随着人们生活水平的提高,对于富含优质蛋白质和营养元素的虾类水产品需求越来越高。虾类水产品从养殖到餐桌,需要历经捕捞、运输、装卸及配送等环节,在此过程中鲜活水产品因与容器碰撞、挤压等受惊吓和伤害而产生应激反应,导致肤体损伤,引发水产病,降低存活率和商品价值[1]。为避免流通过程中虾类的应激反应,养殖户或商户使用精神类药物以降低新陈代谢,提高存活率,从而导致精神类药物在虾类中残留,成为影响虾肉食品品质安全的重要因素[2]。此外,由于人类在社会生产活动中精神类药物的乱用和滥用,其消费量持续攀升,导致水生环境中精神类药物污染排放日益严重,水生动物体内富集的精神类药物种类和浓度不断增加[3]。目前,虾肉中常见的精神类药物包括苯二氮卓类、吩噻嗪类、巴比妥类药物等,这些精神类药物残留会使虾肉存在以下食品安全问题,如致癌、致畸、中毒及突变等,造成身体健康与生态环境的危害,阻碍水产业健康发展[4]。
虾肉基质复杂,有害物质的含量低,需对其进行分离富集后才能进行检测,适宜的样品处理和分析方法成为决定虾肉中精神类药物残留水平分析准确性的关键[5]。由于固相萃取净化效果好且操作简单,商品化的固相萃取柱更适用于快速分析,因此以固相萃取为基础的样品前处理技术在兽药残留分析中得到广泛研究和应用[6-7]。高效液相色谱-质谱联用法由于进样体积小、溶剂消耗少、灵敏度高、定性准确及检测速度快等特点,是现阶段动物源性精神类药物残留检测的重要手段[8-9]。目前,水产品中精神类药物残留的研究多是以鱼类可食用部分为基质,关于虾肉精神类药物残留的品质标准和相关研究主要集中于单一药物残留检测,针对多组分的高通量分析方法较少[10]。水产品中精神类药物残留标准分散、前处理复杂、灵敏度低及基质效应影响等技术难题已成为制约水产品品质安全监管的难点。
基质效应是高效液相色谱-质谱联用法分析动物源性兽药残留不可忽视的关键因素[11]。研究表明,基质效应是由生物基质引起的目标分析物质谱响应与浓度之间的非线性问题,非目标物质与目标化合物共流入并严重干扰目标化合物离子化过程,导致信号增强或减弱,进而影响待测物的检出限、定量限、线性关系、准确度和精密度等,因此在质谱分析方法开发和验证过程中必须对基质效应进行评价[12-13]。由于基质效应成因复杂、来源广泛、相互影响,动物源性食品兽药残留检测中的基质效应已经引起广泛的关注并成为研究的热点[14]。本研究建立虾肉中苯二氮卓类、吩噻嗪类、巴比妥类、卡因类等40 种精神类药物残留固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测方法,并进一步讨论和评价基质效应的影响,以期为水产品品质安全监管的针对性和多组分分析靶向性提供参考。
新鲜虾肉:市售,样品取可食用部分,经刀式研磨仪绞碎,混匀后于-20 ℃冰箱中冷冻贮存,待分析检测。
40 种精神类药物[地西泮、硝西泮、氟硝西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、去甲西泮、替马西泮、氯硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、咪达唑仑、氯丙嗪、异丙嗪、丙酰丙嗪、乙酰丙嗪马来酸酯、氟奋乃静、甲苯塞嗪、甲喹酮、氟哌啶醇、氟哌利多、咔唑心安、唑吡坦、奥氮平、齐拉西酮、阿利哌唑、阿普吡妥、氯氮卓、间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)、间氨基苯甲酸、苯佐卡因、对氨基苯甲酸、对乙酰氨基苯甲酸、氯普鲁卡因、普鲁卡因胺、利多卡因、辛可卡因、布比卡因、丙胺卡因、罗哌卡因]标准品(纯度均大于98.0%):德国Dr.Ehrenstorfer 公司;甲醇、乙腈(均为色谱纯):德国默克公司;甲酸(分析纯):广东光华化学厂有限公司;Cleanert Alumina-NSPE 固相萃取柱:美国Agela 公司;CAPCELL PAK C18 BB-H 液相色谱柱(3µm,2.1 mm×150 mm):日本资生堂公司。试验用水为超纯水。
QTRQAP 4500 三重四极杆液质联用仪:美国AB公司;Advantage A10 超纯水机:德国密理博公司;PGC753e 型电子天平:艾德姆衡器(武汉)有限公司;Multi Reax 型全自动振荡器:德国海道尔夫公司;X3R型高速冷冻离心机:赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Genius NM32LA 型氮气发生器:毕克气体仪器贸易(上海)有限公司;ATR Autovap S60 型多样品自动浓缩仪:力德生物科技(上海)有限公司;GRINDOMIX GM 200刀式研磨仪:德国Retsch(莱驰)公司。
