红曲霉（Monascus spp.）作为一种小型丝状腐生真菌，是天然食品着色剂红曲色素（monascus pigments，MPs）[1]、降血脂成分莫纳可林K（moncolin K，MK）[2]和降血压成分γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）[3]的主要生产菌株，在我国乃至东南亚地区的食品药品工业中广泛应用[4]。红曲霉还可以产生丰富的初级代谢产物——酯化酶、糖化酶、淀粉酶等[5]，被广泛用于食品酿造[6]。红曲霉产生初级、次级代谢产物的调控网络复杂，目前的研究对其规律和调控机制仍未完全阐明[7]。利用生物信息学技术探索红曲霉初级、次级代谢产物网络调控相关基因的功能，对于红曲霉的应用具有重要的意义。
VeA（velvet A）蛋白、VelB（velvet like B）蛋白是近年来发现存在于丝状真菌中的全局调控因子[8]，属于天鹅绒（velvet）蛋白家族[9]。在丝状真菌中具有高度保守特性[10]。Velvet 中VeA 蛋白、VelB 蛋白对维持真菌有性发育与无性发育的平衡[11]、调控真菌生长发育[12]和次级代谢[13-14]等具有重要的作用。红曲霉中的VeA蛋白、VelB 蛋白调控机制几乎未见报道。本文从4 株高产红色素的红曲霉全基因组中获得VeA、VelB 基因序列，对其进行生物信息学分析，推测VeA 蛋白、VelB蛋白可能具有维持红曲霉的有性发育、无性发育以及调节次级代谢的相关功能外，还可能具有其它特殊的功能，以期为红曲霉后续深入开发应用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
检索NCBI 的基因组数据库，共获得已知全基因组信息的4 株红曲霉，编号分别为红色红曲霉（M.ruber）M7[15]、紫色红曲霉（M. purpureus）NRRL 1596（JGI序列号：1149898）、红色红曲霉（M. ruber）NRRL 1597（JGI 序列号：1155947）和紫色红曲霉（M. purpureus）YY-1[16]，以其为研究对象进行VeA、VelB 基因序列比对。
1.2 方法
1.2.1 红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白结构域分析
利用ExPASy 网站中的Translate 工具（https：//web.expasy.org/translate/）将4 株红曲霉的VeA、VelB 基因序列翻译为氨基酸（amino acid，AA）序列，并分析其开放阅读框（open reading frame，ORF）。将红曲霉VeA蛋白、VelB 蛋白提交至NCBI 网站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行蛋白序列比对，并使用在线软 件Multiple EM for Motif Elicitati（http//meme-suite.org/tools/meme）对红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的结构域进行分析，识别蛋白序列中的保守结构域。
1.2.2 红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白基本性质及系统发育分析
通过DNAMAN 软件比对红曲霉VeA 蛋白、VelB蛋白氨基酸序列与其它丝状真菌的VeA 蛋白、VelB 蛋白氨基酸序列的同源性和相关性。运用MEGA 7 软件构建红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白系统进化树。利用ExPASy 网站中的ProtParam 工具（https：//web.expasy.org/protparam/）预测VeA 蛋白、VelB 蛋白的理化性质和一级结构，对氨基酸个数、分子量、酸碱性、脂溶性等进行分析。
1.2.3 红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白亲/疏水性分析、信号肽、跨膜区、磷酸化和亚细胞定位预测
将蛋白亲水/疏水性分析提交至预测软件ExPASy-ProtScale 完成（http：//web.expasy.org/protscale/），信号肽的预测通过SignalP 5.0 Server 网站进行（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），利用蛋白质跨膜螺旋的预测软件TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）进行蛋白质跨膜区的预测，蛋白的磷酸化位点使用在线数据软件Netphos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）。采用PSORT II Prediction 软件（https：//psort.hgc.jp/form2.html）对红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白进行亚细胞定位的预测。
1.2.4 红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白二级、三级结构预测
