小蓟是菊科植物刺儿菜[Cirsium setosum（Willd.）MB.]的干燥地上部分，多年生草本，分布于我国大部分地区。小蓟主要含黄酮类、有机酸、生物碱、苯丙素类等成分，其味甘、苦，性凉，归心、肝经，具有凉血止血、散瘀解毒消痈的功效[1]。小蓟在民间常做野菜食用，也可作为药饮与其他药材联用，兼具药用和食用价值[2]。其作为药食两用资源，具有多种药理活性，且营养丰富，已被越来越多地应用于食品添加剂及保健品开发[3]。由于小蓟水提液有一定苦涩味[4]，影响了人们的感官体验及其产品的深度开发利用。因此，寻找降低小蓟水提液苦涩感的方法，同时又不影响其生物活性，显得尤为重要。
近年来，微生物发酵技术在中药及食品领域的应用越来越广泛，发酵可将中药或食品中的活性成分转化为易于吸收的次生代谢产物，具有增效、减毒和改善食品风味等多重功效[5]。余甘子作为一种药食两用中药，由于果实酸涩，严重限制其资源的开发利用。朱逊贤[6]利用微生物发酵技术，获得营养成分丰富、抗氧化活性高、口感柔和、回甘悠长的余甘子风味饮品。印度毛霉和米根霉共发酵米酒，获得香气浓郁、口感协调的风味酒[7]。因此，微生物发酵技术对改善中药或食品风味具有重要作用。目前，利用微生物发酵降低小蓟水提液苦涩味的研究鲜见报道。
本研究通过单菌及混菌发酵试验，筛选发酵改善小蓟水提液风味、降低其苦涩感的最佳微生物组合，通过单因素及响应面优化试验确定最佳发酵工艺参数，利用代谢组学分析方法阐释发酵改善小蓟水提液风味的分子机制，以期为今后将小蓟开发为相关食品添加剂或功能食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小蓟：安徽庆春堂药业有限公司，贵州中医药大学药学院生药学实验室实验师王波鉴定为菊科植物刺儿菜[Cirsium setosum（Willd.）MB.]的干燥地上部分；10 种益生菌（米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、嗜热链球菌，均为冻干菌种）：中国工业微生物菌种保藏管理中心；MRS 培养基：青岛海博生物技术有限公司；Al（NO3）3·9H2O：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；NaOH：汕头市西陇化工厂有限公司；芦丁：贵州迪大科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV2501PC 紫外分光光度计：日本岛津制作所；液相色谱-质谱仪、Sorvall ST 40R 离心机：美国赛默飞世尔科技公司；MQD-B3R 全温振荡培养箱：上海旻泉仪器有限公司；D2M-80L-11 高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；LRH-250 生物培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 小蓟水提液制备
称取适量小蓟加水浸泡，用10 倍水加热煮沸两次，每次1 h，合并两次滤液并浓缩至料液比为1∶10（g/mL）。121 ℃灭菌30 min 即得小蓟灭菌水提液。
1.3.2 发酵改善水提液风味菌种筛选
取11 份小蓟灭菌水提液100 mL，一份作空白对照，其余10 份分别按1.5%接菌量接入10 种益生菌，在转速200 r/min、25 ℃条件下培养24 h，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得发酵后的小蓟水提液，进行感官评分。
1.3.3 小蓟水提液感官评价
参照GB 7101—2022《食品安全国家标准饮料》感官评价要求及文献[8]的方法略有改动，制定小蓟水提液感官评分标准。感官评分小组由贵州中医药大学食品质量与安全专业12 名师生组成（6 男6 女），感官评分前进行感官理论、色泽、口感、组织状态评价培训，且在感官评分前要求禁食刺激性食物，避免吸烟等行为，以减少评分误差。感官评分标准见表1。
表1 感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
评分项目色泽（30）口感（40）评分20～30 10～＜20 0～＜10 30～40 20～＜30 0～＜20组织状态（30）评分标准色泽自然、均匀、有光泽色泽较黑、均匀、有光泽色泽较黑、不均匀、无光泽发酵香气明显、口感细腻爽滑，无苦涩味，有小蓟独特口感有发酵香气、口感较细腻，少许苦涩味，稍有小蓟口感无香味或有异味、口感粗糙，苦涩味明显，小蓟味淡或无组织细腻均匀、无沉淀、无凝块组织均匀、少许沉淀、少许凝块组织不均匀、较多沉淀、较多凝块20～30 10～＜20 0～＜10
