发酵是鱼类加工的重要手段。发酵鱼是我国广受欢迎的传统食物之一，发酵类型多且极具地方性特色，典型代表如贵州酸鱼、安徽臭鳜鱼、广东糟鱼、潮汕鱼露以及海南鱼茶等[1]。传统发酵鱼工艺主要是自然发酵，生产周期长且易受原料和发酵环境的影响，使得微生物菌群结构更复杂，限制了发酵鱼制品的品质和食用安全性。相较于传统发酵工艺，定向接种发酵可以较好地缩短发酵周期，抑制有害菌的生长和繁殖，并能提升产品的安全性[2]。
微生物能促进蛋白质降解、有助于有机酸和氨基酸等风味前体物质形成。目前人工接种所用的发酵剂大多是从传统发酵产品中分离筛选出的有益菌种，主要包括乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌及霉菌[3]，在改善风味和品质方面发挥着不可替代的作用。乳酸菌在发酵体系中可以迅速降低pH 值，产生的细菌素可有效抑制发酵体系内有害菌增殖[4]。例如，Dicks 等[5]利用产细菌素的植物乳杆菌423 以及弯曲乳杆菌DF126 抑制萨拉米香肠中单增李斯特菌的生长，研究发现发酵9 h可使单增李斯特菌数量从107 CFU/g 降低至104 CFU/g。乳酸菌产生的细菌素不仅对单增李斯特菌具有抑制作用，还会对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等产生抑菌效果，在食品安全方面起到积极作用[6]。酵母菌在鱼肉发酵中大量消耗氧气，进而抑制好氧腐败菌及致病菌的生长繁殖。同时利用碳水化合物进行酒精发酵，产生大量醇类物质，形成风味酯[7]。
然而，微生物的生化活动是复杂多变的，为了保证工业生产的稳定性，需要对发酵过程中的微生物进行动态监测。目前对发酵鱼微生物群方面的研究主要集中在细菌群落，对真菌群落演替及多样性变化研究较少，但德巴利酵母菌、假丝酵母菌、酵母菌等是几种传统发酵鱼产品中的常见酵母菌属，它们对发酵鱼风味、质地和营养价值有重要影响[8]，但在促进发酵风味形成的同时，会使挥发性盐基氮、生物胺等含量升高，造成发酵鱼品质下降[9]。因此为了生产高品质的发酵鱼产品，监测发酵产品中存在的真菌群落组成和行为至关重要。
为揭示金鲳鱼片短时发酵过程中真菌群落及风味形成的变化规律，本研究以金鲳鱼为原料，采用直投式混合乳酸杆菌短时发酵，通过单因素及响应面试验确定短时发酵的最佳工艺，并对水分、粗脂肪、粗蛋白和总糖等基本指标和总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、pH 值及质构等品质指标进行测定。通过高通量测序测定短时发酵金鲳鱼片在发酵过程中真菌群落演替动态以及多样性，以期为短时发酵金鲳鱼片的品质控制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
金鲳鱼[质量（0.70±0.05）kg/条，长（25±1）cm/条]：市售；混合乳杆菌（嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌和植物乳杆菌）[10～11 lg（CFU/g）]：山东向日葵生物工程有限公司；三氯乙酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硼酸、氢氧化钠：西陇科学股份有限公司；浓硫酸：广州化学试剂厂；氧化镁：上海源叶生物科技有限公司；DNA 凝胶回收纯化试剂盒：上海美吉逾华生物医药科技有限公司。所有试剂均为分析纯。
发酵箱（HB 型）：北京浩博盛世经贸有限公司；电子分析天平（ALZ04 型）、红外快速水分测定仪（HB43-S 型）：梅特勒-托利多仪器有限公司；高速冷冻离心机（5810R 型）：德国Eppendorf 公司；凯氏定氮仪（K9840型）：济南海能仪器有限公司；电热鼓风恒温干燥箱（101-2 型）：常州市华普达教学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（T6 型）：北京普析通用仪器有限责任公司；pH 计（PHS-3C）：上海精科实业有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 工艺流程
工艺流程：金鲳鱼→宰杀→清洗→切块→腌制→烘制→接种发酵→成品。
