根据美国农业部（United States Department of Agriculture，USDA）数 据，2023 年 全 世界肉鸡 产 量为10 238.9 万t，其中我国肉鸡产量占比大，为1430 万t[1]。伴随着我国肉鸡养殖业的快速发展，以及人们对鸡肉制品需求量的持续增长，作为鸡肉生产的副产品，鸡骨和鸡肉废弃物的量也在不断增长，其中占比最大的副产品为鸡骨。鸡骨成分丰富，含有大量的蛋白质和脂肪，同时还含有人体必需的营养素，如钙磷类矿物质、磷脂质、磷蛋白、各种氨基酸和维生素等[2-3]。然而，目前鸡骨的加工利用低[4]，浪费严重，导致巨大的经济和资源损失[5]。利用鸡骨开发新型的功能性多肽产品、提高其利用率和附加值具有重要的研究价值[6]。
目前，在鸡骨功能性多肽的研究中，常用的制备方法有化学法[7]、酶解法[8]、微生物发酵法[9]。微生物发酵法是利用微生物的代谢作用来制备鸡骨肽，其成本低于酶解法，并且不会像化学法一样破坏产物结构、营养和活性，形成的肽具有多样性并可大量制备。马莹等[9]使用植物乳杆菌和戊糖片球菌对鸡骨泥进行发酵处理，发酵温度为33 ℃，发酵剂接种量为6%，发酵时间为49 h，此条件下获得的氨基酸态氮含量为0.22 g/100 g，多肽含量为2.79 g/100 g，总游离氨基酸含量为67.79 mg/100 g。在多肽发酵制备中，常用的发酵菌株有芽孢杆菌属、微球菌属、乳杆菌属、葡萄球菌属、片球菌属、乳球菌属和链球菌属的部分细菌，以及霉菌、酵母菌和放线菌的部分菌类。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，普遍分布在土壤及腐败的有机物中，是研究最充分的土壤微生物之一。枯草芽孢杆菌抗逆性强，生长速度快，不产生毒素，是一种安全的发酵微生物[10]。此外，枯草芽孢杆菌能够产生大量的细胞外降解酶，如外切蛋白酶或胞外水解酶，这些酶还可以降解培养基中的成分，形成新的产物[11-12]。目前用益生菌发酵鸡骨粉制备多肽的研究很多，但对其功能特性如抗炎、抗氧化的研究较少。Hong 等[13]发现低分子量的胶原蛋白水解物通常能发挥更好的生物活性，在此基础上进一步总结了胶原蛋白水解物的制备和分子量测定方法的最新进展。
本研究采用枯草芽孢杆菌发酵法制备鸡骨抗氧化肽，以发酵液的DPPH·清除率和水解度为指标，通过单因素试验和响应面试验优化鸡骨抗氧化肽的发酵工艺，对获得的鸡骨抗氧化肽发酵液进一步通过有机膜分离技术制备不同分子量的抗氧化肽组分，以期为鸡骨的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
鸡骨：由故城县茂丰土元鸡养殖基地提供活鸡，再经过屠宰蒸煮处理后得到鸡骨；枯草芽孢杆菌：河北科技大学酶工程实验室保藏。
1.1.2 试剂
胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、无水乙醇：天津欧博凯化工有限公司；琼脂粉、2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、酪蛋白：北京索莱宝有限公司；硫酸、盐酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸铜、硫酸钾：天津市永大化学试剂有限公司；氯化钠、甲醛（40%）：天津市百世化工有限公司；二水合磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、三氯乙酸、邻苯三酚：上海麦克林生化科技有限公司；2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS]：上海碧云天生物技术有限公司。所用化学试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基
Luria-Bertani（LB）液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0；LB 固体培养基：在LB 液体培养基的基础上，加入15 g/L 的琼脂粉；鸡骨粉基础培养基：鸡骨粉10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 自然。上述培养基均在121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
