哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性杆状细菌，可耐受的pH 值范围为5.0～9.5，盐度范围2%～3%，在盐度0%的淡水中不生长，能利用单糖或寡糖，在硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）培养形成1～2 mm 以上的黄色菌落[1]，广泛分布于海洋环境和水产品中[2]。哈维氏弧菌是一种人畜共患的机会性病原体，可以感染动物和人类，尤其是感染免疫力低下的个体。感染人类的临床主要表现为导致败血症、脓肿和坏死性伤口感染，引起严重的炎症反应[3]。哈维氏弧菌病的暴发流行给水产品行业造成严重的经济损失[4]。患病的鱼类可能表现出一系列症状，如慢性皮肤溃疡、胃肠炎和深部真皮病变[5]，是全球鱼类、软体动物和甲壳类动物发光弧菌病的主要病因[6]。随着全球变暖，海洋致病菌引起的感染性疾病传播范围加大，通过污染的水环境和水产品影响人类健康[7-8]。
分子生物学方法通过捕捉鉴定目标病原菌的核酸分子快速准确地检测病原。其中核酸扩增技术、微流控芯片、传感技术及核酸适配体等新型分子生物学技术在哈维氏弧菌检测中应用较为广泛。
1 哈维氏弧菌致病性
哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）为1933 年从马萨诸塞州的一只死鱿鱼中分离出的无色杆菌[9]，由于其发光的特性也曾被命名为哈维氏发光杆菌。Baumann 等[10]将其正式归于弧菌科弧菌属，命名为哈维氏弧菌。作为近年来发现的主要水产品致病菌之一，哈维氏弧菌感染水产品多发于春夏季，在常见的大黄鱼（Larimichthys crocea）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、泥蚶（Tegillarca granosa）、对虾（Fenneropenaeus chinensis）等鱼虾类产品中检出率较高，在内陆地区江河入海口上游的淡水鱼中也有检出。Auzureen 等[11]在马来西亚吉兰丹道北潟湖尖吻鲈体内分离出哈维氏弧菌。在欧洲、非洲也常有哈维氏弧菌在水产品中检出的报道[12-13]。我国近二十年哈维氏弧菌的检出报告表明，绝大部分检出于浙江、山东以及华南地区的水产品中。1996 年，山东莱州市和即墨市的发病对虾体内哈维氏弧菌的检出率为58.3%[14]。据统计，近三年来，仅对虾苗种苗感染哈维氏弧菌一项，就给海南造成了巨大直接经济损失[15]。在地中海沿岸，哈维氏弧菌是对人类健康构成重大威胁的主要风险之一，是来源于水产品导致的临床腹泻、败血症、中耳炎等食源性疾病的主要诱因[16]。人类在海洋环境中感染哈维氏弧菌会导致严重的伤口感染。报道的多个感染病例与哈维氏弧菌通过感染人类的开放性伤口有关，造成伤口发炎、感染等症状[17]。一位男性在西澳大利亚海边度假归来后右胫骨前部撕裂处出现了炎症迹象，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）检测为哈维氏弧菌感染[18]。
哈维氏弧菌致病机理多样，主要有外膜蛋白、自身胞外产物分泌等致病因子，其中自身胞外产物分泌包括胞外蛋白酶、溶血素、脂肪酶、铁载体等致病因子，环境因素和毒力因子也会影响哈维氏弧菌的致病性。
2 哈维氏弧菌分子生物学检测方法
2.1 聚合酶链式反应检测方法
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术在哈维氏弧菌核酸鉴定中应用广泛[19-21]。许多基因序列已经被确认是哈维氏弧菌分子生物学检测的特异性靶向序列，包括toxR 基因、vhh、chiA、vhpA、toxR（Vh）、luxR、溶血素hly 基因，鞭毛蛋白flaB 基因和flaC 基因等。吴立婷等[22]分析大黄鱼中哈维氏弧菌的毒力基因，发现toxR 基因携带率高达75.9%，并且四环素类tetA 为主要耐药基因。Zhao 等[23]通过测序筛选微小核糖核酸（microRNA，miRNA）并利用PCR 验证，发现受感染鱼类和健康鱼类之间某些miRNA 的表达水平存在显著差异，这一发现可以为鱼类携带哈维氏弧菌的早期诊断提供参考。王力等[24]利用PCR 检测辽宁地区红鳍东方鲀中携带的哈维氏弧菌发现，无论毒株强弱都与toxS、zot、tcpA、tdh 和tlh 基因的相关度较低，而flaB 和flaC 基因检出率为100%，推测毒力基因与菌株的分离地区相关，辽宁地区水产品携带的哈维氏弧菌毒力基因一般为flaB 和flaC 基因。
