浓香型白酒是我国白酒的基本香型之一，在白酒市场占有率达70%，具有窖香醇厚、绵柔甘洌、香气协调、尾净悠长等优点[1]。浓香型白酒工艺特点是采取泥窖固态发酵，而窖池在浓香型白酒中发挥作用的最主要载体便是窖泥。窖泥是一类高水分、高腐殖物和低含氧量的特殊性土壤。窖泥也是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源，窖泥中微生物的种类、丰度、新陈代谢活动等均会对浓香型白酒品质产生很大的影响。窖池环境的长时间培养与驯化，导致窖泥中的微生物既彼此拮抗又彼此共生，形成了窖池微生物独特的生态系统，在白酒酿造过程中，窖泥微生物进入酒醅中生长与代谢，产生复杂多样的代谢产物，形成种类丰富的风味物质，赋予了浓香型白酒独特的风味特点。
目前，窖泥培养液在养护新窖池、复壮退化窖池和培养人工窖泥方面具有重要应用，研究人员制备窖泥养护液对窖池进行养护，该方法对退化窖池中窖泥的氮、磷、钾、腐殖质指标的增加和所产原酒中己酸、己酸乙酯的提升作用十分显著[2-5]。还有研究表明，以白酒生产过程中副产物为基础制作窖泥培养液，有效提高了窖泥的品质和活性[6-7]。
在浓香型大曲酒生产中，原材料和副产物含有丰富的有机营养价值，麸皮成本低且含有丰富的淀粉、维生素、纤维素、蛋白质，可以为微生物的生长提供丰富的营养物质[8]。稀酸水解法是目前预处理麸皮的主要方法，与传统的二氧化碳爆破、氨纤维爆破方法相比，具有安全、成本低、操作简单等优点[9]。黄水是白酒固态发酵过程中的副产物之一，含有大量的色素、单宁、蛋白质、有机酸等物质，有机营养物质丰富[10]。
本研究以浓香型白酒生产过程中的原材料、副产物为基础，研制窖泥培养液配方，并通过单因素试验和响应面试验对窖泥培养液进行工艺优化，且将优化后的培养液扩大培养，对退化的窖池进行应用，分析归纳窖池养护前后窖泥的感官、理化、原酒中己酸乙酯含量等数据，旨在提高所提取复合菌液的质量，使窖泥培养液的功效达到最高，以期达到养护窖泥、提高窖泥的品质、复壮退化窖池、提升白酒品质的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麸皮、黄水、老窖泥、原酒、红曲霉：济南趵突泉酿酒有限责任公司。
1.2 仪器与设备
7890B GC System 气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；FA2004 精密电子天平：天津天马衡基仪器有限公司；SPX-150B-Z 生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LMQ.C-80E 立式灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 窖泥培养液基础配方制作方法
窖泥培养液基础配方为老窖泥10%、麸皮水解液5%、红曲霉2%、黄水8%、优质原酒5%、灭菌水70%，35 ℃培养30 d 使用。
培养液以1 L 为标准进行配制，具体方法：1）用电子天平称取100 g 老窖泥，揉碎备用。2）纯净水高温灭菌处理后冷却至40 ℃，加入老窖泥，搅拌均匀。3）制备麸皮酸水解液，采用低浓度、高温高压快速水解法，即干麸皮与水按1∶20（g/mL）配制，盐酸调pH 值至1.0，120 ℃立式灭菌器加热水解20 min，取滤液备用[11-12]。4）将麸皮水解液、红曲霉、黄水、原酒依次加入到老窖泥中，混匀。5）调节pH 值至7，放入生化培养箱，35 ℃培养30 d，检测己酸含量。
1.3.2 窖泥培养液条件优化
1.3.2.1 单因素试验
选取老窖泥添加量（8%、9%、10%、11%、12%）、麸皮水解液添加量（4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%）、黄水添加量（6.0%、7.5%、9.0%、10.5%、12.0%）、培养温度（34、35、36、37、38 ℃）、培养时间（20、25、30、35、40 d）为自变量，以窖泥培养液中己酸含量为评价指标进行单因素试验[13-14]。
1.3.2.2 Box-Behnken 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，以老窖泥添加量（A）、黄水添加量（B）、培养温度（C）、培养时间（D）为自变量，以窖泥培养液中己酸含量为评价指标，采用Box-Behnken 试验设计考察各因素对窖泥培养液中己酸含量的影响，进而得出窖泥培养液的最佳工艺条件。Box-Behnken 试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design