高速万能粉碎机（TAISITE）：天津市泰斯特仪器有限公司；全自动凯氏定氮仪（SKD-1100）：上海沛欧分析仪器有限公司；箱式电阻炉（SX2-5-1）：龙口市电炉制造厂；pH 计（CX 31）：梅特勒托利多仪器上海有限公司；光学显微镜（CX31RBSFA）：奥林巴斯工业有限公司；恒温培养振荡器（ZWY-2102）：上海智城分析仪器制造有限公司；高速冷冻离心机（3-18K）：德国SIGMA公司；酶标仪（Plus384）：美谷分子仪器有限公司；紫外分光光度计（Evolution 220）：美国Thermo 公司；发酵罐（BIOTECH-5BG）：上海保兴生物设备工程有限公司；真空干燥箱（VC 20）：瑞士SalvisLab 集团；有机膜分离实验机（BONA-GM-18H）：山东博纳生物科技集团有限公司；冻干机（ALPHA1-4LD plus）：德国CHRIST 冻干机有限公司；扫描电子显微镜（H-7650）：日本日立公司。
1.3 方法
1.3.1 鸡骨前处理
将鸡屠宰蒸煮，经去肉筋膜处理后得到鸡骨，将得到的鸡骨放置在烘箱中50 ℃烘干，通过粉碎机进行粉碎获得鸡骨粉，将得到的鸡骨粉再次放置烘箱进行50 ℃烘干后过筛，密封置于冰箱保存。
1.3.2 菌种培养
从枯草芽孢杆菌的甘油管中取200 µL 加入LB液体培养基中，放入恒温培养箱，在37 ℃、220 r/min 下培养24 h 进行活化。配制LB 固体培养基，均匀倒入无菌培养皿中，每个培养皿倒入量约为15 mL，待其凝固后将培养24 h 的菌液在平板上均匀划线，于恒温培养箱中培养12 h，用接种环挑取单菌落，进行革兰氏染色[14]，显微镜观察，镜检结果正常再接种至LB 液体培养基中，进行摇瓶培养。
1.3.3 培养基添加葡萄糖的研究
在鸡骨粉基础培养基中添加1.5% 的葡萄糖，同时以不加葡萄糖的鸡骨粉基础培养基作为对照。在上述培养基中分别接种2% 的枯草芽孢杆菌，37 ℃、220 r/min 培养24 h，测定发酵液的菌体浓度，以优化培养基成分。
1.3.4 培养条件单因素优化
在鸡骨粉基础培养基的基础上，分别优化鸡骨粉添加量（1%、2%、3%、4%）、培养基初始pH 值（3、4、5、6、7、8）、菌种接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、装液量（40、50、60、70 mL/250 mL）和培养时间（2、4、8、12、16、20、24、28 h），接种枯草芽孢杆菌后在37 ℃、220 r/min 下发酵培养，发酵结束后以8 000 r/min 的速度离心10 min[15]，收集上清液测定其DPPH·清除率和水解度。
1.3.5 培养条件响应面优化
1.3.5.1 Plackett-Burman 试验
基于单因素试验结果，以鸡骨粉添加量、培养基初始pH 值、装液量、培养时间、菌种接种量为影响因素，以DPPH·清除率为评价指标，进行五因素三水平的Plackett-Burman 的筛选试验。试验因素水平见表1。
表1 Plackett-Burman 试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design
水平因素A 鸡骨粉添加量/%B 培养基初始pH 值E 菌种接种量/%-1 0 1 2 3 4 5 6 7 C 装液量/（mL/250 mL）50 60 70 D 培养时间/h 16 20 24 3 4 5
1.3.5.2 Box-Behnken 试验
基于Plackett-Burman 试验结果，选定鸡骨粉添加量、装液量、培养时间3 个显著因素，以DPPH·清除率作为响应变量，构建二次回归方程，以拟合自变量与DPPH·清除率之间的函数关系，进行鸡骨粉培养基发酵生产抗氧化肽工艺的优化，试验设计见表2。
表2 Box-Behnken 试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design
