橄榄菜是由芥菜、橄榄果及其他辅料加工而成[1]，其营养成分丰富，具有开胃消食的作用，是岭南地区的特色酱菜之一，深受消费者喜爱。橄榄菜加工过程会使用较多的酱油、食盐、白糖和油脂等，随着贮藏时间延长或贮藏条件不当，较易发生系列化学变化，伴随生成一些对人体健康有害的物质。关于酱菜贮藏过程品质的变化和调控，已成为当下食品安全领域关注的热点问题之一。
目前对酱菜品质的研究主要集中在不同发酵剂、添加剂、工艺条件对酱菜品质的影响。例如杨洋等[2]探究6 种发酵剂对泡菜品质的影响，结果显示以主要细菌为植物乳杆菌（61.57%）和食窦魏斯氏菌（14.18%），主要真菌为副银念珠菌（10.14%）和其他（21.45%）制 成 的 菌 落 总 数 为 2.91×107 CFU/mL，pH2.55，盐度为3.0%的发酵剂发酵的泡萝卜挥发性风味成分表现较优，并且该发酵剂发酵的泡萝卜感官品质较好。Song 等[3]探究添加植物乳杆菌和戊糖片球菌对酸菜品质的影响，结果表明添加植物乳杆菌和戊糖片球菌发酵剂不仅可以增加有机酸，还能减少亚硝酸盐的积累，延长酸菜保质期。Liang 等[4]探究盐的添加量对酸菜品质的影响，结果显示盐的添加会影响挥发性化合物的分布，在发酵过程中与优势属乳酸杆菌有很强的相关性，6%的盐添加量可以获得更高的乳酸菌丰度和更好的口感。Lafountain 等[5]探究短烫工艺对冷藏泡菜质量的影响，结果显示90 ℃下对整根黄瓜焯水80 s 处理不仅能够减少大肠杆菌对黄瓜的影响而且能够延长保质期。近年来对橄榄菜贮藏过程中营养及安全品质的变化鲜有报道。
本文以新鲜橄榄菜为原料，对其贮藏过程的水分含量、食盐含量、糖分含量、脂肪含量、脂肪酸含量、亚硝酸盐含量、反式脂肪含量、丙烯酰胺含量进行研究，以期为橄榄菜品质分析提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
橄榄菜：广东蓬盛味业有限公司，同一批次生产。
氢氧化钠、亚铁氰化钾（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸、无水乙醚、无水硫酸钠、氢氧化钾、无水乙醇、乙酸乙酯、碘化钾、正己烷、石油醚（30～60 ℃）（均为分析纯）：广东广试试剂科技有限公司；无水乙醇（分析纯，≥99.7%）、乙腈、甲醇（均为色谱纯）：天津市富宇精细化工有限供公司。
1.2 仪器与设备
GC-2010 Pro 气相色谱仪、UV-1900i 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；NU-C200R-台式离心机：美国Nuaire 公司；8890-5977B 气相色谱-四极杆质谱联用仪、DB-5ms 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent 公司；BPG-9156A 鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；FlavourSpec®风味分析仪：德国G.A.S.公司；GZP-450N 光照培养箱：上海森信实验仪器有限公司；SH-10A 水分测定仪：上海菁海仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
将同一批次的橄榄菜混匀放入大塑料瓶中，密封，（25.0±0.5）℃光照培养箱避光储存。
1.3.2 理化指标及危害物的测定
1.3.2.1 水分含量测定
参照马路凯[6]的方法，称取橄榄菜2.0 g，剪碎，平铺在锡箔盘里，将锡箔盘放入水分测定仪中进行测定。
1.3.2.2 脂肪含量测定