1.3.4 混菌发酵改善水提液风味试验
1.3.4.1 混菌拮抗试验
取嗜热链球菌100 µL 涂布于MRS 培养基表面，将一片无菌滤纸小片置于培养基上，吸取2.5µL 嗜酸乳杆菌滴在滤纸片上，37 ℃培养24 h，观察是否出现拮抗反应。
1.3.4.2 混菌发酵试验
取单菌发酵感官评分排名靠前的两菌种（嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌），参照陈天龙等[9]发酵制备合生元的混菌比例设置并略有改动，混菌发酵比例（嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌体积比）分别为1∶1（1 号）、1∶2（2 号）、2∶1（3 号）、1∶3（4 号）、3∶1（5 号），将混合菌种接种至灭菌后的小蓟水提液，同时设置单菌（嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌）发酵组和空白对照组（不接菌），按1.3.2 条件发酵培养，3 000 r/min 离心10 min，取上清液进行感官评价。
1.3.5 发酵改善水提液风味单因素试验
选取接菌量（0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）、蔗糖含量（0%、1%、2%、3%、4%、5%）3 个因素进行单因素试验，考察其中一个因素时，其他因素固定为发酵温度25 ℃、接菌量1.5%、蔗糖含量4%，以课题组前期筛选确定的24 h 为发酵时间对小蓟水提液进行发酵试验。
1.3.6 发酵改善水提液风味响应面试验
选取发酵温度、蔗糖含量、接菌量3 个因素，以感官评分（Y）为响应值，设计三因素三水平试验，运用Design-Expert V8.0.6 软件的Box-Behnken 试验方案进行试验分析。响应面试验因素与水平见表2。
表2 响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface test
水平-1因素C 蔗糖含量/%0 1 A 接菌量/%1.0 1.5 2.0 B 发酵温度/℃20 25 30 3 4 5
1.3.7 总黄酮含量测定
用75% 乙醇配制0.2 mg/mL 芦丁标准品溶液，采用亚硝酸盐-硝酸铝-氢氧化钠显色法，510 nm 处测吸光度，以标准品浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线，得线性回归方程：y=3.909 23x-0.021 81，R2=0.999 2。取小蓟水提液1 mL，510 nm 处测吸光度，以空白试剂做对照，将样品吸光度代入标准曲线方程得小蓟水提液总黄酮含量。
1.3.8 发酵改善小蓟水提液风味的代谢组学分析
1.3.8.1 代谢物提取
分别取100µL 小蓟水提液和发酵液置于离心管，再加入400µL 80% 甲醇溶液，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清液进行液相色谱-质谱联用分析。
1.3.8.2 液相色谱条件
液相色谱条件为色谱柱：HypesilGoldcolumn（C18），柱温：40 ℃，流速：0.2 mL/min，流动相A（正模式：10%甲酸，负模式：5 mmol/L 醋酸铵），流动相B：甲醇。色谱梯度洗脱程序见表3。
表3 色谱梯度洗脱程序
Table 3 Chromatographic gradient elution procedure
时间/min 0 1.5 3.0 10.0 10.1 11.0 12.0流动相A/%98 98流动相B/%2 2 0 0 98 100 100 98 98 2 2 2
1.3.8.3 质谱条件
扫描范围选择m/z 100～1 500；电喷雾电离源的设置为喷雾电压：3.5 kV；鞘气流速：0.24 MPa；辅助气流速：10 L/min；离子传输管温度：320 ℃；离子导入射频电平：60 V；辅助气加热器温度：350 ℃；极性：正离子、负离子；串联质谱法二级扫描为数据依赖性扫描。
1.3.8.4 数据预处理及代谢物鉴定
将质谱检测所得数据文件导入CD 3.1 软件进行处理，对代谢物进行保留时间、质荷比等参数筛选，通过峰面积分析、分子式预测，得到代谢物鉴定和相对定量结果。数据处理部分基于Linux 操作系统（CentOS版本6.6）及软件R、Python 展开。
1.3.8.5 代谢物分析