水平因素A 鸡骨粉添加量/%-1 0 1 2 3 4 B 装液量/（mL/250 mL）50 60 70 C 培养时间/h 16 20 24
1.3.5.3 Box-Behnken 试验分析
采用Design-Expert 11.1.2.0 软件对单因素试验结果进行回归分析，得到DPPH·清除率对鸡骨粉添加量、装液量、培养时间3 个因素的回归模型，研究不同因素对鸡骨粉培养基发酵产生多肽工艺的影响。
1.3.6 指标测定
1.3.6.1 粗蛋白质含量
采用凯氏定氮法测鸡骨粗蛋白质的含量，具体参照王金灿[16]的方法，称取1 g 左右鸡骨粉、0.4 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾至消化管中，再加入20 mL 硫酸进行消化。当消化炉温度达到420 ℃之后，继续消化1 h，取出冷却后，于全自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。
由下列公式计算粗蛋白质含量。
式中：P 为粗蛋白质含量，%；V1 为消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；V2 为空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；c 为盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；0.014 为0.5 mol/L 硫酸或1 mol/L 盐酸标准溶液1 mL 相当于氮克数；m 为样品的质量，g；V3 为吸取消化液的体积，mL；6.25 为氮换算成蛋白质的系数。
1.3.6.2 灰分含量的测定
灰分含量的测定具体参照董红霞等[17]的方法进行并适当改进，将样品放入石英坩埚中，在（550±25）℃下灼烧一定时间，直到样品完全碳化并进一步转化为灰分，直至残留物不再有变化。将灼烧后的残渣放在干燥器中冷却至室温，用分析天平精确称量灰化后的样品质量，通过比较灰化前后样品的质量来计算灰分含量。
由下列公式计算灰分含量。
式中：A 为灰分含量，g/100 g；m1 为坩埚和灰分的质量，g；m2 为坩埚的质量，g；m3 为坩埚和试样的质量，g。
1.3.6.3 菌体浓度的测量
采用细胞密度OD 值的方法测定菌体的浓度[18]。用未加菌液的培养基作为空白液，定量测定培养后的菌体浓度。
1.3.6.4 水解度的测定
采用甲醛滴定法测蛋白质水解度，参照李皖光等[19]的方法并进行适当调整。将8 mL 发酵液溶解于60 mL 蒸馏水中，使用0.5 mol/L NaOH 溶液调整发酵液至pH8.2，然后加入10 mL 的中性甲醛溶液。最后使用0.5 mol/L 标准NaOH 溶液进行标定，记录pH 值至9.2 时消耗的标准NaOH 溶液的体积V1（mL），空白组消耗体积记为V0（mL）。
由下列公式计算水解度。
式中：D 为水解度，%；c 为NaOH 标准溶液的浓度，mol/L；V 为发酵液的总体积，mL；m 为发酵底物的质量，g；N 为发酵底物的总氮含量；0.014 为氮的含克当量。
1.3.6.5 DPPH·清除率的测定
DPPH·清除率的测定参照GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性测定DPPH 和ABTS 法》[20]并进行适当改进，配制50 µg/mL 的DPPH-乙醇溶液，将发酵液和DPPH-乙醇溶液按体积比1∶3 混匀，在25 ℃下避光反应30 min，8 000 r/min 离心10 min 后取其上清液，测定517 nm 下的吸光度。
由下列公式计算DPPH·清除率。
式中：D 为DPPH·清除率，%；A1 为样品的吸光度；A2 为无水乙醇替代DPPH-乙醇溶液作为对照组测定的吸光度；A0 为蒸馏水替代多肽溶液作空白组测定的吸光度。
1.3.6.6 ABTS+·清除率的测定
