黄精（Polygonatum sibiricum）又名老虎姜、鸡头参，是百合科黄精属草本植物，具有补气养阴、健脾、润肺和益肾等功效[1]。作为一种药食同源食物，黄精既可以作为补益类药物，也可作为一种养生食材。研究发现，黄精富含多种营养物质和活性成分，包括多糖、蛋白质、维生素、皂苷、黄酮和生物碱等[2-3]。其中，多糖是黄精中含量最高的活性成分，具有抗氧化[4]、抗炎症[5]、免疫调节[6]和抗肿瘤[7]等生理活性。黄精多糖（Polygonatum sibiricum polysaccharides，PSP）主要由葡萄糖（glucose，Glc）、果糖（fructose，Fru）、甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）和 葡 萄 糖 醛 酸（glucuronic acid，GlcA）等单糖组成[8-13]，其中，Fru 是黄精多糖中含量较高且比较特殊的一类单糖，其特殊之处有以下几个方面：1）不同于其他种类的单糖，Fru 不含有醛基，是一种非还原糖，不能被荧光试剂（如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化，因此单糖组成分析常用的衍生化方法不能直接检测Fru 含量；2）Fru 对酸和温度较敏感，在强酸或高温条件下易发生复杂的化学反应[14]，被降解生成5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）和腐胺，而HMF 还可以重新水合生成甲酸（formic acid，FA）和乙酰丙酸（levulinic acid，LA）[15]。因此，单糖的释放条件（即多糖的酸水解条件）和Fru 的检测方法是准确测定Fru 含量的关键。
目前，文献报道的测定PSP 中单糖组成水解方法差异较大。例如，Yang 等[16]采用2 mol/L 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）于120 ℃水解2 h，分析了PSP中Fru 含量为31.56%；Bai 等[17]采用0.05 mol/L TFA 于100 ℃水解0.5 h，分析了陕西、安徽、云南产地PSP 中Fru 含量分别为92.44%、68.92%、74.74%；Zhao 等[18]采用2 mol/L TFA 于110 ℃水解1 h，分析了广东、湖北、河北、河南、四川、云南、陕西、重庆产地PSP 中的Fru含 量 分 别 为31.5%、48.0%、86.5%、36.6%、24.3%、36.4%、39.8%、25.3%；Liu 等[19]采用2 mol/L TFA 于50 ℃水解0.5 h，分析了广东产地Sephadex G-75 凝胶柱纯化得到的两种PSP 中Fru 含量分别为31.18% 和7.92%。由此可见，除了黄精产地的影响，酸水解条件对Fru 含量影响较大。因此，探索合适的Fru 释放条件对黄精多糖中Fru 含量的准确测定具有重要意义。
目前，PSP 中Fru 含量分析方法主要包括气相色谱（gas chromatography，GC）法[20]、高效阴离子色谱（highperformance anion-exchange chromatography，HPAEC）法[2]、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）联合不同检测器分析法，如蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）[21]、示差折光检测器（refractive index detector，RID）[22]等。糖类本身挥发性较低，因此在GC 分析前需要对其进行衍生化处理，将其转化为易挥发、对热较稳定的衍生物，操作比较繁琐。HPAEC 可以对非衍生的单糖（包括Fru）进行检测，但各类单糖在HPAEC 上的响应差别较大[23]，需要对每种单糖分别进行绝对定量才能进行含量分析。而RID 只能用于恒浓度流动相分析，易受环境温度影响，且检测灵敏度相对较低。亲水色谱-电雾式检测分析（hydrophilic interaction liquid chromatography-charged aerosol detector，HILIC-CAD）法的使用为Fru 的检测提供了良好的解决方案。非衍生的单糖可以在亲水色谱上得到分离，而电雾式检测器（charged aerosol detector，CAD）作为一种基于对带电颗粒的相互作用检测的非特异性检测器，其检测的带电颗粒的产生量与化合物的总质量成正比[24]。因而，各类单糖的色谱峰面积比值即能直接反映其含量的关系。