使用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）、人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB）数据库（https：//hmdb.ca/metabolites）和脂质代谢途径研究计划（Lipid Metabolites and Pathways Strategy，LIPIDMaps）数据库（http：//www.lipidmaps.org/）对鉴定到的代谢物进行注释。多元统计分析部分，使用代谢组学数据处理软件metaX 对数据进行转换后进行主成分分析和偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），进而得每个代谢物的变量投影重要性分析值（variable importance in projection，VIP）。单变量分析，基于t 检验来计算各代谢物在两组间统计学显著性（P 值），并计算代谢物在两组间的差异倍数值（fold change value，FC）。差异代谢物筛选的默认标准为VIP＞1、P＜0.05 且FC≥1.5 或FC≤0.67。
1.4 数据处理
试验均3 次平行，试验数据均以平均数±标准差表示，采用Excel 2019、Design-Expert V8.0.6 等软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 发酵菌种筛选
2.1.1 单菌发酵试验
小蓟水提液单菌发酵感官评分结果见图1。
图1 小蓟水提液单菌发酵感官评分
Fig.1 Sensory scores of Cirsium setosum water extracts fermented with single strains
由图1 可知，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵的感官评分较高，分别为73.85 和75.15。董双涛等[10]发现，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵可改善酸奶风味，同时增强了酸奶的益生功能。赵瑞香等[11]也发现嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌共发酵时，有共生关系。因此选取嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌开展混菌发酵试验。
2.1.2 混菌拮抗试验
混菌拮抗试验结果见图2。
图2 混菌拮抗试验
Fig.2 Antagonism of mixed bacteria
A.嗜酸乳杆菌；B.嗜热链球菌。
由图2 可知，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合培养未出现抑菌圈，说明此两菌可用于小蓟水提液混菌发酵。
2.1.3 混菌发酵试验
小蓟水提液混菌发酵感官评分结果见图3。
图3 小蓟水提液混菌发酵感官评分
Fig.3 Sensory scores of Cirsium setosum water extracts fermented with mixed strains
1～5 分别为混菌发酵比例（嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌体积比）1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1。
由图3 可知，第5 组混菌发酵组合感官评分最高为79.08，因此筛选第5 组即嗜酸乳杆菌∶嗜热链球菌=3∶1（体积比）为最佳混菌发酵组合。
2.2 单因素试验
2.2.1 接菌量对感官评分的影响
接菌量对感官评分的影响见图4。
图4 接菌量对感官评分的影响
Fig.4 Effect of strain inoculation on sensory score
由图4 可知，接菌量1.5% 时，感官评分最高为78.25。当接菌量较少（＜1.5%）时，水提液中微生物相对较少，发酵不充分，未产生足够的风味化合物，感官评分较低；当接菌量较高（＞1.5%）时，由于微生物数量较多，致使水提液中营养及风味物质大量消耗，产生不良风味，导致感官评分降低[12]。因此，接菌量选择1.0%、1.5%、2.0%进行后续优化试验。
2.2.2 发酵温度对感官评分的影响
发酵温度对感官评分的影响见图5。
图5 发酵温度对感官评分的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on sensory score