参考Zeng 等[10]的方法处理金鲳鱼片，将鱼洗净、去内脏、去头，然后将金鲳鱼切成约6 cm×3 cm×1 cm的鱼片。金鲳鱼片经腌制、烘制后接种混合乳杆菌进行发酵。金鲳鱼片发酵初始参数：NaCl 含量为鱼片质量的4%，4 ℃腌制1 h，55 ℃烘制58 min，菌种添加量为鱼片质量的4%，37 ℃发酵20 h。
1.2.2 理化指标
按照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》测定金鲳鱼片的总酸含量（以乳酸0.090为换算系数）。采用凯氏定氮法测定鱼肉中TVB-N 的含量，反映接种发酵金鲳鱼片的蛋白质降解程度。
1.2.3 感官评价
参考Yang 等[11]的方法，选取15 名受过专业感官评价培训的人员组成评定小组，通过观察、触摸、闻和品尝对发酵金鲳鱼片的色泽、滋味、口感、组织状态进行感官评价。总结每位感官评定者对接种发酵金鲳鱼片的总评分，最后取这15 名感官评定者的平均值作为最终感官得分。感官评价标准见表1。
表1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
指标色泽（20 分）滋味（25 分）口感（30 分）组织状态（25 分）评分标准鱼肉呈红色，带有光泽，无油滴析出鱼肉呈浅红色，光泽度一般，少量油滴析出鱼肉呈浅褐色，光泽度较差，表面有大量油滴鱼肉呈深褐色，无光泽有鱼肉发酵后的酸味，无不良气味发酵后酸味稍浓或稍淡，无不良气味发酵后酸味较重且有轻微腐败气味有明显的发酵臭味、腐败等不良气味肉质细腻，紧实且具有弹性肉质较为细腻，较紧实较有弹性肉质一般，紧实度和弹性一般肉质粗糙，松散无弹性肉质整齐，肌肉纤维纹理明显肉质较整齐，肌肉纤维纹理较明显肉质基本整齐，肌肉纤维纹理基本明显肉质较黏稠，肌肉纤维纹理模糊分值16～20 11～＜16 6～＜11 0～＜6 21～25 16～＜21 11～＜16 0～＜11 26～30 21～＜26 16～＜21 0～＜16 21～25 16～＜21 11～＜16 0～＜11
1.2.4 单因素试验
根据1.2.1 的加工方法，对金鲳鱼片进行单因素试验。以总酸含量、TVB-N 含量和感官评分为依据，探究NaCl 含量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、菌种添加量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）、发酵温度（30、35、40 ℃）以及发酵时间（0、5、10、15、20、25、30 h）对发酵金鲳鱼片的影响。
1.2.5 响应面法优化加工工艺
本研究结合单因素试验结果，取3 个因素（NaCl含量、发酵时间、菌种添加量）设计三因素三水平试验，通过响应曲面的分析，获得最佳加工工艺。响应面设计因素与水平见表2。
表2 响应面设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface design
水平-1因素A NaCl 含量/%C 菌种添加量/%0 1 4 6 8 B 发酵时间/h 20 25 30 6 8 10
1.2.6 发酵金鲳鱼片的基本成分
采用水分测定仪测定金鲳鱼片中的水分含量。采用索氏提取法测定金鲳鱼片中的总脂肪含量。采用凯氏定氮法测定金鲳鱼片中的蛋白质含量。按照GB/T 9695.31—2008《肉制品总糖含量测定》中的方法测定金鲳鱼片中的总糖含量。按照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的方法测定金鲳鱼片中的灰分含量。在测定灰分的基础上，测定盐分含量。
1.2.7 接种发酵对金鲳鱼片TVB-N 含量、TBA 值、pH值及质构的影响
1.2.7.1 TVB-N 含量的测定
按照1.2.2 的方法测定TVB-N 含量。
1.2.7.2 TBA 值的测定
称取5 g 均质过的鱼肉，加入7.5% 三氯乙酸25 mL，离心（4 ℃，6 000×g，20 min）。取上清液加入等体积的0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）溶液，90 ℃水浴40 min。冷却，离心（10 000×g，5 min），将上清液倒入烧杯中，再倒入等体积三氯甲烷，充分振荡使其油相和水相分离，待分层后把上清液分离出来，使用紫外可见分光光度计分别在波长532 nm 和600 nm 处测定金鲳鱼片的吸光度，最后根据Sun 等[12]方法进行数据分析，结果以mg MDA eq/kg 表示。
1.2.7.3 pH 值的测定