ABTS+·清除率的测定参照GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性测定DPPH 和ABTS 法》[20]并进行适当改进，称取ABTS 200 mg、过硫酸钾34.4 mg，溶于50 mL蒸馏水，摇匀，4 ℃避光放置24 h 后，用95% 乙醇稀释至吸光度在0.70 左右，作为ABTS 测定溶液。将发酵液和ABTS 测定溶液按体积比1∶9 混匀，25 ℃下避光反应5 min，测定734 nm 下的吸光度。
由下列公式计算ABTS+·清除率。
式中：A 为ABTS+·清除率，%；A1 为ABTS 测定溶液与样品溶剂溶液的吸光度；A2 为ABTS 测定溶液与待测样品溶液的吸光度。
1.3.6.7 邻苯三酚自氧化速率的测定
邻苯三酚自氧化速率的测定参照Li[21]的方法并进行适当改进。配制3 mmol/L 的邻苯三酚溶液，取0.1 mL发酵液和4.5 mL、50 mmol/L Tris-HCl 溶液混匀，静置25 min，再加入0.1 mL 的邻苯三酚溶液混匀，静置5 min，在325 nm 下测定吸光度。
由下列公式计算邻苯三酚自氧化速率。
式中：O 为邻苯三酚自氧化速率，%；A1 为样品的吸光度；A2 为蒸馏水替代邻苯三酚溶液作为对照组测定的吸光度；A0 为蒸馏水替代多肽溶液作空白组测定的吸光度。
1.3.6.8 蛋白酶活力测定
采用GB/T 23527.1—2023《酶制剂质量要求 第1部分：蛋白酶制剂》[22]的福林法测定发酵液的蛋白酶活力，配制一系列不同浓度的酪氨酸标准溶液，向每个标准溶液中加入一定量的福林试剂，40 ℃反应20 min，测定680 nm 下的吸光度，绘制标准曲线。向样品溶液中加入同量的福林试剂，加酪蛋白和三氯乙酸，静置10 min，40 ℃反应20 min，测定680 nm 下的吸光度，从标准曲线上计算出样品的酶活力。
1.3.7 鸡骨抗氧化肽的膜分离及抗氧化性测定
采用1.3.5 优化的培养基，在5 L 发酵罐中接种枯草芽孢杆菌进行扩大培养，发酵生产鸡骨抗氧化肽，将发酵液以8 000 r/min 的速度离心10 min，取上清液，然后将上清液经过0.05 µm 的微滤膜去除大分子量物质，滤液再依次经过10、8、5、3、1 kDa 的超滤膜，得到相应不同分子量段的分离组分。分别收集相应组分，冷冻干燥，获得鸡骨抗氧化肽。
将得到的鸡骨抗氧化肽复溶到去离子水中，获得浓度为5 mg/mL 的抗氧化肽溶液，分别检测其DPPH·清除率、ABTS+·清除率和邻苯三酚自氧化速率。
1.3.8 鸡骨粉微观结构观察
通过扫描电子显微镜观察经过枯草芽孢杆菌发酵前后的鸡骨粉形态结构，将发酵前的鸡骨粉用去离子水清洗2 次，枯草芽孢杆菌发酵后的鸡骨粉先沸水浴加热15 min 后用去离子水清洗3 次，真空干燥除去水分，使用扫描电子显微镜观察。
1.4 数据处理与分析
所有试验至少重复3 次，使用Origin 2022 和SPSS 22.0 两种软件对收集到的数据进行统计分析，结果以平均值±标准差表示。经过单因素方差分析和配对t 检验的综合分析，P＜0.05 表示在统计学上存在显著差异。
2 结果与分析
2.1 鸡骨主要成分分析
分析鸡骨中的蛋白质与灰分，经凯氏定氮法检测鸡骨粗蛋白质的含量为（30.10±0.54）%，灰分含量为（44.65±0.24）g/100 g。
2.2 鸡骨粉培养基添加葡萄糖的研究
葡萄糖作为微生物常用的碳源对微生物的生长繁殖起到很重要的作用。在鸡骨粉初始培养基的基础上添加1.5%的葡萄糖，研究葡萄糖的添加对枯草芽孢杆菌生长的影响，结果见图1。
图1 葡萄糖添加对枯草芽孢杆菌生长的影响
Fig.1 Effect of glucose supplementation on the growth of Bacillus subtilis
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，添加了葡萄糖的鸡骨粉培养基，经过枯草芽孢杆菌发酵后，其菌体浓度低于未添加葡萄糖的培养基。可见葡萄糖的添加对菌株的生产没有促进作用，可能是由于鸡骨粉中含有枯草芽孢杆菌生长所需要的营养成分，其中的蛋白质、脂肪等为菌体生长提供了足够的物质，鸡骨粉中的钙、磷等各种矿物质元素为菌种的生长提供无机离子，而且葡萄糖含量过高可能会造成枯草芽孢杆菌代谢紊乱从而抑制其活性。因此，在后续的研究中，所用发酵培养基只添加鸡骨粉。