参照禚林娜等[7]的方法；称取样品5 g，置于100 mL 具塞圆底试管内，加入8 mL 水，混匀后再加10 mL 盐酸（2 mol/L），将试管放入70～80 ℃水浴锅中，至试样消化完全为止；取出具塞量筒，加入10 mL 乙醇，混合均匀后冷却，用25 mL 无水乙醚冲洗量筒塞及量筒壁。然后加塞振摇，开塞放出气体，静置，待上部液体清晰，吸出上清液于已恒重的锥形瓶（m0）内，再加入5 mL 无水乙醚于具塞量筒内，振摇静置后，仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内；再置于90 ℃水浴上将溶剂蒸干，放入100 ℃的鼓风干燥箱中干燥1 h 后放入干燥器内冷却0.5 h 后称量。重复以上操作直至恒重（m1），两次称量的差不超过2 mg。脂肪含量计算公式如下。
式中：X1 为试样中脂肪的含量，%；m1 为恒重后接收瓶和脂肪的含量，g；m0 为接收瓶的质量，g；m 为试样的质量，g；100 为换算系数。
1.3.2.3 糖分含量测定
参照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》中第一法测定糖分含量。
1.3.2.4 食盐含量测定
参照GB 5009.42—2016《食品安全国家标准食盐指标的测定》中第一法测定食盐含量。
1.3.2.5 亚硝酸盐含量测定
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第二法测定亚硝酸盐含量。
1.3.2.6 反式脂肪酸含量测定
参照宫慧丽等[8]的方法，将提取得到的60 mg 脂肪置于10 mL 试管中，加入4 mL 异辛烷及0.2 mL 氢氧化钾-甲醇溶液（2 mol/L），混匀，静置至澄清后经0.45 μm 滤膜过滤，测定反式脂肪酸含量。
1.3.2.7 丙烯酰胺含量测定
参照叶建超等[9]的方法，配制丙烯酰胺标准溶液和13C3-丙烯酰胺内标溶液。用10% 的无水乙醇提取样品中的丙烯酰胺，加入15% 溴化钾、10% 硫酸溶液和1.67% 溴酸钾溶液溴化衍生，低温放置30 min 后，加入25% 硫代硫酸钠终止衍生。然后经固相萃取柱（solid phase extraction column，SPE）净化后，进行气相色谱质谱联用仪（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）分析。
1.3.3 脂肪酸组成测定
橄榄菜中脂肪酸成分测定参照文献[10]的方法。取经过甲酯化的脂肪溶液，过0.22 μm 微孔滤膜于气相进样瓶中，待用。通过GC-MS 对脂肪酸进行检测。经NIST 质谱谱库检索匹配，以不低于90% 的匹配度确定各脂肪酸组分，采用峰面积归一化法进行定量分析。
1.3.4 挥发性物质气相色谱离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometr，GC-IMS）分析
参照Zhao 等[11]的方法，称取橄榄菜样品5 g，置于20 mL 顶空瓶中，40 ℃孵化15 min 后进样测试。为便于观察，在25 ℃条件下，贮藏0 d 的样品标记为A1、A2、A3，贮藏35 d 的样品标记为B1、B2、B3。
气相离子迁移谱分析条件：色谱柱类型为MXT-5（15 m×0.53 mm×1.0 μm）；柱温60 ℃；载气N2；IMS 温度45 ℃；进样体积500 μL；孵育时间15 min；孵育温度40 ℃；进样针温度85 ℃；孵化转速500 r/min。
气相色谱条件：在试验开始时，等温条件的流速150 mL/min，同时程序升温条件开始以2 mL/min 升温。20 min 时，等温条件的流速为150 mL/min，程序升温的升温速率调整为100 mL/min。25 min 时，等温条件的流速保持在150 mL/min，程序升温停止。
1.4 数据处理