1.2.1 样品处理
称取解冻后样品约2.00 g(精确到0.01 g),于20 mL聚酯离心管中,加入80% 乙腈水溶液定容至5.0 mL,振荡10 min 后,于-10 ℃冷冻离心(10 000 r/min,5 min),取上清液待用。离心管中的残渣再加入80% 乙腈5 mL,重复提取一次,合并两次上清液待净化。将合并的上清液加入固相萃取柱(Cleanert Alumina-N-SPE,无需活化)内,保持流速1 滴/s,收集流出液,于40 ℃氮吹至近干,用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL,涡旋混匀后离心(10 000 r/min,离心5 min)取上清液过0.22 µm滤膜,待测。
1.2.2 标准溶液的配制
分别精密称取40 种镇静麻醉类药物标准物质10 mg(精确至0.000 1 g),置于50 mL 容量瓶,加适量的甲醇溶解,并定容至刻度,摇匀,配制成浓度为200µg/mL混合标准储备液。吸取混合标准储备液5.00 mL,置于100 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,配制成浓度为10.0µg/mL 混合标准使用液。
精确称取样品约2.00 g(精确到0.01 g),分别加入混合标准使用液按1.2.1 中的方法处理样品,提取得质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0µg/kg 的混合标准曲线溶液。以40 种精神类药物的质量浓度为横坐标,对应定量离子的色谱峰面积为纵坐标绘制基质标准曲线。同时配制相同质量浓度的溶剂标准曲线溶液(以10%乙腈水溶液为溶剂)并绘制溶剂标准曲线。
1.2.3 加标回收率的测定
称取解冻后样品约2.00 g(精确到0.01 g),加入40 种精神类药物混合标准使用液按1.2.1 中的方法处理样品,提取得质量浓度为20µg/kg 的回收溶液,每个加标浓度平行测试6 次,分别代入基质标准曲线和溶剂标准曲线,外标法定量计算平均回收率与精密度。
1.3.1 色谱条件
色谱柱为CAPCELLPAK C18 BB-H(2.1 mm×150 mm,3µm),流动相A 为10%甲酸-水溶液,流动相B 为乙腈溶液,梯度洗脱程序如表1 所示。流速0.3 mL/min,进样体积20µL,色谱柱温度35 ℃。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间/min 1.00 3.00 7.00 11.00 15.00 16.00 18.00 18.50流动相A/%90 75 75 55 55 10 10 90流动相B/%10 25 25 45 45 90 90 10
1.3.2 质谱条件
电喷雾离子源(electron spray ionization,ESI);监测模式:多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM);扫描模式:正离子扫描;电喷雾电压(slectrospray voltage,IS):4 500 V;离子源温度(ion source temperature,TEM):550 ℃;气帘气(curtain gas,CUR)流速:30 L/min;雾化气(atomization gas,GS1)流速:55 L/min;辅助加热气(auxiliary heating gas,GS2)流速:55 L/min;射入电压(input voltage,EP):10 V。
采集后的数据使用MultiQuant 3.0.2 分析软件进行定量定性分析并建立标准曲线;数据图谱使用Origin 2021 进行分析绘制;多变量分析使用SIMCA 14.1进行分析。