在线提交4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白氨基酸序列至二级结构预测软件secondary structure prediction method（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）完成蛋白质二级结构预测；通过ExPASy 网站中的Swiss-Model 工具（https：//swissmodel.expasy.org/）对蛋白质结果进行同源比对建立蛋白质三级结构模型，根据模型对红曲霉VeA 蛋白和VelB 蛋白的结构进行分析、预测。利用STRING 数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl）对蛋白质间的相互作用进行预测。
2 结果与分析
2.1 红曲霉VeA、VelB 基因分析
利用ExPASy 网站中的Translate 工具将VeA、VelB基因序列翻译为氨基酸序列，得到开放阅读框（open reading frame，ORF）。结果显示，4 株红曲霉VeA 存在1 689～1 692 bp 的开放阅读框，负责翻译562～563 个氨基酸；VelB 存在1 023～1 080 bp 的开放阅读框，负责翻译340～359 个氨基酸。并将红曲霉VeA 蛋白、VelB蛋白氨基酸序列提交至BLAST 进行比对，比对结果显示VeA 蛋白、VelB 蛋白氨基酸序列与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavue）、橘青霉（Penicillium citrinum）等中的VeA 蛋白、VelB 蛋白有一定的同源性。
2.2 红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白结构域分析
4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白结构域分析结果如图1 所示。
图1 4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的结构域与其它丝状真菌VeA 蛋白、VelB 蛋白的功能结构域比较
Fig.1 Comparison on the domains of VeA and VelB between Monascus spp.and other filamentous fungi
图1 结果显示，红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白氨基酸序列与其它丝状真菌中的VeA 蛋白、VelB 蛋白有一定的同源性，4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的功能结构域的种类和数量与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脉胞菌（Neurospora crassa）、橘青霉（Penicillium citrinum）等真菌VeA 蛋白、VelB 蛋白功能结构域一致。由图1（a）可知，红曲霉VeA 蛋白由563 个氨基酸组成，其N 端包含1 个velvet 结构域。由图1（b）可知，VelB 蛋白包含359 个氨基酸（M7、NRRL 1596、NRRL 1597）和340 个氨基酸（YY-1），被100 个左右的氨基酸分为两个不连续的velvet 结构域，较短的velvet结构域位于N 端，较长的velvet 结构域位于C 端。功能结构域比较结果表明，红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的功能可能与构巢曲霉、粗糙脉胞菌、橘青霉等真菌相似。
2.3 红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白序列比对分析
4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白与其它丝状真菌同源比对分析结果如图2 所示。
图2 4 株红曲霉蛋白序列与其它丝状真菌蛋白序列比对
Fig.2 Comparison on protein sequences of four Monascus strains with those of other filamentous fungi
由图2（a）可知，红曲霉VeA 蛋白与其它丝状真菌VeA 蛋白在第20～240 个氨基酸表现出高相似性。4 株红曲霉VeA 蛋白与其它丝状真菌的VeA 蛋白相似度为37.4%～62.5%。红曲霉VeA 蛋白从第26 个氨基酸至第42 个氨基酸为核定位信号（nuclear localization signal，NLS）区域，其C 端（457～486）也包含PEST（proline glutamic acid serine and threonine rich sequence）区域，富含脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）。与构巢曲霉VeA 蛋白的N 端包含1 个NLS 区域和C 端包含1 个PEST 区域的结果一致[13]，其中NLS 区域可与载体蛋白KapA 相互作用，协助VeA 蛋白在细胞质和细胞核之间穿梭[17]，PEST区域负责VeA 蛋白质降解[13]。由此推测红曲霉VeA蛋白与构巢曲霉VeA 蛋白功能类似，具有与载体蛋白KapA 相互作用，在细胞质和细胞核之间穿梭的功能。