称取3 g 绞碎的鱼肉，加入30 g 的0.1 mol/L 氯化钾溶液，磁力搅拌30 min，静置30 min 后过滤，利用pH 计测定滤液pH 值。每组样品测定3 次平行。
1.2.7.4 质构的测定
质构测定按照Wei 等[13]的方法进行，略有修改。测前、测中和测后速率均为1.0 mm/s；压缩鱼片厚度50%，探头两次测定间隔时间5 s。
1.3 高通量测序分析
对样品进行DNA 提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和MiSeq 测序，分析微生物的多样性。取2 g 发酵鱼肉样本置于无菌冻存管中，-80 ℃保存，干冰寄送。采用DNA 试剂盒方法，分别提取新鲜和发酵0、10、25 h 鱼片中微生物的DNA。进行Illumina MiSeq 测序及微生物数据分析，PCR 扩增上 游 引 物IFS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和下游引物ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），对ITS 基因ITS1 区扩增。使用2% 琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用DNA 凝胶回收纯化试剂盒进行回收产物纯化，并通过Qubit 4.0 软件对回收产物进行定量检测。配对端测序（2×300）在MiSeq 平台分析。使用UPARSE 以95% 的相似性对操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行聚类，置信度阈值为70%。
1.4 数据处理
数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 23.0、Design-Expert 13.0 和GraphPad prism 9.5.1 软件进行数据处理与绘图。采用单因素方差分析和Duncan 检验比较各组间的显著性差异。
2 结果与分析
2.1 接种发酵金鲳鱼片的工艺优化
2.1.1 NaCl 含量对接种发酵金鲳鱼片品质的影响
传统发酵在肉制品中添加4%～6%（质量分数）的NaCl，来延长食品的保质期。同时，随着发酵过程中水分不断流失，最终产物的盐浓度可能会更高[14]。NaCl含量对发酵金鲳鱼片品质的影响见表3。
表3 NaCl 含量对发酵金鲳鱼片品质的影响
Table 3 Effect of NaCl content on the quality of fermented golden pompano fillets
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
NaCl 含量/%2 4 6 8 10 12总酸含量/（g/kg）4.82±0.01d 4.86±0.01d 6.34±0.02a 5.75±0.01b 5.16±0.00c 5.02±0.00c TVB-N 含量/（mg/100 g）25.67±0.11a 21.29±0.90b 15.47±0.82c 20.35±0.27b 22.29±0.63b 22.17±0.89b感官评分82 83 86 73 70 65
由表3 可以看出，随着NaCl 含量的增加，发酵体系的总酸含量呈现先上升后下降的趋势。在NaCl 含量为6% 时，接种发酵金鲳鱼片的总酸含量最高，为6.34 g/kg，此时TVB-N 含量最低（15.47 mg/100 g），这可能是发酵环境中酸度较高抑制了微生物的生长繁殖。当NaCl 含量由10%增加到12%时，NaCl 含量过高，产品的汁液流失率增加、鱼肉松散无弹性[15]。NaCl含量为12%时，感官评分最低，为65。NaCl 含量过高影响口感，掩盖了发酵鱼的部分风味；而NaCl 的过量摄入不仅容易诱发高血压和胃癌等疾病，也会在一定程度上抑制乳酸菌的生长繁殖[16]。因此，后续选择NaCl 含量4%、6%、8%进行响应面优化试验。
2.1.2 菌种添加量对接种发酵金鲳鱼片品质的影响
菌种添加量对发酵金鲳鱼片品质的影响见表4。
表4 菌种添加量对发酵金鲳鱼片品质的影响
Table 4 Effect of strain addition on the quality of fermented golden pompano fillets