2.3 培养条件单因素优化
2.3.1 鸡骨粉添加量的优化
鸡骨粉作为原料产生抗氧化性肽，并在发酵过程中充当碳源、氮源、无机盐和生长因子，鸡骨粉的添加量对枯草芽孢杆菌发酵的影响结果见图2。
图2 鸡骨粉添加量对枯草芽孢杆菌发酵的影响
Fig.2 Effect of the addition amount of chicken bone meal on the fermentation of Bacillus subtilis
同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
从图2 可以看出，对于枯草芽孢杆菌发酵鸡骨粉来说，当鸡骨粉添加量为3%时，DPPH·清除率和水解度最高。造成这种现象的原因可能是当鸡骨粉添加量较低的条件下，培养基内所含的碳源、氮源、无机盐和生长因子等不满足枯草芽孢杆菌的生长条件，而随着鸡骨粉添加量增多，发酵液的DPPH·清除率和水解度都随之增高，鸡骨粉添加量为4% 时DPPH·清除率和水解度稍有下降。因此，选择鸡骨粉添加量2%、3%、4%进行后续试验。
2.3.2 培养基初始pH 值的优化
培养基初始pH 值对枯草芽孢杆菌发酵的影响如图3 所示。
图3 培养基初始pH 值对枯草芽孢杆菌发酵的影响
Fig.3 Effect of initial medium pH on the fermentation of Bacillus subtilis
同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，培养基初始pH 值影响枯草芽孢杆菌的发酵，培养基初始pH 值为6 时发酵液的DPPH·清除率和水解度最高。pH 值过低或过高都会抑制枯草芽孢杆菌的生长以及发酵过程，推测主要是影响菌体内酶的代谢活性[23]，当环境pH 值抑制菌体内某些酶的活性时，就会阻碍菌体的新陈代谢，进而影响发酵过程。此外，pH 值还会影响微生物细胞膜所带电荷的状态，使细胞的通透性发生改变，从而影响微生物吸收营养物质和分泌代谢产物，也会影响代谢产物的稳定性，这也是pH 值过低或过高，发酵液的DPPH·清除率和水解度不高的原因。因此，选择培养基初始pH 值为5、6、7 进行后续试验。
2.3.3 菌种接种量的优化
菌种接种量对枯草芽孢杆菌发酵的影响如图4所示。
图4 菌种接种量对枯草芽孢杆菌发酵的影响
Fig.4 Effect of inoculation amount on the fermentation of Bacillus subtilis
同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，枯草芽孢杆菌接种量为4%时，DPPH·清除率和水解度最高。原因可能是接种量过小，枯草芽孢杆菌生长发育缓慢，发酵不充分，影响抗氧化肽的产生；而接种量过大则会导致前期代谢迅速，枯草芽孢杆菌提前衰老，抗氧化肽合成后劲不足，同时又容易造成菌体浓度过高，破坏发酵液应有的物理性状，也会影响抗氧化多肽产量。也可能菌体起始数量不同，从而微环境不同，进而导致发酵产生差异，这种差异对菌体在生长过程中产生不同的影响[24]。因此，选择菌接种量为3%、4%、5%进行后续试验。
2.3.4 装液量的优化
在发酵过程中限制因素有多方面，溶氧往往最易成为其中主要的控制因素。摇瓶发酵过程中，影响溶氧的因素主要是摇瓶装液量和摇床种类。本研究通过控制摇瓶装液量来控制溶氧量，结果如图5 所示。
图5 装液量对枯草芽孢杆菌发酵的影响
Fig.5 Effect of liquid loading volume on the fermentation of Bacillus subtilis
同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，随着装液量的增加，发酵液的DPPH·清除率和水解度都在增加，在装液量为60 mL/250 mL时最高，但装液量再提高，发酵液的DPPH·清除率和水解度均降低。可能是因为在摇瓶发酵时，由于装液量少，发酵过程中发酵液与空气接触面积较大，从而增大了发酵液的蒸发；而装液量过大，传氧系数和传质传热传动都受到影响。因此，选择装液量为50、60、70 mL/250 mL 进行后续试验。