由图2（b）可知，4 株红曲霉VelB 蛋白与其它丝状真菌的VelB 蛋白相似度为51.2%～84.1%，VelB 蛋白相似度与VeA 蛋白相比均较高，其中红曲霉YY-1 的VelB 蛋白与其它红曲霉VelB 蛋白有明显差异，说明YY-1 中VelB 蛋白可能具有不同于其它红曲霉的特殊功能。有研究显示，VelB 蛋白既没有细胞核定位信号，也没有细胞核输出信号，其在细胞质与细胞核间转运依赖VeA 蛋白[18]，VelB 蛋白的N 端能与VeA 蛋白的N 端特异性相互作用完成转运，VelB 蛋白与VeA蛋白的氨基酸结合区域在第1 个氨基酸至第281 个氨基酸区段内[8]。由图2（b）可知，红曲霉VelB 蛋白与VeA 蛋白的氨基酸结合区域与其它真菌VelB 蛋白相似性较高，推测红曲霉VelB 蛋白的转运也依赖VeA蛋白，但YY-1 VelB 蛋白的功能可能存在差异。
2.4 4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白系统发育树构建
不同真菌来源VeA 蛋白、VelB 蛋白系统进化树如图3 所示。
图3 4 株红曲霉蛋白序列的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of protein sequences of four Monascus strains
由图3（a）可知，红曲霉VeA 蛋白与曲霉属菌株保持较近的亲缘关系，4 株红曲霉VeA 蛋白与青霉属VeA 蛋白位于同一进化枝，证明其亲缘关系最接近。如图3（b）所示，M7、NRRL 1596、NRRL 1597 3 株红曲霉VelB 蛋白和粒状细丝酵母菌VelB 蛋白位于同一个结节；而另一株YY-1 红曲霉VelB 蛋白与青霉属于同一进化枝，均与曲霉属菌株保持较近的亲缘关系。基于进化分析，说明红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白在进化方面具有较高的保守性，并且其功能及相互作用方式也可能与曲霉属菌株相似，这与红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白结构域分析中的蛋白序列比对分析结果一致。
2.5 4 株红曲霉VeA 蛋白质和VelB 蛋白质一级结构分析
2.5.1 氨基酸序列理化性质分析
VeA 蛋白质和VelB 蛋白质一级结构和理化性质结果如表1 所示。
表1 4 株红曲霉VeA 蛋白及VelB 蛋白理化性质对比
Table 1 Comparison on physicochemical properties of VeA and VelB in four Monascus strains
蛋白VeA分子式VelB菌株M.ruber M7 M.purpureus NRRL 1596 M.ruber NRRL 1597 M.purpureus YY-1 M.ruber M7 M.purpureus NRRL 1596 M.ruber NRRL 1597 M.purpureus YY-1氨基酸数563 563 562 563 359 359 359 340相对分子质量62 634.53 62 604.41 62 393.21 62 546.38 38 757.47 38 758.46 38 767.51 38 296.21 C2770H4292N788O835S20 C2769H4282N784O838S20 C2760H4281N787O833S18 C2767H4280N784O836S20 C1732H2654N466O529S9 C1732H2653N465O530S9 C1734H2656N466O528S9 C1708H2639N473O511S10理论等电点9.35 9.21 9.38 9.26 6.08 5.88 6.08 9.24负电荷残基总数55 56 55 55 31 32 31 37正电荷残基总数71 69 71 69 28 28 28 44不稳定系数73.45 72.99 70.87 72.43 55.22 55.43 55.69 57.10脂肪族氨基酸指数52.74 52.74 53.54 52.74 70.42 70.42 70.42 60.24
由表1 可知，4 株红曲霉VeA 蛋白和VelB 蛋白的氨基酸数分别为562～563 个和340～359 个，相对分子质量分别为62 393.21～62 634.53 Da 和38 296.21～38 767.51 Da；VeA 蛋白的理论等电点（isoelectric point，pI）主要集中在9.21～9.38 之间，pI 大于7，即以碱性蛋白为主；M7、NRRL 1596 和NRRL 1597 3 株红曲霉VelB蛋白的理论等电点主要集中在5.88～6.08 之间，pI 小于7，即以酸性蛋白为主，而YY-1 VelB 蛋白的pI 为9.24，大于7，是碱性蛋白，这与红曲霉蛋白序列比对分析结果一致，YY-1 的VelB 蛋白可能具有不同于其它3 株红曲霉的特殊功能。红曲霉VeA 蛋白的脂肪族氨基酸指数集中于52.74～53.54，小于60，表现为非脂溶性，VelB 蛋白的脂肪族氨基酸指数集中于60.24～70.42，大于60，表现为脂溶性。VeA 蛋白在溶液当中不稳定指数为70.87～73.45，VelB 蛋白为55.22～57.10，该指数越高（阈值为40）蛋白质在溶液当中不稳定性越强，说明VeA 蛋白、VelB 蛋白在溶液中极为不稳定，这可能与VeA 蛋白、VelB 蛋白是全局性调控因子，参与多个细胞过程的调控，并影响100 多个基因的表达有关[19]。