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
菌种添加量/%4 6 8 10 12 14总酸含量/（g/kg）5.76±0.01a 5.22±0.01b 4.96±0.01c 4.69±0.01d 4.45±0.00e 4.71±0.02d TVB-N 含量/（mg/100 g）21.69±0.18a 8.10±0.10f 17.66±0.14c 15.48±0.12e 17.13±0.09d 19.42±0.03b感官评分80 85 88 87 84 79
由表4 可知，发酵体系的总酸含量随着菌种添加量的增加整体呈下降趋势，并且鱼腥味减弱。当菌种添加量超过鱼片质量的10% 时，鱼片酸味明显，光泽感差且肌肉组织纹理较模糊，使部分感官评定人员难以接受。菌种添加量为鱼片质量的6% 时，TVB-N 含量最低（8.10 mg/100 g）。但是发酵20 h 的金鲳鱼片鱼腥味稍重且肉质松散无弹性。结合感官评分发现在添加鱼片质量8%的菌种时感官评分最高，为88，此时接种发酵金鲳鱼片口感和风味效果较好。因此，后续选择菌种添加量6%、8%、10%进行响应面优化试验。
2.1.3 发酵温度对接种发酵金鲳鱼片品质的影响
发酵温度对发酵金鲳鱼片品质的影响见表5。
表5 发酵温度对发酵金鲳鱼片品质的影响
Table 5 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented golden pompano fillets
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
发酵温度/℃30 35 40总酸含量/（g/kg）5.22±0.01b 5.25±0.01ab 5.25±0.01a TVB-N 含量/（mg/100 g）8.63±0.25c 21.59±0.45b 29.29±0.48a感官评分80 86 77
混合乳杆菌在发酵温度为30～40 ℃的条件下适合生长繁殖。由表5 可知，发酵温度为30 ℃时，发酵金鲳鱼片的风味不足、鱼腥味较重；发酵温度为35 ℃时，发酵的鱼肉呈红色、肉质紧实有弹性、表面有少量油滴析出、肌肉纤维纹理明显且发酵风味浓郁，感官评分较高（86）。发酵温度为40 ℃时，鱼片表面有油滴析出、肉质松软、发酵后鱼片酸味较重且有轻微腐败气味。发酵温度过高，导致乳杆菌的活性受到抑制，不利于发酵鱼风味的形成，鱼肉快速腐败；过低则不利于乳杆菌的生长繁殖，影响发酵金鲳鱼片的色香味。因此，最佳发酵温度为35 ℃。
2.1.4 发酵时间对接种发酵金鲳鱼片品质的影响
发酵时间对发酵金鲳鱼片品质的影响见表6。
表6 发酵时间对发酵金鲳鱼片品质的影响
Table 6 Effect of fermentation time on the quality of fermented golden pompano fillets
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
发酵时间/h 0 5 10 15 20 25 30总酸含量/（g/kg）6.88±0.01a 5.95±0.01b 5.80±0.01c 5.65±0.01d 5.52±0.01e 5.33±0.01f 4.91±0.00g TVB-N 含量/（mg/100 g）10.79±0.11g 11.49±0.08f 13.89±0.06e 15.03±0.02d 15.64±0.10c 16.81±0.15b 20.49±0.23a感官评分78 76 77 73 79 85 69
如表6 所示，发酵25 h 总酸含量基本稳定，感官评分最高（85），口感较佳，鱼肉组织肌理明显且无油滴析出，容易被感官评价者接受。发酵20 h 之前，发酵鱼片风味不足；发酵30 h，鱼片产生不良气味，肉质松散无弹性，这可能是由于蛋白质过度降解，产生一些苦味物质和腐败气味。因此，发酵时间为25 h 时的口感较佳，此时发酵金鲳鱼片TVB-N 含量为16.81 mg/100 g，未超出30 mg/100 g。因此，后续选择发酵时间20、25、30 h 进行响应面优化试验。
2.1.5 响应面试验结果分析
2.1.5.1 响应面试验分析
响应面试验设计和结果见表7。
表7 响应面试验设计和结果
Table 7 Response surface test design and results