水平A 老窖泥添加量/%B 黄水添加量/%C 培养温度/℃D 培养时间/d-1 0 1 10 11 12 9.0 10.5 12.0 36 37 38 25 30 35
1.3.3 窖泥培养液在退化窖池中的应用
选取两个退化窖池A、B，A 窖池使用2 L 窖泥培养液进行养护强化，B 窖池不加窖泥培养液，均重复养护发酵3 个轮次。待酒醅出池后，清理窖池四周池壁和底部的残留酒醅。然后在池壁和池底打上小孔，小孔深度约4 cm、间距10 cm，池壁小孔向上倾斜45°。将窖泥培养液发酵完毕后调匀，自池壁从上向下淋泼，直至注满所有小孔。经过3 个轮次养护发酵，每次取该窖池池壁泥进行感官、理化分析，并对每次发酵完毕后原酒中的己酸乙酯进行检测[15-16]。
1.3.4 窖泥理化指标检测
参考沈怡方[17]的检测方法对窖泥中水分含量、pH值、有效钾含量、有效磷含量、腐殖质含量、氨态氮含量进行测定。
1.3.5 己酸和己酸乙酯含量的检测方法
利用气相色谱检测窖泥培养液中的己酸含量和原酒中的己酸乙酯含量，具体气相色谱条件参考赵巧珍等[18]的方法检测。
1.4 数据分析与处理
采用Design-Expert 11.0.3 进行响应面试验设计和数据分析，所有的试验均重复3 次。数据采用Excel进行分析和处理。
2 结果与分析
2.1 窖泥培养液优化单因素试验
2.1.1 老窖泥添加量对窖泥培养液产己酸的影响
老窖泥添加量对窖泥培养液产己酸的影响见图1。由图1 可知，随着老窖泥添加量的增加，窖泥培养液中己酸含量呈先增加后降低的趋势，当老窖泥添加量为8%～11% 时，窖泥培养液中己酸含量逐渐升高。当老窖泥添加量达到11% 时，己酸含量达到最大，为6.5 g/L。当老窖泥添加量高于11% 时，己酸含量开始降低。这可能是由于当老窖泥添加量为11%时，老窖泥中的微生物含量适宜，可使菌种提前进入对数生长期，有利于快速代谢产酸[19]。因此选择老窖泥添加量10%、11%、12%进行响应面优化试验。
图1 老窖泥添加量对窖泥培养液产己酸的影响
Fig.1 Effect of additive amounts of old pit mud on production of caproic acid in pit mud culture solution
2.1.2 麸皮水解液添加量对窖泥培养液产己酸的影响
麸皮水解液添加量对窖泥培养液产己酸的影响见图2。
图2 麸皮水解液添加量对窖泥培养液产己酸的影响
Fig.2 Effect of bran hydrolysate additive amounts on caproic acid production in pit mud culture solution
由图2 可知，窖泥培养液中的己酸含量随麸皮水解液添加量的增加呈先增加、稳定后降低的趋势。当麸皮水解液添加量在4.0%～4.5%时，窖泥培养液中己酸含量随麸皮水解液添加量的增加而升高。在麸皮水解液添加量为4.5%～5.0%时，窖泥培养液中己酸含量保持稳定，为5.7 g/L。麸皮水解液添加量超过5.0%时，窖泥培养液中己酸含量开始降低。在后续的响应面优化试验中麸皮水解液添加量固定在4.5%。
2.1.3 黄水添加量对窖泥培养液产己酸的影响
黄水添加量对窖泥培养液产己酸的影响见图3。
图3 黄水添加量对窖泥培养液产己酸的影响
Fig.3 Effect of yellow water additive amounts on caproic acid production in pit mud culture solution
由图3 可知，窖泥培养液中的己酸含量随黄水添加量的增加呈先增加后减少的趋势。当黄水添加量在6.0%～10.5% 时，窖泥培养液中的己酸含量逐渐增加，当黄水添加量在10.5% 时，己酸含量达到最大值，为5.6 g/L。继续增加黄水的添加量，有机酸含量开始降低。这可能是由于黄水中醛、醇含量较高，黄水过多添加，会抑制窖泥培养液中微生物的活性[20]。因此选择黄水添加量9.0%、10.5%、12.0%进行响应面优化试验。
2.1.4 培养温度对窖泥培养液产己酸的影响
培养温度对窖泥培养液产己酸的影响见图4。
图4 培养温度对窖泥培养液产己酸的影响
Fig.4 Effect of incubation temperatures on caproic acid production in pit mud culture solution
由图4 可知，窖泥培养液中的己酸含量随培养温度的升高呈现先增加后减小的趋势。当培养温度为34～37 ℃时，窖泥培养液中己酸含量逐渐增加。当培养温度达37 ℃时，己酸含量达到最大，为5.7 g/L。当培养温度持续升高，窖泥培养液中的己酸含量逐步降低，这可能是由于产己酸微生物的适宜生长温度为37 ℃，温度过高，抑制了微生物代谢活动[21-23]。因此选择培养温度36、37、38 ℃进行响应面优化试验。