2.5.2 蛋白质可溶性和亲/疏水性分析
运用ProtScale 对VeA 蛋白和VelB 蛋白亲水性进行分析，结果如图4 所示。
图4 4 株红曲霉亲/疏水性分析
Fig.4 Hydrophilic/hydrophobic properties of VeA and VelB in four Monascus strains
由图4 可知，4 株红曲霉VeA 蛋白的平均亲水系数（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.823～-0.801，VelB 蛋白的GRAVY 为-0.637～-0.368，均小于0，说明VeA 蛋白、VelB 蛋白均为可溶性蛋白。正值表示疏水性，数值越大疏水性越强；负值表示亲水性，数值越低亲水性越强，红曲霉VeA 蛋白和VelB 蛋白的疏水区域少于亲水区域。4 株红曲霉VeA 蛋白在第122 位甘氨酸（Gly）疏水性最高，GRAVY 为1.856，第252 位酪氨酸（Tyr）亲水性最低，GRAVY 为-3.122；3 株红曲霉M7、NRRL 1596、NRRL 1597 VelB 蛋白在第298 位赖氨酸（Lys）疏水性最高，GRAVY 为1.711，第354 位谷氨酸（Glu）亲水性最低，GRAVY 为-2.322，而红曲霉YY-1 在第119 位甘氨酸（Gly）疏水性最高，GRAVY 为1.767，第39 位赖氨酸（Lys）亲水性最低，GRAVY 为-2.844。红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的多肽链呈亲水性氨基酸明显大于疏水性氨基酸，以上分析结果表明VeA 蛋白、VelB 蛋白为亲水蛋白。
2.5.3 蛋白质信号肽和跨膜区的预测
4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白信号肽预测和跨膜区预测结果如图5 所示。
图5 4 株红曲霉信号肽和跨膜区预测
Fig.5 Predicted signal peptides and transmembrane regions of VeA and VelB in four Monascus strains
由图5（a）、（b）可知，红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白信号肽差异均小于0.002，说明其没有明显的信号肽位点。由图5（c）、（d）所示，红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白之间的差异较小，没有跨膜结构域，这说明红曲霉VeA蛋白、VelB 蛋白不属于跨膜蛋白，这与文献报道的VeA 蛋白、VelB 蛋白需要结合成二聚体才具有跨膜转运功能相符[20]。
2.5.4 蛋白质翻译后磷酸化修饰的预测和分析
利用NetPhos 3.1 在线软件分析4 株红曲霉VeA蛋白、VelB 蛋白的磷酸化位点，结果如表2 所示。
表2 4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的磷酸化位点预测
Table 2 Predicted phosphorylation sites of VeA and VelB in four Monascus strains
VeA VelB磷酸化位点丝氨酸苏氨酸酪氨酸M.ruber M7 48 23 16 M.purpureus NRRL 1596 48 23 16 M.ruber NRRL 1597 46 21 16 M.purpureus YY-1 47 23 16 M.ruber M7 24 11 10 M.purpureus NRRL 1596 24 11 10 M.ruber NRRL 1597 25 11 10 M.purpureus YY-1 22 16 5
由表2 可知，4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白在多个氨基酸位点存在不同程度的磷酸化，在不同位置的磷酸化水平也不同。其中VeA 蛋白、VelB 蛋白的丝氨酸（Ser）发生磷酸化程度相对最高，苏氨酸（Thr）次之，酪氨酸（Tyr）磷酸化水平相对最低。这些位点的存在说明蛋白翻译后修饰对4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB蛋白功能的完成或改变起到重要作用，VeA 蛋白、VelB蛋白均能够被激酶磷酸化，从而实现对真菌发育和次生代谢的调控。
2.6 红曲霉VeA 蛋白和VelB 蛋白二级结构及亚细胞定位分析
4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白二级结构预测结果见图6 所示。
图6 4 株红曲霉蛋白序列二级结构预测
Fig.6 Predicted secondary structures of VeA and VelB in four Monascus strains