试验号A NaCl含量/%C 菌种添加量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8 6 1 0 8 8 8 8 8 6 1 11 12 13 14 15 16 17 6 4 8 4 4 6 6 8 8 4 6 6 6 6 6 8 6 B 发酵时间/h 25 25 25 20 30 25 25 20 25 25 25 25 30 20 30 30 20 0 8 8 10 10 6 8 6 Y 感官评分85 74 77 73 72 87 88 70 75 76 86 85 74 76 79 78 73
利用Design-Expert 13.0 软件对表7 结果进行回归拟合分析，得到回归模型为Y=86.20+0.625A+1.38B+0.25C+2.25AB-2.00BC-6.48A2-6.48B2-4.23C2。
接种发酵金鲳鱼片的工艺参数回归分析见表8。
表8 接种发酵金鲳鱼片的工艺参数回归分析
Table 8 Regression analysis of technological parameters of inoculated and fermented golden pompano fillets
注：*表示对结果影响显著，p＜0.05；**表示对结果影响极显著，p＜0.01。
方差来源模型A NaCl 含量B 发酵时间C 菌种添加量AB AC BC平方和531.21 3.13 15.13 0.5自由度均方差59.02 3.13 15.13 0.5 F 值32.92 1.74 8.44 0.28 p 值＜0.000 1 0.228 3 0.022 8 0.613 8显著性**A2 B2** * **C2 11.29 0 8.92 98.46 98.46 41.92 0.012 1 1 0.020 3＜0.000 1＜0.000 1 0.000 3****残差失拟项纯误差总误差20.25 0 16 176.53 176.53 75.16 12.55 5.75 6.8 543.76 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16 20.25 0 16 176.53 176.53 75.16 1.79 1.92 1.7 1.13 0.437 8
由表8 可知，发酵鱼片的模型拟合良好，p 值小于0.000 1，该试验的回归模型决定系数（R2）为0.976 9，说明发酵金鲳鱼片的实际感官评分与预测值有较好的相关性，可以解释97.69%的响应值变化。模型的离散系数为1.71%，表明试验精确度高、操作可信，可用此模型对不同条件下金鲳鱼片的发酵效果进行分析和预测。
2.1.5.2 响应面交互作用分析与优化
NaCl 含量、发酵时间和菌种添加量因素间交互作用见图1。
图1 NaCl 含量、发酵时间和菌种添加量因素间交互作用
Fig.1 Interaction among NaCl content，fermentation time，and strain addition
由图1 可知，NaCl 含量和发酵时间交互作用、发酵时间和菌种添加量交互作用对发酵金鲳鱼片感官评分的响应显著，NaCl 含量和菌种添加量交互作用对感官评分的响应不显著。经分析可得，最优因素组合为NaCl 含量6.137%、发酵时间25.589 h、菌种添加量8.004%，在此条件下感官评分的理论预测值为86.303。考虑实际情况，确定最佳发酵工艺为NaCl 含量6%、腌制时间1 h、烘制温度55 ℃、烘制时间58 min、菌种添加量8%、发酵温度35 ℃、发酵时间25 h。在此条件下进行验证试验，得到的发酵金鲳鱼片酸香味突出、色泽明亮、口感细腻、肉质紧致具有弹性、肌肉纤维纹理明显。总体感官评分为88，与理论预测值接近，相对误差为1.97%；此时总酸含量为5.33 g/kg，TVB-N 含量为16.81 mg/100 g。
2.1.6 接种发酵金鲳鱼片的基本组分
发酵25 h 金鲳鱼片的基本组成：水分59.35%、粗脂肪4.1 g/100 g、粗蛋白11.68 g/100 g、总糖0.74 g/100 g、灰分4.66 g/100 g 和盐分4.72%。
2.1.7 接种发酵对金鲳鱼片TVB-N 含量、TBA 值、pH值及质构的影响
接种发酵对金鲳鱼片理化指标的影响见表9。
表9 接种发酵对金鲳鱼片理化指标的影响