多重PCR 既具备PCR 检测的优点，又能实现多个目标靶基因的同时检测，具有通量检测的优势[25-26]。Han 等[27]设计弧菌特异性多重PCR 引物，经过优化多重PCR 反应条件，可以同时检测出溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌的最低核酸浓度分别为0.10、0.03 ng 和0.003 ng。耿伟光等[28]依据扩增子拯救多重PCR的原理，建立了一种能同步检测水产品中鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）5 种常见病原菌的多重PCR 方法，在分离自鱼体的菌株中检测出2 株哈维氏弧菌，检出灵敏度为1.847 pg。多重PCR反应体系中，多个靶基因同时扩增容易互相干扰，交叉影响扩增效率，需要反复摸索多重反应体系，提高多重PCR 对多靶标基因的扩增效率。
实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）方法在灵敏度、检测速度和检出率上均优于常规PCR，成为食源性致病菌检测的金标准。Costa 等[29]以groEL 基因为靶标基因设计特异性引物和探针，采用qPCR 检测水产品中的溶藻弧菌、鳗利斯顿氏菌和哈维氏弧菌，相比于传统PCR 技术，qPCR 可直接定量微生物，灵敏度可以达到48 CFU/mL。郑嘉来等[30]利用荧光定量PCR 法测定哈维氏弧菌16S rRNA 基因拷贝数，发现该基因的多重基因拷贝数与原核生物对生态环境的适应性密切相关，阐述了16S rRNA 基因的种内变异是哈维氏弧菌适应近岸多变生态环境的主要原因之一。
2.2 等温扩增方法
近年来发展迅速的等温扩增技术，无需设置PCR扩增的变性、退火、延伸等不同温度的热循环步骤，更加适合常规实验室的现场快速检测。研究较多的有环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）和重组酶介导的扩增技术（recombinase-aidamplification，RAA）等温扩增技术[31]。RPA 和RAA 主要利用重组酶、单链DNA 结合蛋白以及DNA 聚合酶等多种酶的协同作用，实现核酸等温扩增。RPA 的重组酶来源于T4 噬菌体，RAA 的重组酶来源于细菌或者真菌[32]。相较而言，来源于细菌和真菌的RAA 重组酶相较于RPA 具有更高的活性[33]。Rahman 等[34]通过对39 株哈维氏弧菌toxR 基因序列的分析，设计了6 对LAMP 引物，其中环引物的加入使LAMP 反应时间缩短了一半，可以检测到低至0.6 fg 的哈维氏弧菌重组质粒DNA 标准品。Pang等[35]以哈维氏弧菌toxR 基因为靶标，设计了新型引物探针进行RPA 扩增，实时荧光RPA 的灵敏度可达60 CFU/mL。陈璐萍[36]建立了比较适合基层实验室快速筛查哈维氏弧菌的LAMP 和RAA 方法，其中LAMP检测时间缩短为60 min，RAA 检测时间缩短为20 min。程蝶等[37]以溶血素基因为靶标，先用LAMP特异性扩增哈维氏弧菌，通过横向流动试纸条（lateral flow dipstick，LFD）实现结果的可视化，所建立的LAMP 结合LFD 方法对哈维氏弧菌纯培养物的检测限为2 CFU/反应，对哈维氏弧菌污染大黄鱼样本的检出限为20 CFU/反应，检出限是常规PCR 方法的100 倍。比较常见的等温扩增方法，LAMP 具有显色目视法检测病原菌的优势，RPA 和RAA 扩增温度更接近于常温37 ℃，相比LAMP 的65 ℃扩增温度更适用于现场即时检测。
2.3 基因测序方法