综上，为探究PSP 中Fru 的准确含量，本研究以山东产地的PSP 为研究对象，以Fru 的释放程度作为评价指标，系统考察多糖浓度、酸浓度、水解温度、水解时间对黄精多糖水解的影响，利用单因素结合正交试验优化PSP 的水解条件，并结合单糖组成分析的“金标准”——1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化-反相色谱分析（stands for reverse phase high performance liquid chromatography，RPHPLC）法检测结果，分析并比较不同产地PSP 中Fru含量及其他单糖组成之间的差异，以期为黄精多糖中果糖含量准确测定提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
四川产地PSP：瑞迪生物科技（武汉）有限公司；安徽产地PSP：广州博涛生物技术有限公司；甘肃产地PSP：海澳思本源生物医药集团有限公司；陕西产地PSP、乙酸铵（色谱纯）、Fru、Man、Rha、Ara、Gal、GalA、Glc、GlcA（纯度＞99%）：上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：上海星可高纯溶剂有限公司；氨水（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PMP、TFA（均为色谱纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱系统（UltiMateTM 3000）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9240A）：上海一恒科学仪器有限公司；程控金属浴（H2O3-PRO）：卡尤蒂生物科技宜兴有限公司；冻干机（Alpha 2-4 LSCbasic）：北京博劢行仪器有限公司；医用离心机（Centrifuge-V）：德国艾本德股份公司；电子天平（XSR105DU/ A）、pH 计（FE28）：梅特勒托利多科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 多糖水解条件优化
1.3.1.1 样品
多糖水解条件优化所用山东产地PSP 样品参考周静等[25]的方法提取。
1.3.1.2 单因素试验
1）多糖浓度对水解的影响
参考Zhang 等[26]的方法，配制4 mg/mL 黄精多糖溶液，并梯度稀释至2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/mL，各加入等量1 mol/L TFA 溶液，至多糖终浓度分别为2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/mL，于100 ℃水解4 h 后迅速冰浴终止反应，冷冻干燥两次。采用HPLC 分析的初始流动相复溶，至多糖浓度为2 mg/mL，进行色谱分析。
2）酸浓度对水解的影响
取适量多糖分别溶解于终浓度为0.001、0.005、0.010、0.025、0.050、0.100、0.500、1.000、2.000 mol/L 的TFA 溶液中，多糖浓度最终为1 mg/mL，100 ℃水解4 h后冰浴终止反应，冻干两次。采用HPLC 分析的初始流动相复溶，至多糖浓度为2 mg/mL，进行色谱分析。
3）水解温度对水解的影响
1 mg/mL 黄精多糖溶解于0.05 mol/L TFA 中，分别于60、70、80、90、100、110 ℃条件下水解4 h 后冰浴终止反应，冻干两次。采用HPLC 分析的初始流动相复溶，至多糖浓度为2 mg/mL，进行色谱分析。
4）水解时间对水解的影响
1 mg/mL 黄精多糖溶解于0.05 mol/L TFA 中，在80 ℃条件下分别水解10、20、30、40、60 min 后冰浴终止反应，冻干两次。采用HPLC 分析的初始流动相复溶，至多糖浓度为2 mg/mL，进行色谱分析。