由图5 可知，25 ℃时发酵液感官评分为78.17，分值较高。20 ℃时温度较低，微生物代谢速率较慢，不利于发酵液中风味物质的形成；发酵温度较高时（＞25 ℃），易形成较多酸味、苦味成分，因此较高温度下，感官评分较低[13]。因此，发酵温度选择20、25、30 ℃进行后续优化试验。
2.2.3 蔗糖含量对感官评分的影响
蔗糖含量对感官评分的影响见图6。
图6 蔗糖含量对感官评分的影响
Fig.6 Effect of sucrose content on sensory score
由图6 可知，蔗糖作为微生物发酵的碳源，还可调节发酵液甜度，蔗糖添加量为4% 时，感官评分为79.33，分值较高。蔗糖含量较低（＜4%）时，微生物可利用碳源较少，不能生成足够的风味化合物来改善口感；蔗糖含量较高（＞4%）时，可利用碳源较多，微生物大量繁殖，导致菌体代谢物增加，影响发酵液风味[14-15]。因此，蔗糖含量选择3%、4%、5%进行后续优化试验。
2.3 响应面试验
Box-Behnken 试验设计与结果见表4。响应面二次回归方程模型的方差分析见表5。
表4 Box-Behnken 试验设计与结果
Table 4 Box-Behnken experimental design and results
编号C 蔗糖含量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 接菌量/%1.0 2.0 1.0 2.0 1.0 2.0 1.0 2.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 B 发酵温度/℃20 20 30 30 25 25 25 25 20 30 20 30 25 25 25 25 25 4 4 4 4 3 3 5 5 3 3 5 5 4 4 4 4 4 Y 感官评分69.83±1.19 67.92±1.16 58.08±1.78 54.83±1.40 70.08±1.31 68.92±1.00 74.08±0.99 72.58±0.90 72.25±1.48 58.25±2.05 73.25±0.87 62.83±1.40 80.25±1.66 78.83±1.34 79.25±1.06 80.08±1.73 78.75±1.36
表5 响应面二次回归方程模型的方差分析
Table 5 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation models
注：P＜0.05 表示影响显著；P＜0.01 表示影响极显著。
变异来源回归模型A 接菌量B 发酵温度C 蔗糖含量AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项误差项总和平方和1 043.66 7.64 303.32 21.91 0.45 0.03 3.20 151.50 488.26 17.16 3.29 1.34 1.95 1 046.95自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方115.96 7.64 303.32 21.91 0.45 0.03 3.20 151.50 488.26 17.16 0.47 0.45 0.49 F 值246.44 16.25 644.62 46.57 0.95 0.06 6.81 321.98 1 037.65 36.46 P 值＜0.000 1 0.005 0＜0.000 1 0.000 2 0.361 2 0.811 4 0.034 9＜0.000 1＜0.000 1 0.000 5 0.92 0.507 9
经Design-Expert V8.0.6 软件对响应面试验结果二次回归分析后，得到各因素关于感官评分的回归方程：Y=79.43-0.98A-6.16B+1.65C-0.34AB-0.09AC+0.89BC-6A2-10.77B2-2.02C2。
由表5 可知，回归方程模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型可靠性好，拟合度高。回归方程的R2 为0.996 9，R2Adj 为0.992 8，说明得到的回归方程模型回归效果好，可对试验结果进行预测分析。由F 值可知，不同因素对感官评分的影响顺序为发酵温度（B）＞蔗糖含量（C）＞接菌量（A），且A、B 和C 对感官评分影响极显著（P＜0.01）。B 和C 的交互作用对感官评分影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2 对试验结果影响极显著（P＜0.01）。
