米香型白酒是中国四大基本香型白酒之一，酿造历史悠久。它以大米为原料，米酒曲为糖化发酵剂，采用半固态糖化、发酵、液态釜式蒸馏而成[1]，具有“蜜香清雅、入口柔绵、落口甘冽、回味怡畅”的风格特点[2]。白酒中的醇类与其他醛类、酸类、酯类、酮类等香味特征物质共同构成酒体的风味组分，其比例关系对酒体风味和品质有重要贡献[3]。
高级醇俗称杂醇油，指3 个及3 个以上碳原子的一元醇类物质，是白酒酿造过程中酵母正常代谢的副产物[4-5]。高级醇是白酒风味的关键成分，对于白酒的丰厚口感和香气起着重要作用，同时也是酸类和酯类转化的重要媒介[6]。适度使用高级醇可以赋予白酒浓郁的香气和口感，并提升酒体的平衡度，但是过多的高级醇不仅会破坏酒体风格，还会引起饮后“上头”、神经毒性作用等不适反应[7]。米香型白酒的香味组分相对较少，高级醇含量相对较高，其中正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和β-苯乙醇5 种一元醇类占米香型白酒中高级醇总量的80%以上。此外，高级醇还会引起白酒感官品质降低，且存在后味苦、涩等问题[8]。高级醇溶于乙醇而不溶于水，在酒度降低时酒体呈油状，是导致降度白酒浑浊的原因之一。为研究白酒中高级醇的形成途径，提升白酒品质，建立一种准确快速分离鉴定高级醇的方法非常重要。
目前，测定高级醇含量的方法有光谱分析法[9]、比色法[10]、气相色谱法[11]等。相比传统的填充柱气相色谱法，毛细管柱气相色谱法在分析高级醇方面具有出色的渗透性能、快速的分析速度、低进样量以及高效分离的效果，能够有效对大多数高级醇进行准确的定性和定量分析[12]。异戊醇和活性戊醇为同分异构体，一般的色谱条件难以将其分离[13]。本研究基于毛细管柱气相色谱探究一种检测高级醇的方法，将各种高级醇（包括异戊醇和活性戊醇）进行分离定量，并将其用于分析不同酒曲对米香型白酒高级醇含量的影响，以期探索酒曲对米香型白酒品质的影响，为米香型白酒酿造技术提升提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大米：市售；金黄田酒曲（JM）：河源金黄田酒业有限公司；老八尺酒曲（LM）：梅州市平远县老八尺酒厂；长乐烧米粉曲（CM）、长乐烧麸皮曲（CFM）：广东长乐烧酒业股份有限公司；八珍娘酒曲（BM）：梅州市八珍娘酒业有限公司；鹰金钱酒曲（YM）：广州鹰金钱企业集团公司；产酯小曲（CZM）：广州鹰金钱三花酒业有限公司；白酒曲（BJM）、酿酒曲（NJM）：安琪酵母股份有限公司。
乙酸正戊酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇、无水乙醇（均为色谱纯，纯度＞98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
LGH-300T 高纯氢发生器：上海安谱实验科技股份有限公司；SPB-3S 空气发生器：北京中惠普分析技术研究所；YP5002 电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Agilent-7860N 气相色谱仪、DB-624 UI 毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm×1.8 μm）、氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）：美国安捷伦公司；HHB11-BS 恒温培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；DHG-9070 电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；LS-50HD 立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品的制备
本试验中米香型白酒的生产工艺设计如图1 所示。
图1 米香型白酒的酿造流程图
Fig.1 Brewing process of rice-flavor Baijiu
称取250 g 大米若干份，清洗、浸泡24 h（米粒用手可捏粉碎），沥干水分，用蒸锅蒸煮、摊凉。拌入适量的酒曲，拌匀后装到1 L 发酵罐中，搭窝，于32 ℃条件下糖化24 h。加入300 mL 纯净水，搅拌均匀，于28 ℃条件下发酵15 d。
米香型白酒发酵工艺要点参考文献[14-16]的方法并稍作修改。
1）淘洗浸泡：用清水清洗大米后，用洁净纱布封住玻璃罐口，浸泡1 d。
2）浇淋蒸饭：用立式压力蒸汽灭菌锅将浸泡后的大米煮熟后，将蒸熟的米饭搅拌翻面避免米饭黏腻，并用温水润湿米饭，继续加热煮熟，重复上述操作3 次，将米饭彻底蒸熟。