1.3.1.3 水解条件正交试验
根据单因素试验结果设计正交试验，筛选出准确测定黄精多糖中Fru 含量的最佳水解条件，因素与水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平1 2 3 X 酸浓度/（mol/L）0.010 0.050 0.100 Y 水解温度/℃70 80 90 Z 水解时间/min 10 20 30
1.3.2 HILIC-CAD 条件
参考Yan 等[27]的方法并略作修改。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×150 mm，1.7 µm）；初始流动相：100 mmol/L 乙酸铵（pH10.8）∶乙腈=14∶86（体积比）。流速为0.1 mL/min；CAD 检测器参数：数据采集频率10.0 Hz；滤波1.0 s；雾化器温度：30 ℃；在1 min 处插入滤片。标准品：Glc、Fru 均以0.2 mg/mL的浓度溶解于初始流动相中。
1.3.3 PMP 衍生化-RP-HPLC 法测定单糖组成
参考张旭[28]的方法并略作修改。称取2 mg PSP，溶于2 mol/L TFA，于120 ℃水解2 h 后，加入1 mL 无水乙醇，氮气吹干，并重复3 次，以去除TFA。向完全酸水解后获得的干燥样品和对照品（Man、Rha、Ara、Gal、GalA、Glc、GlcA）各0.2 mg 以及混合标准品（上述7 种，各0.1 mg）中加入500 µL 0.3 mol/L NaOH 溶液，再加入500 µL 0.5 mol/L PMP，溶于甲醇中，待样品充分溶解后于70 ℃水浴30 min，冷却，12 000 r/min 离心5 min。加入0.3 mol/L 盐酸中和后，加入1 mL 二氯甲烷萃取。抽提吸去下层，保留水层，并重复3 次。然后吸取水层进行HPLC 检测。
RP-HPLC 采用C18ME（4.6 mm×250 mm，5µm）色谱柱于245 nm 处进行检测。流动相为0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.0）∶乙腈=84∶16（体积比），流速为1 mL/min。
1.3.4 单糖组成比例换算
将最佳水解条件下Fru 与Glc 峰面积比值带入至PMP 衍生化-RP-HPLC 法测定的单糖组成结果中换算Fru 的虚拟峰面积，重新采用百分含量计算各单糖的比例。
1.4 数据处理
采用IBM SPSS Statistics 26 软件进行正交试验数据分析，Origin 8.5 软件进行绘图。
2 结果与讨论
2.1 酸水解反应终止条件考察
合适的TFA 水解程度是确保黄精多糖中Fru 含量准确测定的关键，而及时终止酸水解反应才能保障各个水解条件检测结果的准确。在常规的单糖组成分析中，TFA 对多糖进行了充分的水解，因此可以采用醇协助挥发的方式蒸除TFA[28]。但本研究中，为了保证水解条件（如水解时间）的准确，酸水解反应需立即终止。一般可采用碱中和的方式，但高浓度的盐不利于后续的HILIC-CAD 分析，因此本研究采用了迅速将水解体系降温、冷冻的方式，极大降低了酸水解的速率，并采用冻干的方式去除体系中的TFA。
选用单因素试验中使用的最高酸浓度2 mol/L TFA 水溶液，经第一次冻干后复溶测得pH 值为6.2，第二次冻干后复溶测得pH 值为6.8，即约为中性，说明冻干两次可基本去除溶液中的TFA。而其余更低浓度酸溶液冻干两次均可视为基本去除TFA，而不再进行水解反应。
2.2 Fru 测定方法的优化结果
2.2.1 HILIC-CAD 色谱方法优化
参考Yan 等[27]的方法，对流动相比例、流速和柱温分别进行优化调整，最终确定色谱条件。流动相为100 mmol/L 乙酸铵（pH10.8）∶乙腈=14∶86（体积比），流速为0.1 mL/min。Fru 与Glc 混合标准品HILIC 分析如图1 所示。
图1 Fru 与Glc 混合标准品HILIC 分析
Fig.1 HILIC analysis of mixed standard solution of Fru and Glc