每个试验平行3 次，结果用平均值±标准差表示，采用IBM SPSS Statistics 25.0 进行数据处理和显著性分析（p＜0.05），Origin 2019 作图。
2 结果与分析
2.1 不同贮藏时间橄榄菜理化指标变化
橄榄菜不同贮藏时间理化指标含量变化见图1。
图1 橄榄菜不同贮藏时间理化指标含量变化
Fig.1 Content changes of physicochemical indicators of olive vegetables after different storage days
由图1 可知，贮藏期间橄榄菜水分含量为（2.04±0.04）～（2.33±0.05）g/100 g。食品中的水分不仅关乎其品质，还决定着食品的贮藏口感。随着贮藏时间的延长，橄榄菜水分含量总体呈逐渐下降趋势。可能的原因有3 点：一是新鲜加工的橄榄菜中水分含量较高，受贮藏环境的影响，有一部分水分蒸发，进而导致水分含量减少；另一个可能的原因是橄榄菜中含有一定量的食盐和糖，可能会引起水分渗出，从而导致橄榄菜中水分含量减少[12]；除此之外，橄榄菜各组分之间发生的化学变化也可能导致水分含量发生一定程度降低[13]。在整个贮藏过程，橄榄菜的水分含量均符合DBS44/014—2019《食品安全地方标准橄榄菜》规定水分含量≤30%、NY/T 437—2012《绿色食品酱腌菜》规定水分含量≤85 g/100 g、SB/T 10439—2007《酱腌菜》规定水分含量≤85 g/100 g 的规定，表明贮藏过程橄榄菜中水分保持较好。
贮藏期间橄榄菜食盐含量为（3.10±0.08）%～（4.41±0.03）%，随着贮藏时间的延长，食盐含量呈逐渐上升趋势，贮藏0 d 时含量最低，为（3.10±0.08）%，贮藏21 d 时含量最高，为（4.41±0.03）%。橄榄菜中食盐含量增加可能是因为橄榄菜加工过程中使用了酱油，随着贮藏时间的延长，酱油会析出食盐，导致食盐含量增加。食盐含量均符合DBS44/014—2019 规定食盐含量≤10%、NY/T 437—2012 规定食盐含量≥3%、SB/T 10439—2007 规定食盐含量≥3% 的规定，说明其盐度较低，口感品质较好。
贮藏期间橄榄菜脂肪含量为（33.70±0.35）%～（46.20±0.37）%，橄榄菜贮藏到第7 天时，含量最高，为（46.20±0.37）%，在贮藏28 d 时含量最低，为（33.70±0.35）%。总体来看，脂肪含量呈下降趋势。其主要原因是在贮藏前期，橄榄菜中的植物油含有的脂肪酸（亚油酸、亚麻酸、油酸）会经过氧化分解产生具有特殊香气的挥发性物质，而这些挥发性物质对橄榄菜的风味具有很好的修饰作用。研究发现，植物油在室温贮藏条件下易发生氧化反应，不饱和脂肪酸容易产生不同的自由基产生醛类、酮类、酸类等物质。袁桃静等[14]对5 种植物油的挥发性风味分析中鉴定出5 种食用植物油中关键风味化合物为己醛（脂香）、庚醛（果香）壬醛（甜橙香）等物质。由此表明橄榄菜中丰富的油脂会赋予橄榄菜特殊风味，提升橄榄菜的品质。植物油也易氧化产生异味，使其营养价值降低、影响品质，但一定程度的氧化会增加橄榄菜的风味[15]。综上，橄榄菜在25 ℃储存条件下品质良好。
贮藏期间橄榄菜糖分含量为（0.17±0.00）%～（1.10±0.02）%，在贮藏期间，糖分含量先增加后趋于平稳。橄榄菜中的主要原料是芥菜，芥菜中的硫代葡萄糖苷含量丰富，硫代葡萄糖苷作为一类糖衍生物易被水解为D-葡萄糖，使橄榄菜中水分含量减少，糖分含量增加。贮藏21 d 后糖分含量呈下降趋势，可能是因为25 ℃下硫代葡萄糖苷的含量在20 d 以后会降至最低[12]，且风味较刚开始时稍有变差。贮藏35 d 时，糖分含量波动上升，可能是橄榄菜中的组分间相互作用使糖分有所变化[16]。
综上所述，橄榄菜在25 ℃条件下经过35 d 贮藏，其水分含量和食盐含量均符合DBS44/014—2019、NY/T 437—2012、SB/T 10439—2007 相关规定。脂肪含量和糖分含量的波动对橄榄菜的品质影响较小。
