据世界卫生组织最新统计数据显示，截至2020年，肺癌发生率居世界癌症总发生率第二位，在全球癌症患者中占12.5%，但由癌症导致的死亡总人数中肺癌致死人数占首位，2022 年由肺癌导致死亡的人数占总人数的18%[1]。肺癌，可以将其分为两大类，即小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC 约占总数的85%，NSCLC 又分为鳞状细胞癌、腺癌以及大细胞癌3 种，腺癌是其中最常见的表型[2-5]。绝大多数的NSCLC 通常伴随有表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）表达异常，导致平常治疗手段（如化疗）的治疗效果大打折扣，晚期患者总生存期低于两年[3]。截至目前，针对肺癌治疗并没有较为有效的治疗手段，市面上主流治疗手段仍以手术和化疗为主，靶向治疗手段为辅。手术可治疗早期肿瘤，对于中晚期肿瘤的治疗则以化疗为主，但化疗针对范围并不明确，且易对正常细胞造成损伤。因此，找寻新的治疗方式和方法就显得极为重要，这也是目前研究人员需投入大量精力去进行研究的内容。
近年来，精准靶向治疗药物的研究开发成为研究重点，靶向治疗手段发展迅速，多种靶向药先后面世，并应用于各种癌症治疗，这些治疗手段的介入大大提高了癌症患者的生存率并延长了患者的生存时间。截至目前，针对EGFR 表达异常导致的NSCLC 的主要治疗手段有两类：一种为单克隆抗体，主要作用于胞外，单克隆抗体治疗前期具有较好的治疗效果，但随着治疗时间变长，治疗效果减弱，进而引起耐药性的产生，导致药物治疗无效；另一类为酪氨酸激酶抑制剂，主要作用于胞内。在第一代酪氨酸抑制剂研发成功并投入使用后，因其优异的治疗效果而受到广大患者的青睐，它对由EGFR 单突变（19del 和L858R）引起的肺癌治疗效果显著，但当治疗9～13 个月后，EGFR 易产生二次突变，即T790M 突变，导致一代酪氨酸激酶抑制剂治疗效果大大降低，在此基础上研究人员针对二次突变开发出了对应的第二代酪氨酸激酶抑制剂，新一代酪氨酸激酶抑制剂可以有效解决因二次突变造成一代酪氨酸激酶抑制剂治疗乏力的局面，然而，二代酪氨酸激酶抑制剂长期治疗后EGFR 又会产生再次突变，造成与一代相同的局面，因此研究人员只能再次寻找新一代抑制剂[6-8]。柠檬醛，作为柠檬草精油中的主要成分，亦在多种植物精油中存在。作为一种天然存在的化合物，因具有特殊的柠檬香味，已被广泛应用于食品、化妆品等行业[9]。柠檬醛是由两种同分异构体组成的混合物，分别为顺式柠檬醛（香叶醛）和反式柠檬醛（橙花醛），其结构如图1 所示[10-11]。
图1 柠檬醛结构
Fig.1 Citral structure
A.香叶醛；B.橙花醛。
柠檬醛具有较好的抗菌、抗炎以及较强的抗癌潜力[12-14]。有研究发现，柠檬醛可以抑制癌细胞增殖并诱导癌细胞凋亡，其独特的抗癌活性体现在以下3 个方面[15]：一是通过诱导活性氧的积累，进而造成DNA的损伤，从而导致细胞死亡[16]；二是通过抑制微管亲和调节激酶4（microtubule affinity regulates kinases，MARK4）酶活性，进而抑制细胞增殖[17]；三是抑制醛脱氢酶亚型ALDH1A 酶活性[18]。作为治疗靶点之一的EGFR，在多种肿瘤治疗中扮演着重要角色，尤其是肺癌。但目前未有研究显示柠檬醛与EGFR 信号通路是否有关系，即柠檬醛是否对EGFR 信号通路传导具有抑制作用，进而达到抑制细胞增殖的效果。若能证明柠檬醛通过EGFR 信号通路抑制细胞增殖，EGFR 信号通路将成为柠檬醛表达其抗癌潜力的一个新方向，同时也将为EGFR 突变的NSCLC 患者治疗提供新的治疗药物。
本研究旨在阐明天然产物小分子柠檬醛通过EGFR 信号通路抑制EGFR 信号异常表达细胞系增殖，证明柠檬醛在EGFR 异常表达肺癌上的治疗潜力，为肺癌治疗药物的开发提供理论依据和新的治疗途径，也为天然食品产物的研究与开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