经回归方程模型预测，小蓟水提液最佳发酵工艺参数为接菌量1.46%、发酵温度23.65 ℃、蔗糖含量4.35%，此发酵工艺下预测的感官评分为80.59。在此预测的发酵工艺条件下，重复3 次试验，得小蓟发酵液感官评分平均值为81.92，与预测值相比，相对误差为1.65%，说明该响应面优化试验获得的小蓟水提液发酵工艺可靠。
2.4 小蓟发酵液总黄酮含量分析
黄酮类成分是小蓟中重要的活性成分[16]，经检测小蓟水提液总黄酮含量由发酵前的0.21 mg/mL 降低为发酵后的0.19 mg/mL，发酵后总黄酮含量未发生明显变化（P=0.06＞0.05），说明发酵在改善小蓟水提液风味的同时，对其活性成分总黄酮含量影响不大。
2.5 发酵改善小蓟风味的代谢组学分析
2.5.1 发酵前后代谢物分析
为阐明发酵改善小蓟水提液风味机制，利用液相色谱质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术结合生物信息学分析的方法，分析了发酵前后代谢物，共鉴定出1 658 种代谢物，其中正离子模式下1 068 种，负离子模式下590 种。发酵前后小蓟水提液代谢物正交偏最小二乘判别分析的散点得分见图7。
图7 发酵前后小蓟水提液代谢物正交偏最小二乘判别分析的散点得分图
Fig.7 Scatter plots of orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis of metabolites in Cirsium setosum water extract before and after fermentation
a.正离子模式下散点得分图；b.负离子模式下散点得分图；1～6 为水提液组样品；7～12 为未发酵液组样品。
由图7 可知，水提液组与发酵液组可明显分为两类，且OPLS-DA 模型的R2Y 和Q2Y 数值均大于0.5，且接近1，表明该模型具有可靠的稳定性和预测能力，可以较好地解释两组样本之间的差异。
2.5.2 发酵前后差异代谢物筛选与分析
对发酵前后的小蓟水提液以VIP＞1、P＜0.05 且FC≥1.5 或FC≤0.67 为标准筛选差异代谢物，筛选出的差异代谢物分类见表6。
表6 差异代谢物分类
Table 6 Classification of differential metabolites
代谢物类别生物碱及其衍生物苯环型化合物木质素、新信号素及相关化合物脂质和类脂分子核苷、核苷酸和类似物有机酸及其衍生物有机氮化合物有机氧化合物有机杂环化合物苯丙烷类和聚酮类碳氢化合物衍生物其他合计正离子模式总数上调下调负离子模式总数上调下调4 8 1 15 0 0 0 1 0 0 0 1 10 23 4 15 11 13 0 53 157 1 4 0 7 7 1 4 2 8 4 3 0 18 3 4 1 8 3 9 2 7 7 1 8 9 3 0 1 1 2 1 0 1 0 0 35 5 2 1 3 1 14 1 2 1 1 1 11 68 89 75 0 0 0 7 7 2 0 4 0 2 0 3 25 50
由表6 可知，共筛选出差异代谢物232 种，其中正离子模式下157 种（发酵后上调68 种，下调89 种），负离子模式下75 种（发酵后上调25 种，下调50 种）。差异代谢物主要为有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、有机氧化合物、苯丙烷类和聚酮类化合物、有机杂环化合物、核苷、核苷酸和类似物等。
为筛选发酵改善小蓟水提液风味的化合物，本研究对发酵前后差异风味代谢物进行分析，结果见表7。
表7 差异风味代谢物
Table 7 Differential flavor metabolites
化合物甜味成分6′-唾液乳糖α-乳糖α、α-海藻糖蔗糖D-（+）-麦芽糖橙皮素马鞭草苷芳香味成分2-羟基肉桂酸双香豆素苦/涩味成分苦毒宁番泻苷C花椒毒酚秋水仙素（-）-表没食子儿茶素丹参酮I落新妇苷女贞苷表没食子儿茶素银杏内酯B儿茶素分子式分子量质荷比FC P 值上调/下调C23H39NO19 C12H22O11 C12H22O11 C12H22O11 C9H11NO3 633.22 388.12 342.12 342.12 181.07 632.21 387.11 341.11 341.11 182.08 38.72 31.72 23.15 15.52 3.14 2.79×10-15 2.66×10-9 1.95×10-7 1.48×10-9 1.27×10-14上调上调上调上调上调C9H14N3O8P C17H24O10 323.05 388.14 324.06 387.13 2.16 1.51 0.002 0.01上调上调C15H26N4O6 340.17 341.1850.45 9.05×10-15上调C19H12O6 336.06 