2.3.5 培养时间的优化
培养时间对枯草芽孢杆菌发酵的影响见图6。
图6 培养时间对枯草芽孢杆菌发酵的影响
Fig.6 Effect of incubation time on the fermentation of Bacillus subtilis
由图6 可知，随着培养时间延长，发酵液的水解度、DPPH·清除率和酶活力都在增加，到20 h 后趋于稳定。枯草芽孢杆菌在发酵前期快速生长，随着培养时间的延长，代谢产生蛋白酶，酶活力升高，将鸡骨蛋白分解成抗氧化肽，发酵液的DPPH·清除率和水解度随之增加；发酵后期，枯草芽孢杆菌会发生自溶[25]，发酵能力逐渐降低，发酵液的水解度、DPPH·清除率和酶活力也不再升高。结合发酵液的水解度、DPPH·清除率和蛋白酶活力3 个指标，综合考虑，确定培养时间为20 h。枯草芽孢杆菌发酵鸡骨制备抗氧化肽的最佳发酵条件为鸡骨粉添加量为3%、培养基初始pH 值为6、菌种接种量为4%、装瓶量60 mL/250 mL、培养时间为20 h，在此条件下，鸡骨蛋白水解度为74.74%，鸡骨抗氧化肽DPPH·清除率为67.73%，蛋白酶活力为232.50 U/mL。因此，选择培养时间为16、20、24 h进行后续试验。
2.4 培养条件响应面优化
2.4.1 Plackett-Burman 试验
鸡骨粉发酵条件Plackett-Burman 试验设计与结果分析见表3 和表4。
表3 Plackett-Burman 试验设计与结果
Table 3 Plackett-Burman experimental design and results
组别A 鸡骨粉添加量/%B 培养基初始pH 值E 菌种接种量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4 2 4 2 2 2 4 4 4 2 4 2 7 7 5 7 5 5 5 7 7 7 5 5 C 装液量/（mL/250 mL）50 70 70 50 70 50 50 50 70 70 70 50 D 培养时间/h 24 16 24 24 16 24 16 16 16 24 24 16 5 5 3 5 5 3 5 3 3 3 5 3 DPPH·清除率/%55.644 6 52.237 8 55.511 0 49.098 2 46.493 0 46.225 8 64.061 5 64.996 7 52.839 0 42.618 6 52.849 0 52.171 0 DPPH·清除率预测值/%54.781 2 51.281 2 52.858 8 49.321 2 45.462 6 46.778 8 64.702 6 63.957 4 54.737 4 43.377 4 54.862 6 52.678 8
表4 Plackett-Burman 试验DPPH·清除率方差分析
Table 4 Analysis of variance of DPPH·scavenging rate in Plackett-Burman test
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源模型自由度A B C D E残差5 1 1 1 1 1 6 11平方和426.9 271.3 0.001 3 73.26 79.32 3.02 65.1 491.99均方85.38 271.3 0.001 3 73.26 79.32 3.02 10.85 F 值7.87 25.01 0.000 1 6.75 7.31 0.278 6 P 值0.013 0 0.002 5 0.991 7 0.040 7 0.035 4 0.616 6显著性*****总差
由表4 可知，回归模型P＜0.05，说明该模型显著。鸡骨粉添加量（A）、培养基初始pH 值（B）、装液量（C）、培养时间（D）、菌种接种量（E）5 个因素中，A 因素影响极显著，C、D 两因素影响显著，B、E 两因素影响不显著，说明单因素中鸡骨粉添加量、装液量和培养时间对DPPH·清除率的影响更显著。根据F 值大小，可以判断5 个因素影响的主次顺序为鸡骨粉添加量＞培养时间＞装液量＞菌种接种量＞培养基初始pH 值。R²=0.867 7，表明回归方程的拟合程度很高，该模型是可靠的，可以用于分析和预测。