2.1.5 培养时间对窖泥培养液产己酸的影响
培养时间对窖泥培养液产己酸的影响见图5。
图5 培养时间对窖泥培养液产己酸的影响
Fig.5 Effect of incubation times on caproic acid production in pit mud culture solution
由图5 可知，窖泥培养液中的己酸含量随培养时间的延长呈现先增加后降低的趋势。当培养时间在20～30 d 时，窖泥培养中的己酸含量逐渐升高，当培养时间为30 d 时，窖泥培养液中的己酸含量达到最大值，为5.9 g/L，当培养时间继续延长，窖泥培养液中的己酸含量开始逐渐下降，这可能是因为培养时间过长，微生物过度生长，营养物质消耗殆尽，反而抑制了微生物生长繁殖。因此选择培养时间25、30、35 d 进行响应面优化试验。
2.2 响应面试验设计及结果
在单因素试验基础上，以老窖泥添加量（A）、黄水添加量（B）、培养温度（C）、培养时间（D）为自变量，以己酸含量（Y）为响应值，采用Box-Behnken 试验设计及结果见表2，方差分析见表3。
表2 Box-Behnken 试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken experiment designs and results
试验号A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1 1-1-1-1 1 0 0 0 0-C0 0 0 0-1 1-D0 0 0 0-1-1 1 1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 1-1 1 0 0 0 0-1 1 0 0 0 0 0 0 0 0-1 1-1 1 0 0 0 0-1-1 1 1-1 1-1-1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0-1 1-1 1 0 0 0 0 0 0 0 0-1-1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Y 己酸含量/（g/L）6.13 6.37 5.97 6.57 5.87 6.67 6.57 6.60 5.67 6.77 6.91 6.97 6.01 6.57 6.81 6.07 5.86 7.44 7.03 6.58 5.95 6.28 6.50 6.27 7.40 7.32 7.40 7.40 7.30
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：**表示影响极显著，P＜0.01；*表示影响显著，P＜0.05。
来源模型自由度14 A B C D AB显著性*******AC AD BC BD CD A²B²C²D²残差失拟项纯误差总离差平方和7.9 0.816 4 0.000 1 0.172 8 0.567 7 0.032 4 1.03 0.270 4 0.422 5 0.078 4 0.148 2 0.773 2 3.1 0.883 2 1.62 0.316 7 0.296 3 0.020 5 8.22 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 F 值24.95 36.09 0.005 9 7.64 25.09 1.43 45.54 11.95 18.67 3.47 6.55 34.17 137.09 39.04 71.75 P 值＜0.000 1＜0.000 1 0.939 9 0.015 2 0.000 2 0.251 3＜0.000 1 0.003 8 0.000 7 0.083 8 0.022 7＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1***************10 4 28均方0.564 4 0.816 4 0.000 1 0.172 8 0.567 7 0.032 4 1.03 0.270 4 0.422 5 0.078 4 0.148 2 0.773 2 3.1 0.883 2 1.62 0.022 6 0.029 6 0.005 1 5.79 0.052 7
通过Design-Expert 11.0.3 对表2 数据进行多元线性回归分析，得到二次多项式方程为Y=7.39+0.26.8A-0.003 3B+0.120 0C+0.217 5D+0.090 0AB-0.507AC-0.260 0AD-0.325 0BC-0.140 0BD-0.192 5CD-0.345 2A2-0.691 5B2-0.369 0C2-0.500 3D2。