柠檬醛：上海源叶生物科技有限公司；人肺腺癌细胞：中国科学院昆明细胞库；RPMI-1640 基础培养基、青霉素/链霉素溶液（penicillin streptomycin，P/S）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-胰蛋白酶（0.25%）：大连美仑生物技术有限公司；特级胎牛血清：上海逍鹏生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、高效细胞裂解液：北京索莱宝生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒：碧迪生物科技有限公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒：碧云天生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜：美国milliopore 公司。
1.2 仪器与设备
曝光机（Proteinsimple JS780）：美国Bio-techne 公司；细胞培养孵育箱（09-11871）：宾德环境试验设备（上海）有限公司；电泳仪（DYY-6D）：北京市六一仪器厂；低速离心机（KDC-1044）：安徽中科中佳科学仪器公司；多功能酶标仪（SC-3616）：美谷分子仪器（上海）有限公司；显微镜（CX21）：德国莱卡公司；生物安全柜（BSC-1600IIIA2）：苏州安泰空气技术有限公司；高压蒸汽灭菌锅（SNAYO 020883）：日本三洋公司；电泳槽（1658004）：美国伯乐公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9240A）：上海一恒科学仪器有限公司；纯水机（FST-III-80）：普力菲尔纯净水有限公司；流式细胞仪（BD FACSJazz）：美国碧迪医疗公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
NCI-H1975 细胞需用RMPI-1640 基础培养基、10% 特级胎牛血清、1% 青/链霉素双抗配成的完全培养基，在含5% CO2 的37 ℃孵育箱中培养。当皿内细胞覆盖率达到70%～80%时进行传代培养或进行接板处理。
1.3.2 噻唑蓝法检测细胞活性
在皿内细胞覆盖率达70%～80%时对细胞进行接板，按每孔2 万细胞接96 孔板。接好的96 孔板在孵育箱中进行过夜培养，隔天在显微镜下观察到细胞已贴壁且细胞密度在70% 以上，然后进行细胞加药处理。柠檬醛加药浓度梯度为50、100、200、300、400、800 µmol/L。待药物处理24 h 后，每孔加入20 µL 5 mg/mL 的噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液，37 ℃培养箱避光孵育4 h，吸除原培养基，每孔加入150µL 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解底部紫色沉淀，待紫色沉淀溶解后利用多功能酶标仪在波长492 nm 处检测吸光度。
1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡
在细胞覆盖率在70%～80% 时进行接板处理，按每孔40 万细胞接6 孔板，接好的6 孔板在孵育箱中进行过夜培养。次日显微镜下观察到细胞贴壁后进行后续加药处理，柠檬醛加药浓度分别为300、600µmol/L，药物处理时间24 h。然后按照凋亡试剂盒操作说明书进行后续操作。染色完成后利用流式细胞仪检测。
1.3.4 分子对接
从PubChem 化合物数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得柠檬醛的分子结构并通过Chem-Draw 17.0 绘制柠檬醛的3D 结构[19]。从PDB（http：//www.rcsb.org/）下载EGFR（PDB ID：3NJP）的三维结构。首先对蛋白和配体文件进行准备，将所有蛋白质和配体分子文件都转换为PDBQT 格式，去除所有水分子，并添加极性氢原子。分子对接研究由Aut-odock Vina 1.2.2（http：//autodock.scripps.edu/）进行[20]，Pymol 2.3 用于模型可视化。