基因测序实现细菌基因组高通量、高分辨目的，但是测序仪价格昂贵、测序周期长、测试成本高等问题限制了其在基层实验室的应用[38]。Pavlinec 等[39]利用高通量测序发现哈维氏弧菌的地中海菌株在血清学上具有异质性，并且同一种鱼类中分离出的3 株哈维氏弧菌在耐药水平、毒力基因均存在差异。Deng 等[40]对哈维氏弧菌进行全基因组测序，同时进行比较基因组学分析，发现β-内酰胺酶基因、毒力相关蛋白D 基因和OmpA 家族蛋白基因通过在不同菌株之间发生转移，传递并增强哈维氏弧菌的毒力和抗生素耐药性。Xue等[41]采用简化基因组测序技术（2b-restriction site-associated DNA，2b-RAD），酶切细菌基因组DNA 后产生等长的33 bp 的核酸标签，这些核酸标签经过富集后用于高通量测序，来研究某造船厂的压载舱沉积物中压载水和沉积物中的细菌多样性，沉积物与压载水中都检出了包含哈维氏弧菌在内的多种病原菌。Chithira等[42]基于16S rRNA 基因测序，研究了对虾样品中包括哈维氏弧菌在内的多样性微生物群落，有助于水产品携带病原微生物的早期检测和病原控制策略的制定。王磊等[43]利用Pacbio 三代高通量测序分析正常和患溃烂病东星斑皮肤菌群结构差异，通过方差分析发现病鱼皮肤中弧菌属的病原菌含量显著升高，通过KRONA 分析注释出哈维氏弧菌、塔式弧菌和不可培养弧菌，并鉴定哈维氏弧菌溶血素基因与已报道的哈维氏弧菌相似度在99.27%～99.76%之间，为主要病原菌之一。徐赫[44]采用比较基因组学技术对哈维氏弧菌紫外突变后不同毒力的菌株进行重测序，结果表明编码cheW、alaS、flaC、mphI、fliD、mateT 等蛋白的基因是哈维氏弧菌的关键毒力（相关）基因，编码fesB、lcfC 和ssfT 的基因是哈维氏弧菌的重要毒力（相关）基因。
2.4 生物芯片技术
生物芯片出现于20 世纪90 年代，是一种新型的、涵盖了医学、生物学、物理学、计算机等多交叉学科的微量分析高新技术。新近发展的微流控芯片和传感器芯片等技术具有可以同时检测多个病原体，具有样品和试剂消耗少、操作简便、分析速度快、重复性好等优点，适用于现场快速诊断多种病原体[45]。Arayamethakorn等[46]利用基于磁珠的9 重阵列芯片测定免疫基因表达，测定了黑虎虾体内哈维氏弧菌的免疫基因转录水平，灵敏度达到103 copies/μL，使用阵列芯片检测到的基因表达模式与传统实时PCR 方法观察到的模式一致，为高通量的基因表达分析提供了有效的替代方法。
微流控芯片是在厘米尺度的芯片上进行样品制备、反应、分离、检测等生化反应的过程。具有样品处理时间短、检测灵敏度高、能耗和成本低等优势，可以实现检测设备便携化。干宁[47]以水产品中常见的致病性弧菌为目标，设计合成一组磁性DNA 编码探针和微流控芯片传感器，实现对多种弧菌的同时信号转换和放大，开发了一次进样同时检测3 种以上弧菌的现场分析方法，可以检测到样品中的35 CFU/mL 致病性弧菌。Zhou 等[48]开发了一种集成实时荧光环介导等温扩增技术的双样品微流控芯片，该系统包括用于LAMP 分析的精确温控系统和同步获取实时荧光信号的荧光采集单元，能够同时检测嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、安圭拉弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和哈维氏弧菌等数十种致病微生物，检测靶标菌基因组DNA 的检出限为1～10-1 pg/μL，检测靶标菌的重组质粒DNA 检出限达到10-4～10-5 pg/μL，实现了高灵敏度的通量检测。Zhong 等[49]设计了一种基于等温扩增的便携式微流控系统，可以同时检测迟缓爱德华氏菌和哈维氏弧菌，检测灵敏度达到每个反应2～2 000 CFU，具有良好的重复性和稳定性。刘士林[50]建立了LAMP 等温扩增微流控芯片系统，适用于哈维氏弧菌多样品、特异性、灵敏度和重复性的检测，灵敏度达到50 CFU/mL，且同一芯片内的反应孔之间以及不同反应孔之间重复性较好。
2.5 传感检测技术