由图1 可知，Fru 和Glc 在此方法下可以实现较好地分离。
2.2.2 水解条件单因素试验结果分析
PSP 中Glc 和Fru 的含量较高[16-18]。因此，以Fru与Glc 两种单糖的释放量和相对含量作为考察指标，对PSP 酸水解条件进行考察。由于Fru 与Glc 相对分子质量相同，CAD 检测的峰面积比即可以直观体现二者含量比。
2.2.2.1 不同多糖浓度水解对Fru 释放的影响
多糖的水解反应本质是糖苷键在稀酸的催化作用下断裂，而糖苷键的数量，即体系中多糖分子的浓度在一定程度上影响着产物（单糖）的生成效率。因此，本研究首先对多糖浓度因素进行考察，结果如图2 所示。
图2 多糖浓度对Fru 和Glc 释放的影响
Fig.2 Effect of polysaccharides concentration on the release of Fru and Glc
由图2 可知，多糖浓度在0.1～2.0 mg/mL 时，随着多糖浓度的增加，Fru 和Glc 的峰面积并没有呈现出明显的增加或减少的趋势，表明在设定的浓度范围内，多糖浓度对水解程度没有明显的影响。因此，选择多糖浓度为1.0 mg/mL 进行后续试验。
2.2.2.2 不同酸浓度水解对Fru 释放的影响
Fru 对酸及温度敏感，易降解成非糖物质。因此，酸浓度是影响Fru 准确检测的关键因素之一。不同酸浓度对Fru 和Glc 释放的结果如图3 所示。
图3 酸浓度对Fru 和Glc 释放的影响
Fig.3 Effect of TFA concentration on the release of Fru and Glc
由图3 可知，随着酸浓度的增加，色谱检测的Fru峰面积有明显的变化趋势，即酸浓度在低于0.050 mol/L条件下，Fru 释放量呈现上升的趋势，说明在低浓度酸条件下，Fru 未完全水解；而当酸浓度高于0.050 mol/L时，Fru 释放量呈下降趋势，说明随着酸浓度增加，Fru水解程度越来越高，但高浓度的酸导致Fru 发生化学反应生成了其他物质，因而检测值降低。Glc 的释放量随着酸浓度的增加变化不明显，但酸浓度在0.025 mol/L以下时，Glc 释放量也呈现上升趋势，说明Glc 未被完全水解；酸浓度在大于0.010 mol/L 时，Glc 释放量趋于稳定。因此，选择酸浓度为0.010、0.050、0.100 mol/L进行后续正交试验。
2.2.2.3 不同水解温度对Fru 释放的影响
水解温度也是影响酸水解程度和Fru 发生副反应的重要因素。本试验分别考察了PSP 在60、70、80、90、100、110 ℃条件下Fru 和Glc 的释放量，结果如图4所示。
图4 水解温度对Fru 和Glc 释放的影响
Fig.4 Effect of temperature on the release of Fru and Glc
由图4 可知，水解温度在60～80 ℃时，Fru 峰面积未发生明显变化。当水解温度超过80 ℃后，Fru 释放量呈下降趋势，说明随着水解温度的升高，会使Fru 发生副反应。因此，选择水解温度为70、80、90 ℃进行后续正交试验。
2.2.2.4 不同水解时间对Fru 释放的影响
水解时间的长短对产物的生成量也具有重要的影响。本研究参考前3 个水解单因素的结果，设计了不同水解时间条件，考察了水解10～60 min 的Fru 及Glc释放程度，结果如图5A 所示，Fru 和Glc 的相对含量变化如图5B 所示。
图5 水解时间对Fru 和Glc 释放的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis time on the release of Fru and Glc
A.Fru 和Glc 的释放量随水解时间的变化；B.Fru 和Glc 的相对含量变化。
由图5A 可知，水解时间到达30 min 后，Fru 的释放量及其与Glc 的释放量趋于稳定，且随着水解时间的继续延长，Fru 释放量并未明显增加，说明水解至30 min时，Fru 已释放完全。由图5B 可知，水解20 min 时，Fru和Glc 的相对含量已趋于稳定，但由图5A 可知，该条件下Fru 和Glc 并未完全释放，而水解30 min 以后，Fru和Glc 释放量（图5A）和相对含量（图5B）均不再发生明显变化，说明该条件下二者都已完全释放。因此，选择水解时间为10、20、30 min 进行后续正交试验。