2.4.2 Box-Behnken 试验设计结果
鸡骨粉发酵条件响应面设计与结果分析如表5所示。
表5 响应面试验设计与结果
Table 5 Response surface test design and results
组别A 鸡骨粉添加量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2 4 2 4 2 4 2 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 B 装液量/（mL/250 mL）50 50 70 70 60 60 60 60 50 70 50 70 60 60 60 60 60 C 培养时间/h 20 20 20 20 16 16 24 24 16 16 24 24 20 20 20 20 20 Y DPPH·清除率/%55.406 4 61.918 9 55.962 4 58.898 8 54.748 6 64.001 8 56.572 0 63.790 1 62.546 4 61.992 8 64.653 7 62.349 9 68.018 1 68.701 4 69.113 7 70.118 3 69.625 4 DPPH·清除率预测值/%54.581 2 62.849 2 55.038 8 59.730 8 55.521 7 63.019 3 57.558 3 63.020 7 62.608 2 62.152 8 64.502 2 62.296 8 69.120 0 69.120 0 69.120 0 69.120 0 69.120 0
2.4.3 回归模型建立与方差分析
基于表5 中响应面试验设计数据，得到DPPH·清除率（Y）与鸡骨粉添加量（A）、装液量（B）和培养时间（C）的二次多项回归方程：Y=69.12+3.24A-0.665 2B+0.509 5C-0.894 0AB-0.508 8AC-0.437 5BC-7.09A2-3.98B2-2.25C2。
回归方程方差分析如表6 所示。
表6 回归方程方差分析
Table 6 Analysis of variance of the regression equation of DPPH·scavenging rate
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源模型自由度A B C AB显著性****AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总差平方和420.91 83.98 3.54 2.08 3.2 1.04 0.765 7 211.55 66.72 21.3 8.92 6.27 2.64 429.83 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方46.77 83.98 3.54 2.08 3.2 1.04 0.765 7 211.55 66.72 21.3 1.27 2.09 0.660 4 F 值36.72 65.93 2.78 1.63 2.51 0.812 9 0.601 2 166.08 52.38 16.72 P 值＜0.000 1＜0.000 1 0.139 4 0.242 4 0.157 1 0.397 2 0.463 5＜0.000 1 0.000 2 0.004 6******3.17 0.147 3
由表6 可知，回归模型P＜0.01，说明该模型极显著；一次项中，A 因素影响极显著，B、C 因素不显著，说明单因素中鸡骨粉添加量对DPPH·清除率的影响更显著。基于F 值的大小，可以确定影响DPPH·清除率的3 个主要因素的主次排序为鸡骨粉添加量＞装液量＞培养时间；失拟项P=0.147 3＞0.05，不显著；R²=0.979 3，说明回归方程拟合度好，该模型是可靠的，可以用于分析和预测[26]。