Table 9 Effect of inoculated fermentation on physicochemical indexes of golden pompano fillets
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
发酵时间/h 0 5 10 15 20 25 30 TVB-N 含量/（mg/100 g）10.79±0.11g 11.49±0.08f 13.89±0.59e 15.03±0.02d 15.64±0.10c 16.80±0.15b 20.49±0.23a TBA 值/（mg MDA eq/kg）0.08±0.01c 0.08±0.01c 0.10±0.01bc 0.12±0.04bc 0.15±0.01abc 0.17±0.03ab 0.21±0.05a pH 值6.88±0.03a 5.95±0.01b 5.80±0.01c 5.65±0.02d 5.52±0.02e 5.32±0.01f 4.91±0.00g硬度/g 467.00±1.00g 528.67±0.67f 539.67±0.33e 620.33±0.33d 702.67±1.76c 854.00±1.16b 924.67±0.67a弹性/mm 3.84±0.13b 5.11±0.20ab 5.27±0.08ab 4.92±0.13ab 5.56±1.16a 5.68±0.47a 4.19±0.10ab咀嚼性/mJ 9.67±0.07c 9.53±0.07c 8.67±0.03e 9.13±0.03d 10.57±0.09b 18.57±0.09a 7.57±0.17f
如表9 所示，接种发酵的金鲳鱼片pH 值随着发酵时间的延长呈下降趋势，这是由于接种的混合乳杆菌具有较好的产酸特性，能够快速利用碳水化合物分解产生有机酸，从而使发酵体系处于酸性环境中[17]。由于微生物和内源酶的作用，蛋白质发生降解、脂质发生氧化，产生游离脂肪酸和游离氨基酸，形成香味物质和香味前体物质[18]。同时，这一过程也会产生氨以及胺类等含碱性氮化合物，使TVB-N 含量显著增加[19]，脂质氧化使TBA 值由0.08 mg MDA eq/kg 增加到0.21 mg MDA eq/kg。随着发酵过程中pH 值降低至蛋白质等电点附近时，水溶性蛋白及盐溶性蛋白发生变性聚集，导致含量逐渐减少，此时不溶性蛋白含量逐渐增加，从而形成不溶性凝胶网络结构，使鱼片硬度、弹性和咀嚼性显著增加[20]。发酵30 h 鱼片的咀嚼性为7.57 mJ，此时鱼片表面大量油滴析出、肌肉纹理模糊，这可能是由于蛋白质、脂质等大分子物质过度降解导致鱼肉组织结构松散、咀嚼性下降。结果表明，发酵使金鲳鱼片pH 值降低，TVB-N 含量增加、TBA 值提高，同时改变了鱼片的质构特性。
2.2 短时发酵金鲳鱼片真菌群落的变化规律
2.2.1 发酵过程中金鲳鱼片真菌α 多样性分析
微生物活动是蛋白质降解产生发酵风味的关键。为了研究金鲳鱼片在发酵过程中真菌群落组成动态变化的多样性，分别选取新鲜（FRE）、发酵0 h（F0）、发酵10 h（F10）、发酵25 h（F25）的金鲳鱼片（4 组）进行ITS1F 测定分析。测序共获得了1 169 563 个高通量序列。α 多样性是样品中生态系统的多样性分析。常用Chao 1 指数和Sobs 指数用于反映群落中真菌种类的数量，指数越高表明真菌的种类越多。Shannon 指数和Simpson 指数这两个指标则是从样本丰度和均匀度的角度来反映物种的多样性，指数越大则表示群落中的物种多样性越丰富[21]。
发酵金鲳鱼片真菌群落α 多样性分析结果见图2。
图2 发酵金鲳鱼片真菌群落α 多样性分析
Fig.2 Analysis of α diversity in fungal community of golden pompano fillets
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
如图2 所示，与FRE 相比，F0 与F10 两组Sobs 指数和Chao 1 指数增加，表明发酵丰富了鱼片中真菌多样性；F25 组明显降低，这是由于发酵环境抑制了部分真菌的生长繁殖以及微生物生长过程中的竞争抑制作用。与FRE 组相比，F25 组的Shannon 指数显著降低，Simpson 指数显著增加，这表明鱼片经发酵后真菌菌群多样性降低，发酵可以延缓鱼片真菌菌群结构多样性上升的趋势。