1.3.5 蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达
在皿内细胞密度达到70%～80% 时进行细胞接板，每孔40 万细胞接6 孔板，孵育箱过夜处理培养。转天在显微镜下观察到细胞贴壁且细胞密度达到70%以上后进行加药处理，柠檬醛加药浓度为50、100、200、300µmol/L，药物处理10 min 结束时提取蛋白，按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行定量、制样等处理，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE），随后转膜，将蛋白从胶上转移到PVDF 膜上，然后进行铺一抗、过夜、铺二抗、曝光等操作。
1.4 数据处理
利用Graphpad Prism8 进行数据处理以及柱状图的绘制，细胞凋亡数据利用FlowJo V10 进行处理。
2 结果与分析
2.1 柠檬醛对NCI-H1975 细胞增殖活性的影响
柠檬醛对NCI-H1975 细胞增殖活性的影响如图2所示。
图2 柠檬醛对NCI-H1975 细胞存活率的影响
Fig.2 Effect of citral on the survival of NCI-H1975 cells
***表示差异高度显著，P＜0.001。
如图2 所示，与对照组（0 µmol/L 柠檬醛）相比，100、200、400、800µmol/L 柠檬醛处理NCI-H1975 细胞24 h，能够高度显著抑制NCI-H1975 细胞的增殖（P＜0.001），24 h 柠檬醛半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为114.5µmol/L，且呈剂量依赖性抑制NCI-H1975 细胞增殖。结果表明，柠檬醛可特异性抑制NCI-H1975 细胞的增殖。
2.2 柠檬醛对NCI-H1975 细胞凋亡的影响
柠檬醛对NCI-H1975 细胞凋亡的影响见图3。
图3 柠檬醛对NCI-H1975 细胞凋亡的影响
Fig.3 Effect of citral on apoptosis of NCI-H1975 cells
A.0µmol/L 柠檬醛；B.300µmol/L 柠檬醛；C.600µmol/L 柠檬醛。
如图3 所示，与对照组（0 µmol/L 柠檬醛）相比，300、600µmol/L 的柠檬醛作用24 h 之后，柠檬醛能够促进NCI-H1975 细胞凋亡，凋亡率从3.94% 增加到13%。高浓度柠檬醛的处理使得处于早起凋亡和晚期凋亡的细胞占比与对照组相比大大增加，结果表明柠檬醛促进了NCI-H1975 细胞的凋亡。
2.3 柠檬醛与EGFR 蛋白分子模拟对接结果
EGFR 在体内易受配体刺激进而产生异变，分子结构改变产生二聚化，分子作用靶点亦与未发生二聚化之前的位置不同，因此，作用于原靶点的分子靶向药物治疗效果可能会降低甚至失效。为了验证柠檬醛与EGFR 二聚化蛋白是否具有结合靶点，进而确认柠檬醛能否与EGFR 结合。对柠檬醛与EGFR 二聚化蛋白进行了分子对接模拟分析。用Autodock Vina v.1.2.2获得了柠檬醛与EGFR 蛋白的结合姿势和相互作用。分子模拟对接结果如图4 所示。
图4 柠檬醛分子与EGFR 蛋白分子对接结果
Fig.4 Docking of citral with EGFR
由图4 可知，柠檬醛通过牢固的氢键与EGFR 蛋白氨基酸残基相结合，分子结合能达到-18.849 kJ/mol，表明柠檬醛与EGFR 蛋白具有一定的结合能力。
2.4 柠檬醛对EGFR 信号通路的抑制作用
分子模拟对接结果显示柠檬醛与EGFR 蛋白具有结合能力，表明柠檬醛可与EGFR 蛋白作用，干扰EGFR 蛋白表达，进而抑制细胞增殖。基于此，通过Western Blot 进行进一步的探究和验证，Western Blot试验结果如图5A、图5C 所示。检测柠檬醛对EGFR蛋白及其下游细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）蛋白表达的影响，量化分析结果如图5B、图5D 所示。