2.2 不同贮藏时间脂肪酸组成和挥发性物质的变化
油脂不仅是食品加工的主要原料，也是人体不可缺少的营养物质，油脂中含有的丰富不饱和脂肪酸和人体必需脂肪酸能够为人体提供很高的营养[10]。贮藏过程中橄榄菜脂肪酸组成的变化如表1 所示。
表1 橄榄菜不同贮藏时间主要脂肪酸含量
Table 1 Contents of main fatty acids in olive vegetables after different storage days%
注：同行不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
名称不饱和脂肪酸多不饱和脂肪酸亚油酸α-亚麻酸单不饱和脂肪酸花生烯酸芥酸棕榈油酸油酸总计饱和脂肪酸肉豆蔻酸棕榈酸十七烷酸硬脂酸花生酸二十四酸总计0 d 21 d 28 d 35 d 48.56±0.73b 6.96±0.77a 51.44±0.64a 6.13±0.65c 51.35±0.62a 6.11±0.48c 51.14±0.68a 6.34±0.99b 0.22±0.65a 0.44±0.78a 0.10±0.61a 26.53±0.61a 82.81±0.53b 0.18±0.82b 0.03±0.68c 0.08±0.67b 25.62±0.64b 83.48±0.61a 0.17±0.59c 0.06±0.76b 0.08±0.75b 25.90±0.62b 83.67±0.42a 0.17±0.84c 0.04±0.90c 0.08±0.96b 26.32±0.63a 84.09±0.25a 0.11±1.13a 9.82±0.44b 0.11±0.85a 4.82±0.53a 0.43±0.35a 0.15±0.96a 15.44±0.13a 0.10±0.61b 10.74±0.95a 0.07±0.66b 4.13±0.78b 0.29±0.53b 0.15±0.48a 15.48±0.43a 0.09±0.84b 10.71±0.96a 0.06±0.76c 4.10±0.28b 0.29±0.73b 0.15±0.64a 15.40±0.36a 0.09±0.59b 10.39±0.97a 0.05±0.45c 4.12±0.24b 0.29±0.79b 0.11±0.89b 15.05±0.68b
由表1 可知，橄榄菜中含有丰富的亚油酸、油酸、α-亚麻酸等物质。其中亚油酸含量最高，贮藏到21 d时含量（51.44±0.64）%，其次是油酸。亚油酸随着贮藏时间的延长含量先上升后下降，硬脂酸、油酸、α-亚麻酸0 d 时含量较高，21 d 时含量稍有下降，28、35 d 含量虽有波动但总体呈下降趋势。总体来看，不饱和脂肪酸随着储存时间的延长呈上升趋势，饱和脂肪酸随着储存时间的延长呈下降趋势。其可能原因是橄榄菜在发酵过程中含有大量的微生物，这些微生物的存在可以促使不饱和脂肪酸含量增加。研究表明，接种干酪乳杆菌H1 发酵的番茄酸汤中的多不饱和脂肪酸比自发发酵汤中的不饱和脂肪酸含量更多[17]。谢雅芸[18]研究发现，接种酿酒酵母菌、木糖葡萄球菌、植物乳杆菌3 种微生物共同发酵的酸鱼要比未接种菌株酸鱼的不饱和脂肪酸含量高，显著提高了酸鱼的营养价值。橄榄菜中的大量植物油，在空气和脂氧酶的作用下容易发生氧化反应。开盖后的橄榄菜在25 ℃条件下贮藏，随着贮藏时间的延长，氧化速率加快，使饱和脂肪酸呈下降趋势。
研究发现，食品的质地风味与脂肪酸有一定的相关性[19]。通过GC-IMS 技术对橄榄菜进行挥发性物质检测，结果如图2 所示。
图2 橄榄菜0 d 和35 d 挥发性物质指纹图谱