虾肉中含有较高的蛋白质,且苯二氮卓类精神药物为脂溶性物质,乙腈是极性较强的有机溶剂,对油脂、无机盐、有机盐和高分子化合物均有很好的溶解性[15]。根据“相似相溶”原理,使用80%乙腈作为提取溶剂可以溶解脂溶性物质和沉淀蛋白质,提高药物残留的溶解率[16]。在固相萃取中,由于精神类药物多为弱极性有机化合物,因此水产品中精神类药物残留分析中应用最多的是反相(solid phase extraction,SPE)柱[17-18]。固相萃取采用中性氧化铝Cleanert Alumina-NSPE 固相萃取柱能够很好地保留和富集残留组分,消除蛋白质和脂肪对目标物的干扰,提高萃取效率。此外,在高效液相色谱段采用梯度洗脱程序,也能进一步将富集的各待测组分进行有效分离,提高质谱检测的灵敏度和精确性[19]。虾肉中40 种精神类药物残留线性参数如表2 所示。
表2 虾肉中40 种精神类药物残留线性参数
Table 2 Linear parameters of 40 psychotropic drug residues in shrimp meat
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12成分地西泮硝西泮氟硝西泮劳拉西泮奥沙西泮去甲西泮替马西泮氯硝西泮艾司唑仑阿普唑仑三唑仑咪达唑仑相对分子质量284.74 281.27 283.30 321.16 286.71 270.71 300.75 315.72 294.74 308.76 343.21 325.77基质线性回归方程y=8.51×104x+4.30×104 y=1.29×104x+5.10×103 y=2.82×105x+5.40×104 y=5.63×105x+1.32×105 y=6.24×105x+8.95×104 y=6.31×104x+2.86×104 y=7.81×105x-3.53×104 y=1.13×106x+3.04×105 y=4.44×105x-2.49×104 y=1.69×105x-3.33×104 y=3.22×105x+1.69×104 y=7.24×104x+1.70×104相关系数0.996 2 0.998 3 0.999 5 0.997 4 0.999 1 0.998 0 0.999 5 0.998 5 0.999 8 0.998 9 0.998 5 0.999 2检出限/(µg/kg)0.058 0.016 0.011 0.023 0.273 0.093 0.076 0.020 0.012 0.052 0.018 0.127定量限/(µg/kg)0.194 0.056 0.037 0.070 0.912 0.281 0.253 0.068 0.040 0.156 0.059 0.423
续表2 虾肉中40 种精神类药物残留线性参数
Continue table 2 Linear parameters of 40 psychotropic drug residues in shrimp meat
序号13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40成分氯丙嗪异丙嗪丙酰丙嗪乙酰丙嗪马来酸酯氟奋乃静甲苯塞嗪甲喹酮氟哌啶醇氟哌利多咔唑心安唑吡坦奥氮平齐拉西酮阿利哌唑阿普吡妥氯氮卓MS-222间氨基苯甲酸苯佐卡因对氨基苯甲酸对乙酰氨基苯甲酸氯普鲁卡因普鲁卡因胺利多卡因辛可卡因布比卡因丙胺卡因罗哌卡因相对分子质量318.87 284.43 376.94 442.53 437.52 220.33 250.30 375.86 379.44 298.38 307.40 312.43 412.93 448.39 210.23 299.76 261.29 137.14 165.19 137.14 179.17 307.22 235.33 234.34 343.46 288.43 220.32 274.41基质线性回归方程y=1.90×105x+5.98×104 y=1.33×106x+3.36×105 y=4.08×105x+1.86×104 y=2.47×105x+7.08×104 y=1.82×105x+1.83×104 y=5.73×104x+1.02×104 y=6.24×104x+1.48×104 y=5.16×104x+2.26×104 y=2.07×104x+3.93×104 y=1.44×105x+1.92×104 y=3.28×104x+2.89×104 y=5.60×104x+5.77×103 y=1.74×105x+1.77×104 y=2.04×105x+2.04×103 