图5 柠檬醛对EGFR 信号通路的影响
Fig.5 Effect of citral on the EGFR signaling pathway
A、C.柠檬醛对EGFR、ERK 蛋白表达的影响；B、D.柠檬醛对EGFR、ERK 蛋白表达量的影响。ns 表示差异不显著，P＞0.05；*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；***表示差异高度显著，P＜0.001。P-EGFR 表示EGFR 蛋白磷酸化；P-ERK 表示ERK 蛋白磷酸化；Tubulin 为内参蛋白。
如图5A、图5B 所示，与对照组（0µmol/L 柠檬醛）相比，柠檬醛为100、150、200、300µmol/L 时均可显著抑制EGFR 蛋白磷酸化，50µmol/L 的柠檬醛虽然与对照组相比无显著差异，但仍具有一定的抑制效果。以上结果表明，柠檬醛可抑制NCI-H1975 细胞内EGFR蛋白的表达。如图5C、图5D 所示，与对照组相比，柠檬醛为100、150、200、300µmol/L 时可显著抑制MAPK 通路ERK 蛋白磷酸化。这个结果与柠檬醛对EGFR 蛋白磷酸化的抑制结果具有一致性。综上，柠檬醛可通过抑制NCI-H1975 细胞的ERK 蛋白磷酸化进而抑制EGFR 蛋白磷酸化，即柠檬醛可抑制NCI-H1975 细胞内EGFR 信号通路信号传导，从而诱导细胞凋亡，进而达到抑制细胞增殖的效果。
3 讨论与结论
本研究发现柠檬醛对NSCLC 系中NCI-H1975 细胞的增殖具有抑制作用，其IC50 值为114.5µmol/L，同时柠檬醛促进了NCI-H1975 细胞的凋亡。除此之外，本研究发现柠檬醛抑制EGFR 蛋白及其下游MAPK信号通路ERK 蛋白的磷酸化，阻止信号传导，这可能是其发挥独特抗癌活性的重要原因。因本试验为体外研究，未进行体内研究，对于柠檬醛在体内是否具有像体外研究一样的活性还未可知，还需进行后续试验，进行进一步探究。已有研究结果表明表皮生长因子受体（EGFR）可被生长因子激活，进行细胞信号传导，从而控制细胞增殖、分化、生长以及细胞存活，EGFR 在正常细胞的生长进程广泛存在[21]。当EGFR 表达异常时，极易造成细胞增殖异常。在多种恶性肿瘤中发现均存在EGFR 的过度表达和过度激活，造成癌细胞的异常增殖，因此，EGFR 也一直是恶性肿瘤的重要治疗靶点。柠檬醛抑制EGFR 信号通路传导的发现将为因EGFR 异常表达导致的恶性肿瘤患者的治疗提供新的治疗药物，为恶性NSCLC 肿瘤的治疗提供一个新的治疗方向。同时，也可将柠檬醛与其他治疗药物进行联合使用，以增强治疗效果。也可对柠檬醛进行进一步的化学修饰，进而找到具有更高活性的新化合物。本研究的发现也为后续新合成药物的开发提供参考，为新药物的研发提供新思路。
[1] SUNG H, FERLAY J, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians,2021,71(3):209-249.
[2] XIA C F, DONG X S, LI H, et al. Cancer statistics in China and United States, 2022: Profiles, trends, and determinants[J]. Chinese Medical Journal,2022,135(5):584-590.
[3] YONEDA K,IMANISHI N,ICHIKI Y,et al.Treatment of non-small cell lung cancer with EGFR-mutations[J]. Journal of UOEH, 2019,41(2):153-163.
[4] HERBST R S, HEYMACH J V, LIPPMAN S M. Lung cancer[J].New England Journal of Medicine,2008,359(13):1367-1380.