Fig.2 Volatile compound fingerprints of olive vegetables after storage of 0 and 35 days
由图2 可知，第4 个框中的苯乙醛、3-羟基-2-丁酮、1-戊醇、1-辛烯-3-酮、（E）-2-庚烯醛、正戊醛等以及第1 个框中2-庚酮、己醛、2-正戊基呋喃、壬醛、正辛醛等物质随着贮藏时间的延长含量逐渐下降。第2 个框中（E，E）-2，4-庚二烯醛、（Z，Z）-2，4-庚二烯醛、5-甲基呋喃醛、反式-2-辛烯醛、正庚醛、2-丁酮、反式-2-戊烯醛则随贮藏时间延长含量升高。脂肪酸是油脂挥发性成分重要前体物质，例如亚油酸容易氧化裂解生成己醛、2-庚酮、2-正戊基呋喃等挥发性物质。通过表1 可知，随着贮藏时间的延长亚油酸呈下降趋势，从而使得第1 个框中己醛、2-庚酮、2-正戊基呋喃等挥发性物质含量随时间延长而下降。在贮藏过程中亚油酸含量要比其他脂肪酸含量高，并且2-正戊基呋喃、己醛和壬醛等醛类物质对植物油整体不良气味贡献较大，随着时间的延长会影响橄榄菜品质。第1 个框中的正辛醛、己醛随着时间的延长含量逐渐减少，但变化不明显，因油酸是壬醛和正辛醛等物质的重要来源，油酸随着时间的延长有所下降但变化不明显。第2 个框中的反式-2，4 庚二稀醛和反式-2-己烯醛随着贮藏时间的延长含量逐渐增加，两种挥发性成分来源于α-亚麻酸，而α-亚麻酸的氧化降解速率比亚油酸和油酸更快，说明α-亚麻酸的加速氧化促进了这两种物质含量的增加。在橄榄菜中由于不饱和脂肪酸的氧化降解产生阈值较低的醛类物质，一般对橄榄菜的风味贡献很大。浓度较低时会赋予食物一定的香气，当其浓度达到一定程度后，会对橄榄菜产生不良气味[19]。具有酮香和药香的酮类物质因不饱和脂肪酸的热氧化降解产生，也赋予了橄榄菜特殊的风味。
2.3 不同贮藏时间危害物的含量变化
2.3.1 橄榄菜反式脂肪酸含量的变化
反式脂肪酸（trans fatty acids，TFAs）是一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸，包括反式单不饱和脂肪酸和反式多不饱和脂肪酸，其来源于饮食补充和天然存在的顺式脂质中脂肪酸残基的内源性自由基催化的顺式-反式异构化，在食品加工过程中主要来源于植物油脂的氢化[20]。人体摄入的反式脂肪酸含量过高会对人体造成伤害，影响人体健康。对橄榄菜反式脂肪酸进行检测，结果如表2 所示。
表2 不同贮藏时间橄榄菜反式脂肪酸含量
Table 2 Contents of trans-fatty acids in olive vegetables after different storage days%
注：同行不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
名称反式油酸反式亚油酸总计0 d 1.43±0.44a 0.32±0.62a 1.75±0.41a 21 d 0.79±0.56b 0.25±0.69b 1.04±0.53b 28 d 0.69±0.62c 0.24±0.24b 0.93±0.37c 35 d 0.62±0.25c 0.24±0.92b 0.86±0.62d
由表2 可知，反式油酸和反式亚油酸随着贮藏时间的延长，含量逐渐下降。因含有大量油脂，橄榄菜在加工过程中会产生反式脂肪酸，但是在25 ℃贮藏期间，橄榄菜在温度的影响下容易会发生氧化反应和水解作用，随着贮藏时间的延长进一步减少了反式油酸和反式亚油酸的含量。除此之外，李洁艳等[21]研究发现，精炼玉米油脱臭的温度越高，时间越长，反式脂肪酸含量越高。食品中反式油酸的含量下降与微生物种类及数量有关[22]。25 ℃下储存的橄榄菜，随着时间的延长微生物大量繁殖，使得橄榄菜中的反式油酸逐渐下降。2015 年6 月16 日美国食品药品监督管理局要求逐步去除加工食品中的人造反式脂肪。丹麦政府要求含油脂食品中的反式脂肪酸含量均要低于2%[23]。我国2013 年1 月1 日实施的《预包装食品营养标签通则》中规定必须在食品标签的营养成分表中标示反式脂肪酸含量，低于2%可标注零反式。本试验中，橄榄菜中反式脂肪酸含量均低于2%。