3）摊凉：将蒸熟的米饭用饭勺铺开，放在干净的桌面上摊凉，待米饭凉至室温后，称取250 g 的米饭。注意不要在通风处摊凉，以免有杂质落入米饭中。
4）拌曲：称量适量的酒曲，倒入米饭中，用洁净的铁勺搅拌均匀，尽可能让酒曲均匀分布在米饭中。
5）装罐：提前准备若干个1 L 的洁净广口瓶，用开水烫3 次后，放在电热鼓风干燥箱中烘干。将每份拌好酒曲的米饭分别装到广口瓶中，用灭菌后的铁勺在米饭中间留一个口，用纱布封住瓶口。
6）糖化：将广口瓶放入32 ℃恒温培养箱中，固态糖化24 h。
7）加水：待糖化完成后，在广口瓶中加入300 mL无菌水，用灭菌后的铁勺将米饭搅拌均匀，保证米饭全部浸泡在水中，以便进入半固态发酵阶段。
8）发酵：将加好水的广口瓶用洁净纱布封好瓶口，然后放入28 ℃恒温培养箱中恒养。当发酵结束时，用灭菌后的铁勺取出酒醪，装入提前灭菌好的离心管，-80 ℃储存备用。
9）蒸馏酒样：安装蒸馏装置后，取100 mL 酒样和100 mL 无菌水，加入装有沸石的蒸馏瓶中，加热蒸馏出100 mL 蒸馏液，静置待测。
1.3.2 样品预处理
采用直接加热蒸馏法[17]进行，分别加入100 mL 发酵液和去离子水于500 mL 圆底烧瓶中，常压蒸馏，接收蒸馏液100 mL。取10 mL 蒸馏液于10 mL 容量瓶中，加入100 μL 2% 的乙酸正戊酯。充分混匀后进行气相色谱分析。
1.3.3 标准溶液的配制
分别准确称取正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和β-苯乙醇的标准品各200 μL 置于10 mL 容量瓶中，用60% 的乙醇溶液定容，得到高级醇标准储备液；另配制体积分数为2% 的乙酸正戊酯溶液作为内标溶液。准确吸取标准储备溶液25、50、100、200、400 μL，置于10 mL 容量瓶中，分别加入内标溶液100 μL，用60% 乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，制备成体积分数为0.005%、0.010%、0.020%、0.040%、0.080% 的混合标准溶液。
1.3.4 气相色谱条件
色谱柱：DB-624 UI 毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm×1.8 μm）；进样量1 μL；载气为高纯氮气（N2），流速20 mL/min；分流比37∶1；氢气流速40 mL/min；空气流速400 mL/min；升温程序：30 ℃保持6 min；以2 ℃/min 的升温速率升温至40 ℃，保留2 min；以5 ℃/min 的升温速率升温至100 ℃，保留10 min；以10 ℃/min 的升温速率升温至200 ℃，保留10 min。
1.3.5 回收率试验
在相同的3 份10 mL 酒样中分别加入10、20、100 μL 3 个梯度的高级醇标准储备液后，分别加入内标溶液100 μL，充分混匀后进行气相色谱分析。另取10 mL 酒样不添加高级醇标准储备液，加入内标溶液100 μL，样品充分混匀后进样分析，并根据如下公式计算加标回收率（P，%）。
式中：C1 为试样浓度，mg/L；C2 为加标试样浓度，mg/L；C3 为加标量，mg/L。
1.4 数据处理
所有试验均进行不少于3 次，结果以平均值±标准偏差表示。利用IBM SPSS Statistics 27 进行单因素方差检验（analysis of variance，ANOVA），采用Duncan 法进行显著性分析；采用Origin 2021 软件作图；SIMCA 14.1 软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、最小偏二乘判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA），计算预测变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
分别以正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和β-苯乙醇的质量浓度（mg/L）与内标乙酸正戊酯的比值（含量比）为横坐标，以各物质相对应的积分峰面积与内标乙酸正戊酯的积分峰面积（响应比）为纵坐标绘制标准曲线，计算含量比与相应比的线性回归方程和相关系数，以某一物质3 倍的浓度与信噪比的比值计算检出限，结果见表1。
表1 高级醇的线性回归方程、相关系数、检出限
Table 1 Regression equations，correlation coefficients，and limits of detection of higher alcohols