335.06 1.57 0.01上调C20H33NO C5H12O7P2 C6H13NO4 C22H25NO6 C10H10N2O 303.26 246.01 163.08 399.17 174.08 304.26 247.01 164.09 398.16 175.09 0.31 0.48 0.54 0.50 0.56 2.49×10-7 0.003 7.17×10-5 0.000 1 0.03下调下调下调下调下调C18H12O3 C21H22O11 C33H40O18 C26H46NO7P 276.08 450.12 724.22 515.30 275.07 431.10 723.22 516.31 0.55 0.56 0.61 0.63 0.002 0.02 0.02 0.002下调下调下调下调C20H24O10 C15H14O6 424.14 168.04 423.13 335.08 0.63 0.66 0.03 0.003下调下调
由表7 可知，小蓟水提液发酵后，6′-唾液乳糖、α-乳糖、α、α-海藻糖、蔗糖等甜味成分含量显著增加，对降低小蓟水提液苦涩味具有重要作用。此外，6′-唾液乳糖、α、α-海藻糖在促进益生菌增殖、抗病毒、预防坏死性小肠结肠炎、免疫调节、促进大脑发育等方面具有重要作用[17-18]。2-羟基肉桂酸、双香豆素等香味物质显著上调，这对改善发酵液风味也有一定作用。苦毒宁、番泻苷C、（-）-表没食子儿茶素等苦涩味物质显著下调，苦毒宁具有极其苦涩的味道[19]，且有一定毒性，发酵后其含量显著下调，在改善发酵液口感的同时也降低了其毒性。（-）-表没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素也是苦涩味的重要来源[20]，此类成分的含量的下调对降低小蓟水提液苦涩感具有重要作用。因此，小蓟水提液发酵后，苦涩味物质减少，香味及甜味成分的增加，对改善发酵液口感具有重要作用。
2.5.3 差异代谢物参与代谢通路分析
通过对差异代谢物参与代谢通路的富集分析，得到差异代谢物参与代谢通路气泡图见图8。
图8 差异代谢物参与代谢通路气泡图
Fig.8 Bubble diagram of metabolic pathways involving differential metabolites
a 为正离子模式；b 为负离子模式。
由图8 可知，与口感改善相关的差异代谢主要被富集在糖、氨基酸、核苷酸相关代谢通路中。小蓟水提液发酵过程中蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖等甜味成分主要被富集在淀粉及蔗糖代谢、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢通路中。酸米汤[21]、红茶[22]、泡菜[23]发酵过程中甜味成分积累均与相关糖代谢通路有关。氨基酸作为一种重要风味成分，小蓟水提液发酵后，部分差异代谢物被富集在甜味氨基酸（丝氨酸、半胱氨酸）相关的碳代谢、半胱氨酸、蛋氨酸代谢通路，苦味氨基酸（色氨酸、精氨酸、组氨酸）相关的ABC 转运蛋白、氨基酸生物合成通路，以及鲜味氨基酸（天冬氨酸）相关的氨基酸生物合成、氰基氨基酸代谢通路。发酵酱油[24]、黄酒[7]制作过程中氨基酸代谢对食品风味形成也有重要作用。益生菌发酵过程中，风味核苷酸含量的增加，有助于改良食品风味[25-26]。本研究小蓟水提液发酵后，部分差异代谢物被富集在与风味核苷酸（鸟苷酸、腺苷酸、胞苷酸）相关的嘌呤代谢、嘧啶代谢通路中。因此，发酵后小蓟水提液风味改善主要与糖、氨基酸、核苷酸涉及的相关代谢通路有关。
3 结论
小蓟水提液发酵的最佳菌种组合为嗜酸乳杆菌∶嗜热链球菌=3∶1（体积比），最佳发酵工艺为接菌量1.46%、发酵温度23.65 ℃、蔗糖含量4.35%。同发酵前相比，小蓟水提液发酵后总黄酮含量未发生显著性变化。经代谢组学分析，获得发酵后的差异代谢物232 种，其中，6′-唾液乳糖、α-乳糖等甜味成分显著上调，2-羟基肉桂酸、双香豆素等香味物质显著上调，苦毒宁、番泻苷C 等苦涩味物质显著下调，与风味改善有关的代谢主要被富集在糖、氨基酸、核苷酸相关的代谢通路。本研究获得了发酵改善小蓟水提液风味的最佳工艺，在代谢组层面揭示了发酵改善其风味的差异代谢物及相关代谢通路，可为小蓟资源的深度开发利用提供参考。
[1] LUO W, WU B, TANG L J, et al. Recent research progress of Cirsium medicinal plants in China[J]. Journal of Ethnopharmacology,2021,280:114475.