2.4.4 培养条件优化及验证
利用Design-Expert 11.1.2.0 软件，优化最佳发酵条件：鸡骨粉添加量3.23%、装液量58.86 mL/250 mL、培养时间20.39 h，根据实际操作的可行性，调整为鸡骨粉添加量3.2%、装液量59 mL/250 mL、培养时间20 h。在此条件下，鸡骨抗氧化肽的DPPH·清除率为69.55%，比优化前的DPPH·清除率提高了1.82%。
采用最优发酵条件，经过验证试验，获得的鸡骨抗氧化肽的DPPH·清除率为69.73%，鸡骨蛋白水解度为77.93%，基本符合预测值，说明优化的枯草芽孢杆菌发酵制备鸡骨抗氧化多肽的工艺参数是准确可靠的。
2.5 鸡骨抗氧化肽的膜分离及抗氧化性研究
在摇瓶优化的基础上，在5 L 发酵罐中扩大培养。采用5 L 发酵罐培养后，将获得的鸡骨抗氧化肽发酵液进行有机膜分离，获得5 个组分，分别是组分Ⅰ（截留分子量≥10 kDa）、Ⅱ（截留分子量8～＜10 kDa）、Ⅲ（截留分子量5～＜8 kDa）、Ⅳ（截留分子量3～＜5 kDa）、Ⅴ（截留分子量1～＜3 kDa）。由于组分Ⅰ分子量大，不符合多肽的特征，因此，后续选取截留分子量在1～10 kDa的组分，检测各组分的DPPH·清除率、ABTS+·清除率和邻苯三酚自氧化速率，检测结果如图7 所示。
图7 不同组分抗氧化肽的抗氧化性能
Fig.7 Antioxidant activities of different antioxidant peptides
同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
从图7 可以看出，各组分的DPPH·清除率均达到50% 以上，ABTS+·清除率均达到89% 以上，邻苯三酚自氧化速率均在20%以上。由此可知，枯草芽孢杆菌发酵法制备的鸡骨抗氧化肽在分子量1～10 kDa 都表现出良好的抗氧化活性。
2.6 鸡骨粉微观结构的观察
鸡骨粉主要由蛋白质和一些化合物组成，可以通过扫描电子显微镜来观察鸡骨粉的形态结构。通过扫描电子显微镜观察枯草芽孢杆菌发酵前后鸡骨粉形态结构的变化，结果如图8 所示。
图8 扫描电子显微镜观察发酵前后鸡骨粉形态结构的变化
Fig.8 Morphological structure changes of chicken bone meal before and after fermentation
A.发酵前放大5 000 倍；B.发酵前放大2 500 倍；C.发酵后放大5 000 倍；D.发酵后放大2 500 倍。
由图8 可知，发酵前的鸡骨粉饱满，表明光滑，表面未有破损情况，整体结构完整；发酵后的鸡骨粉结构不完整，表面有很多凹陷，破损严重，判断鸡骨粉已被水解，由此可以推断利用枯草芽孢杆菌发酵法制备鸡骨抗氧化肽的方法是可行的。
3 结论
本研究鸡骨原料来源于鸡加工后的副产物，旨在为鸡骨的综合利用和生物活性肽高附加值产品的开发提供理论支撑。鸡骨粉碎成粉，不额外添加其他成分，加水制备成鸡骨粉发酵液；然后采用枯草芽孢杆菌发酵法水解获得含鸡骨抗氧化肽的发酵液，原料成本低、工艺操作简单，单因素和响应面优化培养条件，得到最优发酵条件：鸡骨粉添加量3.2%、培养基初始pH 值6、菌接种量4%、装液量59 mL/250 mL、培养时间20 h，在此条件下，DPPH·清除率为69.55%；发酵液再经过膜分离和干燥过程制备鸡骨抗氧化肽，在分子量1～10 kDa 均表现出良好的抗氧化活性，各组分的DPPH·清除率均达到50%以上；ABTS+·清除率则均达到89%以上；邻苯三酚自氧化速率均在20% 以上；最后扫描电子显微镜结果显示，鸡骨粉形态结构发生改变，表面出现凹陷破损，判断出鸡骨粉已被水解，也可知利用枯草芽孢杆菌发酵法制备抗氧化肽的可行性。本研究制备的鸡骨抗氧化肽具有较高的抗氧化特性，可清除自由基的损伤，保护机体免受氧化损伤，可单独作为产品开发，也可添加到食品或饲料中提高其可利用价值，本研究符合国家对大健康产业大力扶持的政策，也为后续的抗氧化肽结构鉴定、抗氧化机制以及体内抗氧化研究奠定基础。
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