高级醇正丙醇异丁醇异戊醇活性戊醇β-苯乙醇回归方程y=0.918 2x+0.041 3 y=1.169 1x+0.058 6 y=0.913 7x+0.041 4 y=1.37 3x+0.074 5 y=1.177 6x+0.075 2相关系数R2 0.999 5 0.999 4 0.999 4 0.999 4 0.999 4线性范围/（mg/L）39.92～638.72 39.95～639.19 40.37～645.91 40.18～642.88 57.66～922.56检出限/（mg/L）6.19 4.50 5.61 3.80 3.21
由表1 可知，正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和β-苯乙醇5 种高级醇检出限为3.21～6.19 mg/L，且相关系数R2≥0.999 4，呈现良好的线性关系。
2.2 精密度的测定
为检验该方法的精密度，对同一样品在相同的条件下进行重复测定，平行进样6 次，求得该方法的标准偏差（standard deviation，SD）和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。
表2 精密度试验（n=6）
Table 2 Precision of the established method（n=6）
高级醇正丙醇异丁醇异戊醇活性戊醇β-苯乙醇测定值平均值/（mg/L）192.68 193.15 192.01 191.64 136.35标准偏差/（mg/L）0.43 0.44 0.57 0.63 0.33 RSD/%0.22 0.23 0.30 0.33 0.24
由表2 可知，检测5 种高级醇的标准偏差为0.33～0.63 mg/L，RSD 为0.22%～0.33%，表明本试验所建立的方法能够满足检测实际样品需要的灵敏度、精密度和准确度，能够满足米香型白酒中高级醇的定量分析。
2.3 回收率的测定
分别取一定量的3 份酒样于容量瓶中用纯水定容至刻度线，在相同条件下进行加标回收试验，回收率试验的结果见表3。
表3 回收率试验（n=3）
Table 3 Recovery of higher alcohols（n=3）
高级醇正丙醇异丁醇异戊醇活性戊醇β-苯乙醇加标量/（mg/L）15.97 31.94 159.68 15.98 31.96 159.80 16.15 32.30 161.48 16.07 32.14 160.72 23.06 46.13 230.64实测值/（mg/L）16.97 32.25 166.25 16.79 32.92 164.28 17.20 32.16 165.81 16.68 33.85 162.49 22.39 44.58 226.69平均回收率/%104.17 100.99 104.12 105.05 103.01 102.81 104.46 99.59 102.68 103.78 105.31 101.11 97.09 96.65 98.29 RSD/%2.69 4.48 1.24 4.07 5.01 2.52 1.76 3.89 0.82 2.66 1.78 1.40 4.45 3.49 0.87
由表3 可知，5 种高级醇3 个水平的平均回收率为96.65%～105.31%，RSD＜10%，结果表明该方法回收率高，可定量分析白酒中的高级醇含量。
2.4 高级醇含量的分析
将所测酒样1.3.2 进行样品预处理，采用建立的方法进行高级醇含量分析，结果见图2。
图2 9 种酒醪的高级醇含量
Fig.2 Content of higher alcohols in nine kinds of fermentation mashes
由图2 可知，不同酒曲酿造米香型白酒中高级醇的含量及比例存在显著性差异（P＜0.05）。米香型白酒中主要的高级醇为异戊醇和异丁醇，且明显高于其他高级醇（P＜0.05）。在这两种主要的高级醇中，含量最高的为异戊醇，在不同酒曲发酵的米香型白酒中占高级醇含量比值32%～40%；其次异丁醇占比为27%～41%。这一结果与何菲等[18]和Wang 等[19]的研究结果相似。在高级醇总量上，JM 发酵酿造的米香型白酒中总高级醇的含量远高于其他品种。本研究表明，米香型白酒中的异戊醇含量很高，而异戊醇和活性戊醇为同分异构体，在测定米香型白酒中高级醇含量时，采用传统的气相色谱法难以将两者分离，本试验条件可以有效分离异戊醇和活性戊醇。
为了深入研究酒曲对米香型白酒酿造产高级醇的差异，将得到的数据在SIMCA 14.1 中进行多元分析，结果见图3。
图3 不同酒曲酿造米香型白酒的多变量分析
Fig.3 Multivariate analysis of rice-flavor Baijiu brewed with different Jiuqu