[2] 杨炳友, 杨春丽, 刘艳, 等. 小蓟的研究进展[J]. 中草药, 2017,48(23):5039-5048.YANG Bingyou, YANG Chunli, LIU Yan, et al. Research progress on Cirsium setosum[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2017,48(23):5039-5048.
[3] 吴晨光.小蓟抗氧化胶囊的开发研究[D].北京:北京工业大学,2021.WU Chenguang. Study on the development of antioxidation capsule of Cirsium setosum[D]. Beijing: Beijing University of Technology,2021.
[4] 卢琪, 张天泽, 朱娟娟, 等. 小蓟TLC 鉴别方法优化及小蓟炭“炒炭存性”内在表征研究[J].中成药,2023,45(12):4024-4029.LU Qi, ZHANG Tianze, ZHU Juanjuan, et al. Optimization of TLC identification for Cirsii herba and research on changes in quality properties ′carbonizing retains characteristics′ of its charred product[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2023, 45(12): 4024-4029.
[5] ZHANG L X,QIN Z H,ZHANG L,et al.Dynamic changes of quality and flavor characterization of Zhejiang rosy vinegar during fermentation and aging based on untargeted metabolomics[J]. Food Chemistry,2023,404(Pt B):134702.
[6] 朱逊贤.余甘饮料发酵新工艺探讨[D].泉州:华侨大学,2017.ZHU Xunxian. Investigation for a new approach to produce fermented emblic leafflower fruit beverage[D]. Quanzhou: Huaqiao University,2017.
[7] XIANG W L, XU Q, ZHANG N D, et al. Mucor indicus and Rhizopus oryzae co-culture to improve the flavor of Chinese turbid rice wine[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(12):5577-5585.
[8] 田明,何江,满尔哈巴·海如拉,等.克里阳雪菊复合型饮料的研制[J].新疆农业大学学报,2022,45(5):398-407.TIAN Ming,HE Jiang,MANERHABA Hairula,et al.Research on a compound beverage technology of Coreopsis tinctoria[J]. Journal of Xinjiang Agricultural University,2022,45(5):398-407.
[9] 陈天龙,张敏.红曲霉和酵母菌混合发酵制备合生元的条件研究[J].饲料工业,2013,34(13):32-34.CHEN Tianlong,ZHANG Min.Study on the condition of mixed culture fermentation of monascus and yeast to produce synbiotics preparation[J].Feed Industry,2013,34(13):32-34.
[10] 董双涛,霍乃蕊.嗜热链球菌的分离筛选及与嗜酸乳杆菌共发酵制备酸奶的工艺研究[J].食品与发酵科技,2019,55(6):35-38.DONG Shuangtao, HUO Nairui. Study on isolating and sreening of Str. thermophilus and with L. acidophilus to ferment the preparation yogurt craft[J]. Food and Fermentation Sciences & Technology,2019,55(6):35-38.
[11] 赵瑞香,孙俊良,于涛,等.嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌共发酵互生机理的研究[J].生物技术,2005,15(3):28-31.ZHAO Ruixiang,SUN Junliang,YU Tao,et al.Study on the symbiotic mechanism of Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophillus fermented together[J].Biotechnology,2005,15(3):28-31.
[12] 刘晓辉,陈顺,李杨,等.人工接种副干酪乳杆菌生产L-乳酸酸菜条件的研究[J].中国调味品,2020,45(9):91-94.LIU Xiaohui, CHEN Shun, LI Yang, et al. Study on the conditions for producing L-lactic acid fermented vegetables by artificial inoculation of Lactobacillus paracasei[J]. China Condiment, 2020, 45(9):91-94.