生物传感器将目标物的浓度转换为电信号进行放大检测，由固定化的敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、细胞、组织、核酸等生物活性物质）、信号转换器、信号传输装置、信号处理装置构成，对目标物质具有高度选择性。传感检测技术具有便携快速、操作步骤简单等优点，满足现场即时检测需求。陈全胜等[51]发明了一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器，该传感器引入食源性致病菌识别分子作为传感器的捕捉元件，在纳米粒子中嵌入4-巯基苯甲酸，交联适配体后构成信号元件识别靶标菌，不仅产生颜色变化，也可产生拉曼信号，实现双信号快速检测。Nagata 等[52]构建了一种高选择性、高灵敏度检测环境中生物可利用甲基汞的重组全细菌传感器，该生物传感器携带来自哈维氏弧菌的荧光素酶基因luxAB 作为报告基因，受控于哈维氏弧菌分子操纵子的汞诱导调控部分，并且对甲基汞具有特异性响应，在优化条件下对于甲基汞的最低检测浓度为10 pmol/L。
2.6 核酸适配体技术
指数富集配基的系统进化（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）技术是一种生物文库筛选技术，多轮体外筛选之后获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。使用SELEX 技术可筛选体外高特异性的核酸适配体，SELEX 筛选步骤如图1 所示，最终获得与靶目标有较高亲和力的文库，即核酸适配体文库[53]。
图1 利用SELEX 筛选食源性致病菌适配体的示意图
Fig.1 Schematic representation of aptamer screening for foodborne pathogens using SELEX
核酸适配体是“人工抗体”，可以识别具有高特异性亲和力的靶标，开发灵敏的生物传感器，通过信号放大检测病原体。由于其体积小和对靶标的特异性识别，核酸适配体是细胞生物标志物鉴定和发病机制研究的强大分子工具[54]。制备传统免疫抗体的时间需要3～8 个月，而筛选核酸适配体只需要6～30 个SELEX循环，3～8 周即可完成，而且可避免抗体存在的成本高、易失活、保存条件苛刻、批次间的抗体质量存在差异等问题。余庆等[55]以哈维氏弧菌为靶标，运用SELEX 技术筛选获得可以高亲和性识别哈维氏弧菌活菌的两条ssDNA 核酸适配体H10 和H13，对哈维氏弧菌具有较好的特异性结合能力，对细胞无毒副作用。利用核酸适配体H10 和H13 与传感技术结合，构建成本低、灵敏度高的哈维氏弧菌快速检测核酸适配体传感器，为食源性致病菌检测和防控提供新思路。刘慧敏等[56]以哈维氏弧菌和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）为靶标，筛选发现核酸适配体C14 和C22 对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好的亲和性和特异性，C14 和C22 的亲和常数（Kd）显示哈维氏弧菌远大于溶藻弧菌，说明对哈维氏弧菌的亲和力和特异性要显著高于溶藻弧菌。彭英林等[57]采用核酸适配体的单链DNA浓度来表征测得核酸适配体对哈维氏弧菌的亲和力是非目标菌的15.2 倍以上，通过测定核酸适配体与哈维氏弧菌结合后ssDNA 的浓度测得该核酸适配体的亲和常数Kd 为（33.70±7.83）nmol/L，相应的拟合系数为R2=0.960，证明了该适配体有较好的亲和特异性，也说明采用单链DNA 浓度法来测定适配体的亲和力和亲和常数是可行的。
2.7 蛋白质谱检测
质谱技术已经扩展到生物大分子研究领域，成为蛋白质研究的主要工具。Kwankijudomkul 等[58]分析了亚洲鲈鱼（Lates calcarifer）体内分离的哈维氏弧菌蛋白质谱特征，通过液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）分析鉴定的肽序列与未知假设蛋白质序列匹配，发现大肠杆菌系统生产重组HP33 蛋白可作为亚单位疫苗和免疫增强剂的候选靶蛋白。武静等[59]利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）采集哈维氏弧菌蛋白指纹图谱，同时对MALDI-TOF-MS 检测哈维氏弧菌的前处理条件进行优化，通过聚类分析初步探讨质谱对哈维氏弧菌溯源性的价值。首先基于rpoB 基因测序对33 株哈维氏弧菌分离株进行确证，通过培养基的选择、培养时间及样本处理方法对检验前操作程序进行优化。利用MALDI-TOF-MS 对33 株哈维氏弧菌进行聚类分析，发现不同海洋环境和地理位置会影响不同弧菌种和亚种的分布，同一菌的毒力和致病性也会随着地理位置的不同而改变。基于MALDI-TOF-MS 法的聚类分析方法，为哈维氏弧菌病感染病原体的溯源提供理论依据[60]。蛋白质谱具有灵敏、准确、快速等优点，但存在病原微生物数据库不够完善，难以分辨同一种属病原菌等问题，需要不断丰富数据库使其适用于病原微生物的检测。另外质谱检测仪器昂贵，检测成本高，也限制了其应用。