y=7.28×104x+3.42×104 y=2.46×105x-6.18×103 y=1.52×106x+4.15×105 y=1.15×105x-1.35×104 y=1.40×106x+2.99×105 y=1.09×105x-1.07×104 y=2.56×105x+7.27×103 y=1.08×106x+6.64×105 y=4.47×105x-1.75×105 y=3.13×106x+5.58×105 y=1.53×106x+5.47×105 y=3.39×106x+1.22×106 y=2.09×106x+6.06×105 y=2.92×106x+1.07×106相关系数0.996 2 0.994 5 0.995 0 0.998 7 0.997 5 0.999 2 0.999 6 0.997 2 0.999 6 0.999 6 0.998 1 0.999 7 0.999 9 0.999 2 0.995 4 0.998 6 0.996 1 0.997 5 0.997 9 0.997 0 0.998 4 0.993 4 0.997 6 0.997 1 0.996 8 0.991 3 0.995 2 0.995 7检出限/(µg/kg)0.004 0.066 0.231 0.322 0.138 0.071 0.048 0.098 0.012 0.108 0.064 0.067 0.087 0.065 0.002 0.031 0.026 0.019 0.020 0.016 0.010 0.002 0.001 0.004 0.001 0.005 0.039 0.002定量限/(µg/kg)0.012 0.220 0.669 0.875 0.460 0.237 0.161 0.328 0.042 0.361 0.215 0.225 0.291 0.216 0.006 0.103 0.086 0.063 0.068 0.053 0.033 0.006 0.003 0.013 0.005 0.016 0.132 0.007
由表2 可知,40 种精神类药物残留基质曲线相关系数均大于0.99,线性良好;检出限及定量限均小于1.0µg/kg,说明该方法具有较高的灵敏度。虾肉中40 种精神类药物残留总离子流图见图1。
图1 虾肉中40 种精神类药物残留总离子流图
Fig.1 Total ion flow of 40 psychotropic drug residues in shrimp meat
由图1 可知,经固相萃取及梯度洗脱后残留药物的质谱峰型良好,分离度较高,说明该方法适用于虾肉中精神类药物残留的分析。
由于水产品中富含大量的蛋白质和脂质类物质,其含量和结构复杂,在样品处理过程中容易对目标物质产生干扰,因此基质效应是影响水产品中兽药残留检测定量结果准确性的重要因素[20]。基质效应是指由于待测物以外其他物质的存在或其他物理、化学因素直接或间接影响离子化效果,从而影响待测物响应的现象[21-22]。基质效应因子的计算公式如下。
式中:M 为基质效应因子,%;Km 和Ks 分别表示基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。结果为负数表示基质抑制效应,结果为正数表示基质增强效应。当20%>M>-20%时为弱基质效应;-50%<M<-20%或20%<M<50%时为中等基质效应;当M<-50%或>50%时为强基质效应[23]。
目前基质效应产生的详细作用机制尚未清晰,但普遍认为产生基质效应的主要原因是共提取的基质干扰物与分析物存在竞争电离,影响结果的判定[24]。虾肉中40 种精神类药物残留的基质效应如图2 所示。
图2 虾肉中40 种精神类药物残留的基质效应
Fig.2 Matrix effects of 40 psychotropic drug residues in shrimp meat
由图2 可知,1/4 的精神类药物具有基质增强效应,主要为硝西泮、替马西泮和阿普唑仑等苯二氮卓类药物,基质增强效应容易在分析过程中引起假阳性现象。与此相反,大部分的精神类药物都存在基质抑制效应,其中丙酰丙嗪、氟哌利多和普鲁卡因胺为明显的强基质抑制效应,如不积极进行补偿,消除基质干扰,极易导致假阴性结果产生。