2.2.3 水解条件正交试验结果分析与验证
黄精多糖水解条件正交试验结果如表2 所示，方差分析如表3 所示。
表2 黄精多糖水解条件正交试验结果
Table 2 Orthogonal experimental results of the hydrolysis process of PSP
试验组X 酸浓度Y 水解温度Z 水解时间1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 Fru 峰面积/（pA·min）58.22 74.17 72.28 63.00 80.55 71.17 71.31 77.97 72.43 K2 K3 k1 k2 k3 R 204.67 214.72 221.71 68.22 71.57 73.9 5.68 192.53 232.69 215.88 64.18 77.56 71.96 13.39 207.36 209.60 224.14 69.12 69.87 74.71 5.59
表3 PSP 水解得到的Fru 峰面积方差分析
Table 3 ANOVA for the peak areas of fructose released from PSP
注：*表示影响显著（P＜0.05）。
方差来源模型截距水解温度水解时间酸浓度误差总计III 类平方和375.427 45 667.69 271.18 55.333 48.914 5.052 46 048.169自由度6 1 2 2 2 2 9均方62.571 45 667.69 135.59 27.667 24.457 2.526 F 值24.773 18 080.247 53.681 10.953 9.683显著性0.039*0 0.018*0.084 0.094
由表2 可知，PSP 水解Fru 的最优组合是X3Y2Z3，即0.100 mol/L TFA、80 ℃水解30 min。由表3 可知，水解温度对Fru 的水解率影响显著（P＜0.05），酸浓度和水解时间对Fru 的水解率影响不显著（P＞0.05），其中水解温度为主要的影响因素，其次为酸浓度和水解时间。正交试验结果表明最优的水解条件0.100 mol/L TFA 在80 ℃下水解30 min，而实际测得试验组中最优水解条件组合是X2Y2Z3，即0.050 mol/L TFA 在80 ℃下水解30 min。为验证正交试验最优条件的可靠性，因此用X3Y2Z3 水解条件进行验证试验，并设置一组对照试验。结果如表4 所示。
表4 正交试验方法验证结果
Table 4 Results of orthogonal experimental verification
试验组合X2Y2Z3 X3Y2Z3 Fru 含量/%89.32 89.39 Glc 含量/%10.68 10.61 Fru 峰面积/（pA·min）80.84 81.64 Glc 峰面积/（pA·min）9.67 9.69
Fru 和Glc 的含量通过计算液相色谱图的峰面积比来表示其百分含量。由表4 可知，与X2Y2Z3 相比，X3Y2Z3 组合释放的Fru 含量更高。因此，正交试验优化的水解条件（X3Y2Z3）更优。验证结果表明本研究所建立的方法可行，可用于对黄精多糖中果糖含量的准确测定。基于这一验证结果，进一步对不同产地的黄精多糖进行果糖含量的测定，以评估该方法在不同产地黄精样品中的适用性。
2.3 不同产地黄精多糖单糖组成比较
2.3.1 Fru 和Glc 比例差异性比较
根据前文优化的水解条件将5 种不同产地的PSP进行水解，采用HILIC-CAD 分析，检测Fru 和Glc 的相对含量，结果如表5 所示。
表5 不同产地PSP 中Fru 与Glc 相对含量
Table 5 Content of Fru and Glc of PSP from different origins
产地山东甘肃四川安徽陕西Fru 相对含量/%89.39 80.57 78.96 51.82 85.71 Glc 相对含量/%10.61 19.43 21.04 48.18 14.29
由表5 可知，山东产地PSP 中Fru 相对含量最高，安徽产地多糖中Fru 相对含量最低。
2.3.2 其它单糖含量差异性比较