不同变量间距离越长表明差异越大，距离越短则说明相关性越高[20]。由图3A 可知，9 种米香型白酒被不同程度地区分开，表明不同来源的酒曲发酵，对米香型白酒产生高级醇具有不同作用。由图3B 可知，PC方差贡献率越接近100%，表示PCA 模型的可靠性越强；而由图3C 可知，各PC 的可解释变异为PC1＞PC2＞PC3＞PC4＞PC5，其中PC1 和PC2 的方差贡献率分别为62.6%、22.8%，累计方差贡献率达到85.4%，认为选取PC1、PC2 分析样本具有较好的可靠性。
在上述分析的基础上，进一步利用PLS-DA 分析建立不同酒曲酿造米香型白酒高级醇含量的聚类模型，结果见图4。
图4 不同酒曲酿造米香型白酒的多变量分析
Fig.4 Multivariate analysis of rice-flavor Baijiu brewed with different Jiuqu
由图4A 可知，模型中第一主要成分和第二主要成分之和为0.85，说明该模型对9 种样品有较好的分离效果。各组的样本对应的散点在组内呈现相互聚集的情况，说明组内的重复性比较好，样本数据非常相似，而组间则有较好的区分度。为验证其可靠性，对PLS-DA 模型进行200 次排列试验，得到模型验证图，由图4B 可知，图中Q2 回归线与纵轴的相交点小于0，且R2 与Q2 的左边模拟点y 值均低于最右侧原点，证明该PLS-DA 模型具有良好的预测能力，未出现过拟合现象，模型验证有效[21]。通过VIP 值鉴定分析，不同酒曲酒样主要差异成分如图4C 所示，VIP＞1 表示该物质为重要变量，其在偏最小二乘判别分析模型中影响了不同样品的分离效果，以此为条件筛选确定显著性差异酒曲。相关性强的变量聚合在一起，将酒曲与高级醇含量相关联，9 种酒曲可以分为3 类。第1 类为CM 和YM，YM 距离异丁醇较远，对应的米香型白酒的异丁醇含量最低，活性戊醇和正丙醇相对较小，结合图2F 和图2C 分析可知，β-苯乙醇和异戊醇含量占比较其他组高，与对应米香型白酒中高级醇的总量也低于其他酒曲。LM、BM、CZM、CFM、BJM、NJM 距离较近，其中LM、BM 和CZM 距离最近，各高级醇的含量相差不大，为第2 类。而结合图2D、图2H、图2I 可知，CFM 对应的米香型白酒虽正丙醇的含量最高且β-苯乙醇含量相对较高，但是活性戊醇含量较低，使得高级醇总量与BJM、NJM 相差不大。JM 酿造得到米香型白酒中含有高级醇总量最高，达到701.62 mg/L，为第3 类；JM 和CM 距离相差最远，而CM 所酿米香型白酒的高级醇总量最低，为346.83 mg/L，β-苯乙醇、活性戊醇和异丁醇含量也相对较小。
酒曲微生物利用发酵原料中游离的氨基酸合成自身所需的蛋白质。当氨基酸中的氨基被利用完后，剩余的α-酮酸经过脱羧和还原过程，会生成相应的高级醇[22]。这一过程被称为高级醇的Ehrlich 代谢途径。氨基酸经过转氨作用形成α-酮酸，α-酮酸再被还原形成对应的高级醇[23]，如苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸通过Ehrlich 途径能够分别形成正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇[24-26]。研究表明高级醇的合成与发酵过程中的微生物群落密切相关[27]。酒曲中的微生物通常包含霉菌、细菌和酵母菌[28]，发酵过程中微生物产生各类酶与微生物共同形成了具备糖化力、蛋白质分解力和产酯力的粗酶制剂[29-31]。此外添加的酒曲中酶的类型和含量对高级醇的产生有一定的影响。因此不同酒曲酿造的白酒中高级醇含量的高低，可能与不同酒曲间微生物的菌落结构、所含酶的种类与数量及其活力有关，不同种类酒曲酿造的米香型白酒之间高级醇含量的差异与酒曲的发酵性能有关[32]，针对发酵液中高级醇含量差异，可解析其中的微生物群落组成，为研究发酵过程中高级醇合成代谢的机制提供基础。
3 结论
本研究确定了检测米香型白酒发酵液中高级醇的最佳气相色谱条件，建立了一种可同时检测正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇和β-苯乙醇的毛细管气相色谱法，各高级醇组分的分离效果好，检出限为3.21～6.19 mg/L，精密度和线性关系良好（R2≥0.999 4），加标回收率为96.65%～105.31%。对比分析了9 种酒曲酿制所得发酵液中高级醇含量，通过正交偏最小二乘判别分析，证实JM 和CM 高级醇含量差异最大，为探究米香型白酒发酵微生物中高级醇的形成机制提供参考。
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