[13] 于茜雅,鲁骞,吴昌正,等.温度对广式高盐稀态酱油原油品质的影响[J].食品科学,2023,44(22):55-63.YU Xiya, LU Qian, WU Changzheng, et al. Effect of ambient temperature on the quality of Cantonese-style high-salt liquid-state base soy sauce[J].Food Science,2023,44(22):55-63.
[14] 李鹏程,刘青,项耀东,等.复合乳酸菌发酵西瓜-番茄果蔬汁的工艺优化[J].现代食品科技,2020,36(6):249-255,67.LI Pengcheng, LIU Qing, XIANG Yaodong, et al. Optimization of fermented watermelon-tomato juice by compound lactic acid bacteria[J]. Modern Food Science and Technology, 2020, 36(6): 249-255,67.
[15] 李红.苹果酵素的发酵工艺研究[D].成都:西南交通大学,2019.LI Hong. Study on fermentation technology of apple enzyme[D].Chengdu:Southwest Jiaotong University,2019.
[16] 马蓉蓉,张修正,翟珍妮,等.小蓟提取物的制备及其抗氧化活性研究[J].鲁东大学学报(自然科学版),2020,36(4):361-365.MA Rongrong, ZHANG Xiuzheng, ZHAI Zhenni, et al. Extraction and antioxidant activities of Cirsium setosum[J]. Journal of Ludong University(Natural Science Edition),2020,36(4):361-365.
[17] ZHU Y Y, ZHANG J M, ZHANG W L, et al. Recent progress on health effects and biosynthesis of two key sialylated human milk oligosaccharides, 3′-sialyllactose and 6′-sialyllactose[J]. Biotechnology Advances,2023,62:108058.
[18] LYNCH A T, MOTOZONO C, FOSTER A J, et al. Trehalose diamide glycolipids augment antigen-specific antibody responses in a Mincle-dependent manner[J]. Bioorganic Chemistry, 2021, 110:104747.
[19] PRESSLY B, VASYLIEVA N, BARNYCH B, et al. Comparison of the toxicokinetics of the convulsants picrotoxinin and tetramethylenedisulfotetramine (TETS) in mice[J]. Archives of Toxicology,2020,94(6):1995-2007.
[20] DONG H Y, LI Y H, LAI X F, et al. Effects of fermentation duration on the flavour quality of large leaf black tea based on metabolomics[J].Food Chemistry,2024,444:138680.
[21] LIU N,QIN L K,MAZHAR M,et al.Integrative transcriptomic-proteomic analysis revealed the flavor formation mechanism and antioxidant activity in rice-acid inoculated with Lactobacillus paracasei and Kluyveromyces marxianus[J]. Journal of Proteomics, 2021, 238:104158.
[22] LIU K H,LIU W T,DING X W,et al.The key role of LeuRS in the development of the cleistothecium and the metabolization of the flavor during the fermentation of dark tea with Aspergillus montevidensis[J].LWT-Food Science and Technology,2023,185:115188.
[23] MI T, JIN Y, CHE Y L, et al. Profiling the composition and metabolic functions of microbial community in pellicle-forming radish Paocai[J]. International Journal of Food Microbiology, 2023, 388:110087.
[24] HAN J R, JIANG J L, ZHAO X, et al. Comparative analysis of key precursors and metabolites involved in flavor formation of different rapid-fermented Chinese fish sauces based on untargeted metabolomics analysis[J].Food Chemistry,2024,433:136998.
[25] QIU L Q,ZHANG M,CHANG L.Effects of lactic acid bacteria fermentation on the phytochemicals content, taste and aroma of blended edible rose and shiitake beverage[J]. Food Chemistry,2023,405(Pt A):134722.
[26] CHEN Z Q, GAO H Y, WU W J, et al. Effects of fermentation with different microbial species on the umami taste of shiitake mushroom (Lentinus edodes)[J]. LWT-Food Science and Technology,2021,141:110889.