多糖水解结合PMP 衍生化-RP-HPLC 法是测定植物多糖中还原性单糖的组成和含量的“金标准”。由于植物多糖中的酸性糖（GalA、GlcA）的释放比较困难，因此，该方法采用了较强的水解条件（2 mol/L TFA，120 ℃水解2 h）。为保障其他单糖含量的准确，采用强酸水解结合PMP 衍生化-RP-HPLC 法测定其它单糖含量。7 种还原性单糖标准品经PMP 衍生化RPHPLC 分析结果如图6 所示。
图6 PMP 衍生化单糖标准品RP-HPLC 分析
Fig.6 RP-HPLC analysis of PMP-derived monosaccharide standard
由图6 可知，7 种还原性单糖标准品采用PMP 衍生化RP-HPLC 法测定可以实现较好地分离。
由PMP 衍生化-RP-HPLC 法分析5 种产地的PSP单糖组成，结果如表6 所示。
表6 PMP 衍生化-RP-HPLC 法分析不同产地黄精多糖中单糖的百分含量
Table 6 Monosaccharide composition analysis of PSP from different origins using PMP-RP-HPLC%
注：表中各单糖百分含量为液相色谱图中峰面积比；-表示未检出目标物。
产地山东安徽甘肃四川陕西Man 7.66 0.17 0.99 0.55 12.38 GlcA 3.02- - - -GalA 8.9 0.12 0.33 0.28-Glc 55.72 99.37 98.3 98.54 81.85 Gal 21.28 0.23 0.25 0.37 3.71 Ara 3.42 0.11 0.13 0.26 0.26
由表6 可知，山东产地PSP 的组成最为丰富，检测到不含Fru 在内的6 种单糖；安徽、甘肃、四川产地检测到5 种单糖；陕西产地检测到4 种单糖。
将Fru 按照Fru 与Glc 的比值（表5）换算为PMP衍生化-RP-HPLC 检测的虚拟峰面积，并按照百分含量重新计算，得到最终的组成分析结果如表7 所示。
表7 不同产地黄精多糖中单糖的百分含量
Table 7 Monosaccharide composition analysis of PSP from different origins%
注：-表示未检出目标物。
产地山东安徽甘肃四川陕西Man 1.35 0.08 0.20 0.12 2.10 GlcA 0.53- - - -GalA 1.56 0.06 0.07 0.06-Glc 9.78 47.95 19.36 20.97 13.85 Gal 3.74 0.11 0.05 0.08 0.63 Ara 0.60 0.05 0.03 0.06 0.35 Fru 82.44 51.74 80.30 78.71 83.08
由表7 可知，山东产地的单糖组成最丰富，包括Man、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara、Fru；安徽、甘肃、四川、陕西产地均未检测出GlcA；陕西产地PSP 还未检测到GalA。山东、甘肃、四川和陕西4 个产地PSP 中，Fru含量最高且相似（78.71%～83.08%）；安徽产地的PSP中Fru 含量较低（51.74%）。5 种产地多糖中Glc 的含量差别较大，最低为9.78%（山东），最高为47.95%（安徽）。
3 结论
本研究通过单因素分析、正交试验成功建立了准确测定PSP 中Fru 的水解方法，可使PSP 中的Fru 与Glc 均完全释放，且无副反应发生。黄精多糖最佳的水解条件为1.0 mg/mL PSP 在0.100 mol/L TFA 溶液中，于80 ℃水解30 min。对5 个产地的PSP 进行了单糖组成比较分析发现，5 个产地的PSP 均主要由Fru和Glc 组成。其中，山东、甘肃、四川和陕西4 个产地PSP 中Fru 含量相似（78.71%～83.08%）；安徽产地的PSP 中Fru 含量较低（51.74%）。
本研究对PSP 的准确测定和比较有助于评价、了解不同产地黄精的差异，为进一步深入探索和利用PSP 提供了重要的参考依据，也为准确测定其他含有Fru 的中药多糖中Fru 含量精准测定提供参考。
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