挖掘的PLD Sp-TLI146 还可进一步尝试其他含DHA 的结构型PL 的酶促合成，对于扩大稀有和罕见PL 物种的知识和可用性具有重要意义。
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