[5] HAN X S, PARKER T L. Lemongrass (Cymbopogon flexuosus) essential oil demonstrated anti-inflammatory effect in pre-inflamed human dermal fibroblasts[J].Biochimie Open,2017,4:107-111.
[6] TAN C S, CHO B C, SOO R A. Next-generation epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in epidermal growth factor receptor-mutant non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2016,93:59-68.
[7] MALAPELLE U,RICCIUTI B,BAGLIVO S,et al.Osimertinib[M]//MARTENS U. Small Molecules in Oncology. Cham: Springer,2018:257-276.
[8] RAJARAM P,CHANDRA P,TICKU S,et al.Epidermal growth factor receptor: Role in human cancer[J]. Indian Journal of Dental Research,2017,28(6):687-694.
[9] TRANG D T,HOANG T K V,NGUYEN T T M,et al.Essential oils of lemongrass (Cymbopogon citratus stapf) induces apoptosis and cell cycle arrest in A549 lung cancer cells[J].BioMed Research International,2020,2020:5924856.
[10] 钟佳,徐小军,陈尚钘,等.柠檬醛衍生物的合成及其活性研究进展[J].广东化工,2015,42(9):109-111.ZHONG Jia, XU Xiaojun, CHEN Shangxing, et al. Study progress of synthesis of citral derivatives and citral bioactivity[J]. Guangdong Chemical Industry,2015,42(9):109-111.
[11] GUPTA P, MOHAMMAD T, DAHIYA R, et al. Evaluation of binding and inhibition mechanism of dietary phytochemicals with sphingosine kinase 1: Towards targeted anticancer therapy[J]. Scientific Reports,2019,9(1):18727.
[12] ADUKWU E C, BOWLES M, EDWARDS-JONES V, et al. Antimicrobial activity, cytotoxicity and chemical analysis of lemongrass essential oil(Cymbopogon flexuosus)and pure citral[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(22):9619-9627.
[13] MARUOKA T, KITANAKA A, KUBOTA Y, et al. Lemongrass essential oil and citral inhibit Src/Stat3 activity and suppress the proliferation/survival of small-cell lung cancer cells,alone or in combination with chemotherapeutic agents[J].International Journal of Oncology,2018,52(5):1738-1748.
[14] KLAUSER A L, HIRSCHFELD M, RITTER A, et al. Anticarcinogenic effects of odorant substances citral, citrathal R and cyclovertal on breast cancer in vitro[J].Breast Cancer,2021,13:659-673.
[15] BAILLY C.Targets and pathways involved in the antitumor activity of citral and its stereo-isomers[J]. European Journal of Pharmacology,2020,871:172945.
[16] SHEIKH B Y,SARKER M M R,KAMARUDIN M N A,et al.Antiproliferative and apoptosis inducing effects of citral via p53 and ROS-induced mitochondrial-mediated apoptosis in human colorectal HCT116 and HT29 cell lines[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy,2017,96:834-846.
[17] NAZ F,KHAN F I,MOHAMMAD T,et al.Investigation of molecular mechanism of recognition between citral and MARK4: A newer therapeutic approach to attenuate cancer cell progression[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 107(Pt B):2580-2589.
[18] JIMÉNEZ R,PEQUERUL R,AMOR A,et al.Inhibitors of aldehyde dehydrogenases of the 1A subfamily as putative anticancer agents:Kinetic characterization and effect on human cancer cells[J].Chemico-Biological Interactions,2019,306:123-130.
[19] WANG Y L,BRYANT S H,CHENG T J,et al.PubChem BioAssay:2017 update[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(D1): D955-D963.
[20] PAGADALA N S, SYED K, TUSZYNSKI J. Software for molecular docking:A review[J].Biophysical Reviews,2017,9(2):91-102.
[21] WU M,ZHANG P H.EGFR-mediated autophagy in tumourigenesis and therapeutic resistance[J].Cancer Letters,2020,469:207-216.