关于哈维氏弧菌分子生物学主要检测方法的性能指标总结如表1 所示。
表1 哈维氏弧菌分子生物学检测方法特点
Table 1 Detection method of Vibrio harveyi
检测方法聚合酶链式反应多重PCR靶位基因toxR检出限4.0×103 CFU/mL检测时间5 h优点仅需要合成一对引物，检测成本低参考文献[20]Hly 10～100 cells/tube 3～4 h 可同时检测多种病原菌，多靶标检测[25]实时荧光定量PCR重组酶介导等温扩增groEL 48 CFU/mL 1 h 实时监测荧光信号，特异性高[29]LuxS 7.55×10-1 copies/μL 20 min RAA 采用的重组酶具有更高的活性，仅需1 对引物和探针，无须热循环步骤，反应时间短恒温扩增，反应时间短，可不依赖大型设备仅需1 对引物和探针，可以实现多重等温反应，无须热循环步骤，反应时间短集成小型化与自动化，高通量检测，检测试剂消耗少，样本需求量少缺点需要电泳进行终点检测，操作繁琐，无法定量多组引物间的配对与竞争性扩增会影响靶标基因扩增效果相对定量检测，需要绘制标准曲线进行定量检测目前没有专门软件设计RAA 引物和探针，容易出现假阳性结果[31]环介导恒温扩增重组酶聚合酶扩增toxR 0.6 fg/μL 40 min [34]toxR 60 CFU/mL 32 min需要4～6 条引物，无法进行多重等温扩增，扩增产物不能用于测序目前没有专门软件设计RPA 引物和探针，RPA 产物电泳前需要纯化[35]微流控芯片基因组DNA 1～10-1 pg/μL 50 CFU/mL 30 min 1 h没有成熟的商品化产品，需要研发芯片，生产成本较高，限制推广应用[48][50]
3 结论与展望
近年来快速发展的核酸可视化技术和CRISPR/Cas 系统为开发致病微生物的快速检测方法提供了新思路，两种技术联用可在常温下快速特异性检测靶标DNA。CRISPR/Cas 系统由gRNA 和Cas 蛋白组成，现已经建立了基于3 种Cas 效应蛋白（Cas9、Cas12、Cas13）的分子诊断体系。Cas9 蛋白是进行基因编辑的CRISPR 工具，常用作基因功能及基因调控机制的研究；CRISPR/Cas12 和CRISPR/Cas13 系统在微生物检测领域应用更广泛。2018 年Doudna 团队发现Cas12a 具有切割ssDNA 的活性，基于Cas12a 和等温扩增系统均可在等温下反应，建立了Cas12a 结合等温扩增反应的DETECTR 检测技术。LAMP 等温扩增常与CRISPR-Cas 系统偶联，但LAMP 与CRISPR-Cas12a系统反应温度相差较大，难以在同一体系进行。RPA是与CRISPR/Cas12a 系统反应温度相近的等温扩增技术，两者联用，利用RPA 扩增靶基因片段，核酸内切酶在crRNA 引导下识别原始间隔区相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列下游靶标DNA，当Cas12a/crRNA 复合体靶向与核酸底物结合，激活非特异性的ssDNA 的反式切割活性，可以特异性识别病原菌的靶基因片段，对病原菌检测有极高的灵敏度。目前未见CRISPR/Cas 系统应用于哈维氏弧菌检测的文献报道，CRISPR/Cas 系统作为一种高效的基因编辑工具，因其精准靶向、灵敏度高以及多重检测等优点，联合等温扩增反应，可以研发易携带且操作简便的新型核酸检测产品及设备，对测试设备设施和检测人员的专业性要求低，实现在基层实验室和生鲜超市及水产品农贸市场针对哈维氏弧菌等病原菌的即时检测。
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