由图6 所示，VeA 蛋白结构主要包括β-折叠（13.52%～14.92%）和无规则卷曲（72.65%～74.02%）。VelB 蛋白结构主要包括α-螺旋（12.06%～15.32%）、β-折叠（15.88%～18.24%）和无规则卷曲（63.23%～66.30%）。α-螺旋和β-折叠在维持蛋白质分子空间结构的相对稳定起着重要的作用，而无规则卷曲主要行使连接其他几种二级结构元件的作用。因此说明VeA 蛋白、VelB蛋白均为不稳定蛋白，这与之前的结果相符合。二级结构的预测在蛋白质的研究中起着重要的作用，当序列同源性较低时，二级结构的预测有助于对蛋白之间结构与功能的关系分析，基于蛋白质二级结构统计分析的规律，有利于对全新蛋白质进行设计[21-22]。
通过PSORT II Prediction 软件对4 株红曲霉亚细胞定位预测可知，VeA 蛋白主要分布于细胞核中，细胞质和线粒体分布较少，与文献报道相符[23]。VelB 蛋白主要分布于细胞核和细胞质中，在线粒体和细胞骨架分布较少，与文献报道相符[24]。除此之外，YY-1 菌株VelB 蛋白还有部分分布在质膜和高尔基体中。
2.7 红曲霉VeA 蛋白质和VelB 蛋白质三级结构同源建模
4 株红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白三级结构预测建模结果如图7 所示。
图7 4 株红曲霉三级结构同源建模
Fig.7 Homology modeling of tertiary structures of VeA and VelB in four Monascus strains
由图7 所示，VeA 蛋白一致性为37.93%～38.86%，GMQE 评分为0.19～0.23，QMEAN 为0.54±0.06～0.61±0.06，分辨率为1.79 Å～2.20 Å；VelB 蛋白三级结构一致 性 为65.70%～80.00%，GMQE 评 分 为0.46～0.52，QMEAN 为0.65±0.05～0.85±0.05，分 辨 率 为1.79 Å～2.20 Å。任何一对蛋白质，如果两者的序列同源性超过30%，则可认为它们具有相似的三维结构，即两个蛋白质的基本折叠相同，仅在非螺旋和非折叠区域的一些细节部分有所不同[25]；如果两个蛋白质的氨基酸序列同源性超过50%，即约有90%的α 碳原子的位置偏差不超过3 Å，说明蛋白三维结构预测效果更好[26]。GMQE 评分越接近1 表示预测模型质量越好；QMEAN评分接近0 表示评估待测蛋白与模板蛋白的匹配度越好[27]。结果表明VeA 蛋白、VelB 蛋白的建模预测较准确，三级结构分析进一步说明4 株红曲霉的VeA 蛋白、VelB 蛋白与其它真菌VeA 蛋白、VelB 蛋白结构具有相似性。
2.8 红曲霉VeA 蛋白和VelB 蛋白的相互作用网络分析
为了探寻网络内的mRNA 之间是否具有相互作用的关系，通过在线软件（string PPI）对VeA 蛋白和VelB 蛋白间的相互作用进行网络构建，进一步从该网络中筛选核心网络，结果如图8。
图8 蛋白质的相互作用网络
Fig.8 Protein-protein interaction network
由图8 显示，蛋白质间相互作用主要以VeA 蛋白为中心构建互作网络，VeA 蛋白与VelB 蛋白存在直接互作，形成VeA-VelB 异二聚体，进而调控菌体有性生殖以及次生代谢产物的合成[28]；除此之外，VeA 蛋白还能做为中间蛋白与全局性调控因子LaeA 蛋白和VelB蛋白进行复合互作，形成异三聚体丝绒复合物VelBVeA-LaeA，研究发现其连接光响应发育调节，能够正向调控大量次级代谢物的生物合成，影响真菌的形态分化和发育过程[18]。
3 结论
对4 株红曲霉中VeA、VelB 基因编码的蛋白进行生物信息学分析，结果表明VeA 蛋白含有1 个velvet结构域，与典型丝状真菌VeA 蛋白相似度在37.4%～62.5%；VelB 蛋白含有2 个velvet 结构域，与典型丝状真菌VelB 蛋白相似度在51.2%～84.1%。通过结合系统发育树进一步分析，红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白与粒状细丝酵母菌（Elaphomyces granulatu）VeA 蛋白、VelB 蛋白位于同一个分枝，具有相似的结构。红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白均为亲水蛋白，没有跨膜结构域和信号肽；VeA 蛋白、VelB 蛋白的丝氨酸（Ser）磷酸化程度较高。红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白主要由无规则卷曲结构组成，分布于细胞核和细胞质中。蛋白相互作用网络结果表明，VelB 蛋白与VeA 蛋白可能存在相互作用，形成VelB-VeA 异源二聚体。大量研究结果表明VeA 蛋白、VelB 蛋白在真菌中具有保守性，参与调控真菌的生长发育及次级代谢等，本文首次对红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白的保守结构域、同源性及各级结构预测等进行生物信息学分析，并结合文献研究，发现红曲霉VeA 蛋白、VelB 蛋白不仅具有其它真菌VeA蛋白、VelB 蛋白的保守功能，可能还具有其特殊的功能。
上述研究在一定程度上可以完善velvet 家族蛋白的研究，为目前尚未明确的红曲霉次级代谢生物合成途径的调控机理提供一定的理论基础，对高产色素红曲霉在各个产业中的应用具有重要意义。
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