2.2.2 发酵过程金鲳鱼片真菌的主成分分析（principal components analysis，PCA）
为了评估不同群体之间群落结构的相似性，使用PCA 来表示不同样本中的群落变化，分析不同组群落物种多样性的差异。分组样品距离越近，表示样品微生物群落越相似。
金鲳鱼片真菌的PCA 分析结果见图3。
图3 金鲳鱼片真菌的PCA 分析
Fig.3 PCA analysis of fungi in golden pompano fillets
如图3 所示，PCA 显示主成分1 和主成分2 的贡献率分别为37%和11.4%。FRE 与F0 两组部分重叠在一起，F25 与F10 距离较近且与其他两个组明显分离，表明发酵改变了鱼片的菌群结构。
2.2.3 发酵金鲳鱼微生物组成分析
为了研究各组样本菌落组成的变化，在不同门水平上对菌群的相对丰度进行分析，结果见图4。
图4 门水平相对丰度
Fig.4 Relative abundance of phylum level
如图4 所示，子囊菌门（Ascomycota）在新鲜样品中是主要的真菌门，担子菌门（Basidiomycota）占第二位，随着接种发酵时间的延长，在F10 发酵时间节点担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）共同成为优势真菌门；在发酵末期，子囊菌门（Ascomycota）相对丰度减小，担子菌门（Basidiomycota）相对丰度逐渐增加，成为发酵后期的优势真菌。这一结果与Nie等[22]报道的黑鲈鱼发酵结果趋势相似，但不同的是他们发现在真菌门水平上，担子菌门是新鲜黑鲈鱼样品的优势门，之后子囊菌门相对丰度逐渐增加，成为发酵后期的重要真菌门。随着发酵的进行，真菌群落结构也会发生变化，这可能是由于真菌群落具有演替性[23]。酸米汤[24]、发酵乳制品[25]、红菌豆腐[26]、干绯红鲷鱼[27]等许多传统发酵食品中都能发现子囊菌门（Ascomycota）与担子菌门（Basidiomycota）在发酵过程中交替变化的趋势。总之，在门水平上不同样品之间的真菌群落多样性简单且相似。
为了进一步研究发酵对于金鲳鱼片菌群组成的影响，对各组微生物在属水平上的相对丰度进行分析，结果见图5。
图5 属水平上真菌相对丰度柱状图和圈图
Fig.5 Relative abundance histogram and circos diagram of fungi at generic level
由图5 可知，在属水平上共鉴定出9 个优势属，分别为毛孢子菌属（Trichosporon）、德巴利酵母属（Debaryomyces）、曲霉属（Aspergillus）、红酵母属（Rhodotorula）、假丝酵母菌属（Candida）、囊担菌属（Cystobasidium）、变形担子菌酵母属（Apiotrichum）、镰孢菌属（Fusarium）和其他。其中大多数真菌为酵母科中的一属。酵母是一类能够将糖转化为乙醇和二氧化碳的单细胞真菌，它在肉类发酵过程中发挥着关键作用：一是通过呼吸来消耗氧，降低氧化还原电位，从而防止肉的氧化变色。此外，酵母菌还能分解肉中的脂肪和蛋白，产生乙醇，促进酯化反应生香和呈色稳定性，进而改善产品风味[28]。酵母菌是传统自发酵鱼制品中常见的微生物，主要来源于原料本身及发酵环境。酿酒酵母和异常汉逊酵母是传统酸鱼自发酵过程中的优势微生物，非洲和日本等地的发酵鱼制品中也发现了德巴利氏酵母属、毕赤酵母属、红酵母属和假丝酵母菌属等[29]。研究表明，酵母菌与接种的混合乳杆菌除了存在底物相互竞争之外，亦存在相互协作的关系。酵母菌为乳酸菌提供各种必须营养物质，而乳酸菌的代谢活动是酵母菌的能量来源，在发酵体系中促进发酵金鲳鱼片风味的形成[30]。
由图5 可知，新鲜金鲳鱼片的优势真菌属为德巴利酵母属（Debaryomyces）和曲霉属（Aspergillus）。在发酵中期，毛孢子菌属（Trichosporon）成为优势真菌属，其次是假丝酵母菌属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、德巴利酵母属（Debaryomyces）与曲霉属（Aspergillus）。Zang 等[31]在研究中国传统发酵酸鱼时也有类似结果，他们发现假丝酵母菌属（Candida）在发酵中期成为优势真菌属，它主要是通过埃尔利希途径（Ehrlich pathway）代谢支链氨基酸产生挥发性化合物。