基质效应的产生及强度主要取决于待测物的结构性质、前处理方法、样品基质成分等多种因素,基质效应在化学分析中客观存在,不可能被完全消除[25]。研究表明对于动物源性食品兽药残留高效液相色谱-质谱分析,基质匹配标准曲线校正是消除或补偿基质效应的有效方法[26]。虾肉中40 种精神类药物残留基质效应对回收率的影响见图3。
图3 虾肉中40 种精神类药物残留基质效应对回收率的影响
Fig.3 Influence of matrix effects on the recovery rate of 40 psychotropic drug residues in shrimp meat
由图3 可知,95% 的精神类药物残留基质曲线回收率比溶剂曲线回收率普遍提高了10% 以上;其中,苯佐卡因和普鲁卡因胺基质曲线回收率分别为溶剂曲线回收率的3.5 倍和15.6 倍,说明基质匹配标准曲线校正能有效消除或补偿虾肉中精神类药物残留的基质效应。然而,与其他精神类药物相反,间氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸的基质曲线回收率反而远低于溶剂曲线回收率,仅为溶剂曲线回收率的8.6%和10.5%。结合2.2 中基质效应的计算结果分析,出现该现象的原因可能是间氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸为弱基质效应,但虾肉的结构特性、样品预处理方法及色谱条件对于这两种成分具有严重的干扰和屏蔽作用,基质匹配标准曲线校正并不能很好地消除或补偿基质效应带来的影响,对于该类成分可以考虑采用同位素内标法或者优化净化方法及色谱/质谱条件来尽可能避免基质效应[27]。
应用模式识别软件SIMCA 专注于主成分分析和偏最小二乘法判别功能[28],现阶段在食品研究中主要应用于标志物识别,即在多个指标的综合评价中,主成分分析能够消除各指标间的相互影响,客观评价样品的相对地位[29-30]。为进一步研究基质效应的影响,本研究利用SIMCA 14.1 软件对40 种精神类药物残留ME、基质和溶剂曲线的回收率及化合物分子量进行了多元统计分析,得到虾肉中精神类药物残留的主成分分布图,见图4。
图4 虾肉中40 种精神类药物残留的主成分分布
Fig.4 Principal component distribution of 40 psychotropic drug residues in shrimp meat
由图4 可知,大部分精神类药物残留组分围绕中心相对集中,占总体的87.5%;对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、普鲁卡因胺、丙酰丙嗪和氟哌利多分散在不同的象限。结合上述图2 和图3 结果进行分析,对氨基苯甲酸和间氨基苯甲酸的分子量最小,且回收率对比与其他成分趋势相反,在主成分分布图中产生了最大的偏离,即对于分子量较小的成分,在检测分析过程中容易受到基质效应的干扰和溶剂的屏蔽,导致精密度和准确度降级。另外,丙酰丙嗪、利多卡因和普鲁卡因胺虽然具有较大的分子量,但其ME 均远低于-50%,且普鲁卡因胺的基质与溶剂曲线回收率对比差距最大,在图3 中对应的普鲁卡因胺偏离在单独象限,说明基质匹配标准曲线校正对于普鲁卡因胺的基质效应消除或补偿效果最好。
本研究建立了可高通量快速筛查虾肉中40 种精神类药物残留的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱技术,从基质效应因子、基质匹配标准曲线校正及多变量分析方面评价了基质效应对虾肉中精神类药物检测分析的影响。固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法能有效消除或补偿基质效应,适用于虾肉中精神类药物残留的高通量快速筛查。本研究为虾类水产品中精神类药物残留安全评价提供参考,为进一步研究和分析水产品中不同药物残留基质效应提供了新的思路和方法。
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Determination of 40 Psychotropic Drug Residues and Matrix Effects in Shrimp Meat by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
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