2.3.2 橄榄菜亚硝酸盐含量的变化
硝酸盐和亚硝酸盐在环境中广泛存在，作为氮循环的一部分存在于植物中。此外，这些化合物还用作添加剂，以提高食品质量并防止微生物污染和化学变化。研究发现一些蔬菜中含有高浓度的硝酸盐，如生菠菜、芥菜、芹菜[24]。25 ℃不同贮藏时间的橄榄菜进行亚硝酸盐检测，结果如图3 所示。
图3 橄榄菜亚硝酸盐含量
Fig.3 Nitrite content in olive vegetables
由图3 可知，橄榄菜中亚硝酸盐含量呈先升高后降低趋势。橄榄菜贮藏到21 d 时达到“亚硝峰”23 mg/kg，已超过GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定的亚硝酸盐含量指标，21 d 后，亚硝酸盐含量逐渐下降，这主要是由于腌菜中的亚硝酸盐经硝酸盐还原途径生成N2（氮气）、NH4+（氨），导致腌菜发酵初期亚硝酸盐含量快速升高后逐渐降低[25]。
食品中亚硝酸盐的含量还受到原料、食盐含量、温度等影响。新鲜芥菜是制作橄榄菜的主要原料之一，在新鲜的芥菜中已有一定量的硝酸盐存在，腌渍过程芥菜中的硝酸盐会被还原成亚硝酸盐，进而导致亚硝酸盐含量升高。孟繁博等[26]在研究中发现经过8 d 发酵，11 种发酵芥菜中“昆明宽叶青”发酵的酸菜中亚硝酸盐含量最低为10.95 mg/kg，“广西客家芥菜”的亚硝酸盐含量最高为17.10 mg/kg。橄榄菜加工过程也使用一定量的食盐，食盐含量较高时会影响乳酸菌等微生物繁殖，进而导致亚硝酸盐含量上升[25]。酱菜的贮藏条件对亚硝酸盐的含量也会产生一定的影响。Wei等[27]探究泡菜在不同贮藏温度下亚硝酸盐的含量，发现高温（27 ℃）贮藏亚硝酸盐含量最高（1.29 mg/kg），其次是20 ℃，亚硝酸盐含量为0.75 mg/kg，低温（7 ℃）贮藏下亚硝酸盐浓度最低（0.20 mg/kg），表明酱菜贮藏需要较低温度。本文探究室温（25 ℃）橄榄菜贮藏过程亚硝酸盐的含量，关于不同温度下亚硝酸盐的生成规律，及相关抑制手段有待进一步研究。
2.3.3 不同贮藏时间丙烯酰胺含量的变化
丙烯酰胺是一种有毒物质，由葡萄糖、果糖和麦芽糖等多种糖类与游离氨基酸之间进行一系列非酶促反应产生，主要存在于热加工和富含碳水化合物的食物中[28]。
前体的浓度、热处理持续时间和温度、Strecker 途径（N-糖基化途径）和丙烯醛途径等重要因素会影响丙烯酰胺的形成。研究表明，丙烯酰胺对人类和动物具有潜在的神经毒性，在动物中具有诱变性，在啮齿动物中具有遗传毒性和致癌性，并且是一种生殖毒物[29]。当前对丙烯酰胺的生成和抑制一直是研究热点，橄榄菜在制作过程中会经过高温处理，可能会通过美拉德反应生成丙烯酰胺。通过对不同贮藏时间下橄榄菜中丙烯酰胺含量进行检测，结果为未检出（＜0.005%）丙烯酰胺，表明橄榄菜在贮藏过程中安全品质保持较好。
3 结论
本文通过对橄榄菜品质研究发现，通过对25 ℃条件下储藏35 d 的橄榄菜进行理化指标测定得出，该贮藏条件对橄榄菜的品质影响较小。橄榄菜中的不饱和脂肪酸随着贮藏时间的延长呈逐渐上升趋势，饱和脂肪酸呈下降趋势，橄榄菜的气味与脂肪酸具有一定的相关性。橄榄菜中的危害物随着贮藏时间的延长，逐渐下降并达到国家规定的标准。说明，在25 ℃下，橄榄菜贮藏1 个月左右品质良好。橄榄菜除了营养价值丰富还含有丰富的生物活性成分，本文为了解橄榄菜贮藏过程的品质变化，保障其安全食用提供了一定的理论基础。
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