曲霉属（Aspergillus）是传统发酵产品中的常见属，Wen等[32]发现在发酵干香肠相对丰度前30 的真菌中，其中有8 个都属于曲霉属，它通过分解蛋白质和脂质在改善风味方面起着重要作用[33]。Zang 等[31]发现曲霉属在很大程度上参与酯化和糖酵解。德巴利酵母属（Debaryomyces）属于半酵母类的非常规酵母物种，有极高的耐盐性，因其对蛋白和脂肪的水解能力较强，常用于奶酪和干腌肉制品中[34]。Sun 等[8]指出，德巴利酵母属（Debaryomyces）虽然有助于发酵风味的形成，但是它与TVB-N 含量、TBA 值和生物胺含量呈正相关，造成发酵酸鱼品质的下降。本研究结果显示德巴利酵母属（Debaryomyces）在发酵后期相对丰度明显下降，这有利于短时发酵金鲳鱼品质的形成。镰孢菌属（Fusarium）在接种发酵前期具有潜在毒性[35]，随着发酵的进行，镰孢菌属（Fusarium）相对丰度逐渐降低，表明短时发酵有助于减少鱼片中有毒有害物质的产生。研究发现，在发酵后期毛孢子菌属（Trichosporon）表现出极强的竞争能力，相对丰度大幅增加，成为优势真菌属，新鲜鱼片中未检测到此菌属。而曲霉属（Aspergillus）和红酵母属（Rhodotorula）等在发酵中期呈现相对优势的真菌属在发酵后期其相对丰度逐渐减少，这可能是由于优势真菌属毛孢子菌属（Trichosporon）的代谢分泌物对其起到抑制作用。毛孢子菌属（Trichosporon）常存在于发酵醋[36]、酱香型白酒[37]以及发酵骆驼奶[38]等物质中，在发酵制品风味形成中起着不可或缺的作用。Nie 等[22]在发酵鲈鱼中发现毛孢子菌属（Trichosporon），但不同的是在他们的研究中毛孢子菌属是新鲜样品的优势真菌属，这可能是由发酵剂、发酵环境与样品原料的差异所造成的。
基于分类鉴定结果，对发酵金鲳鱼片的优势菌群进行分析，热图评估样品在每个发酵时间节点的真菌组成。选择相对丰度前30 的物种进行分析，评估发酵过程中微生物的分布和微生物组成的变化趋势，结果见图6。
图6 优势真菌群物种丰富度热图
Fig.6 Heat map of species richness of dominant fungal groups
由图6 可知，不同发酵节点金鲳鱼片的核心真菌不同。FRE 与F0 聚类在一起，表明这两组物种组成相似，真菌种类和含量更高。F10 与F25 两组聚类，且明显区别于FRE，说明发酵过程中的腌制和烘制等操作可以抑制部分真菌的生长，使真菌种类降低。随着发酵时间的延长，发酵体系逐渐建立，动态稳定的环境也逐渐形成，真菌结构差异逐渐减小[39]。毛孢子菌属（Trichosporon）逐渐成为发酵中后期的优势菌属。近平滑假丝酵母菌（Candida parapsilosis）随着发酵时间的延长相对丰度逐渐增加，表明毛孢子菌属与假丝酵母菌属对发酵环境的适应性更强，这也为相应菌种筛选提供了新思路。
细曲霉（Aspergillus gracilis）和帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）都属于曲霉属，两者都随着发酵时间的延长而逐渐减少，这可能是由于优势菌属毛孢子菌属（Trichosporon）代谢物的分泌物抑制了曲霉属的生长；另一方面可能是曲霉属并不适应发酵后期的环境，进而相对丰度逐渐减少。综上，发酵可以促进有益菌群的生长，抑制有害菌群的增加，促进发酵金鲳鱼片风味的形成。
3 结论
本研究得到接种混合乳杆菌短时发酵金鲳鱼片的最佳发酵工艺为NaCl 含量6%、腌制时间1 h、烘制温度55 ℃、烘制时间58 min、菌种添加量8%、发酵温度35 ℃、发酵时间25 h。鱼片基本营养组成为水分59.35%、粗脂肪4.1 g/100 g、粗蛋白11.68 g/100 g、总糖0.74 g/100 g、灰分4.66 g/100 g 和盐分4.72%。接种混合乳杆菌发酵改变了金鲳鱼的质构特性，使其硬度和弹性增加。研究揭示了短时发酵金鲳鱼片在发酵过程中真菌群落演变规律。结合理化指标，在发酵中后期相对丰度逐渐增加的优势菌属毛孢子菌属（Trichosporon）和假丝酵母菌属（Candida）可能是短时发酵金鲳鱼风味形成的核心真菌属。后续的研究将针对金鲳鱼片发酵过程中品质和风味物质等指标进一步分析，解析微生物在金鲳鱼片发酵风味形成的作用。
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