由表3 可知，模型F 值=24.95，P＜0.000 1，表明该模型极显著，并且模型的失拟项（P=0.052 7＞0.05）不显著，表明所选模型具有良好的拟合度，能较好地拟合试验结果。决定系数R2 为0.961 5，调整决定系数R2Adj为0.922 9，表示该模型能够解释92.29% 的窖泥培养液中己酸含量的变化，进一步表明回归方程具有良好的拟合度[24-29]。
由P 值可知，在模型中，A、D、AC、AD、BC、A2、B2、C2、D2 对结果影响极显著（P＜0.01）；C、CD 对结果影响显著（P＜0.05），而其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F 值可知，4 个因素对窖泥培养液中己酸含量影响依次为老窖泥添加量（A）＞培养时间（D）＞培养温度（C）＞黄水添加量（B）。
2.3 各因素交互作用对窖泥培养液中己酸含量的影响
通过响应面及等高线可以直观地分析各因素之间交互作用下己酸含量的变化，Design-Expert 11.0.3 软件绘制各因素交互作用对结果影响的响应面及等高线见图6。
图6 各因素交互作用对己酸含量影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surfaces and contour lines of effect of interaction of various factors on pit mud culture solution
从图6 可以看出，AC、BC、AD 的响应面曲线最陡，等高线相对较紧密，因此AC、BC、AD 的交互作用对窖泥培养液中己酸含量影响极显著；CD 的交互作用对己酸的产生也有一定的影响；BD、AB 的响应曲面相对平坦，等高线松散，表明BD、AB 的交互作用对窖泥培养液中己酸的产生影响较小。交互作用对窖泥培养液中生成己酸的影响顺序为AC＞BC＞AD＞CD＞BD＞AB。
通过回归模型的预测得到窖泥培养液中己酸最大产值的最佳工艺为老窖泥添加量11.81%、黄水添加量10.84%、培养温度37.20 ℃、培养时间37 d，此时窖泥培养液中己酸含量理论值为7.44 g/L。考虑到试验的客观条件以及操作简便性，改进后的最佳条件为老窖泥添加量11.80%、黄水添加量10.80%、培养温度37 ℃、培养时间37 d，在该条件下进行试验，重复3次，窖泥培养液中己酸含量为7.27 g/L。说明该模型与实际情况拟合较好，结果可靠。
2.4 窖泥培养液对窖池养护作用
窖池养护理化指标见表4。
表4 窖池养护理化指标
Table 4 Indicators of cellar pond nursing
项目A0 A1 A2 A3 A 组平均值B0 B1 B2 B3 B 组平均值水分含量/%34.54 36.34 39.54 40.94 37.84 36.32 37.65 35.48 38.05 36.88 pH 值4.42 4.82 6.07 6.76 5.52 5.07 5.73 5.85 5.88 5.63有效钾含量/（mg/100 g 干土）25.08 29.83 36.54 42.85 33.57 24.58 27.40 36.54 33.68 30.55有效磷含量/（mg/100 g 干土）216.20 337.89 503.53 670.23 431.96 278.56 268.35 310.47 369.47 306.71氨态氮含量/（mg/100 g 干土）111.77 243.66 285.14 337.48 244.51 196.76 230.61 221.32 210.63 214.83腐殖质平均值/%7.98 9.95 10.45 13.11 10.37 7.65 8.25 8.38 8.10 8.01感官分析灰色，窖香味较小，有板结灰色，窖香味较小深灰色，有窖香味，湿度适宜深灰色偏黑色，窖泥较细腻灰色，窖香味较小，有板结灰色，窖香味较小，轻微板结灰色，有窖香味灰色，窖香味适中原酒己酸乙酯含量/（g/L）1.73 2.26 2.85 3.47 2.57 1.73 1.98 1.87 2.05 1.91
由表4 可知，养护前窖泥水分为34.54%，3 个轮次养护后窖泥水分为40.94%，正常成熟窖泥水分为40%～50%，养护前后窖池水分提升较大，达到正常成熟窖泥的水平。养护前后窖泥pH 值由4.42 上升至6.76，呈弱酸性。有效钾、有效磷、氨态氮、腐殖质含量上升幅度较大。感官评价方面，养护前至养护3 轮结束，窖泥色泽逐渐加深，由灰色逐步向黑色转变，窖泥板结情况消失，窖香味逐渐增加。3 个轮次养护后窖池所产原酒的己酸乙酯含量稳步提升，最终达到3.47 g/L。在平均水平上，相比较未使用窖池培养液养护的B 窖池，A 窖池窖泥水分、有效钾、有效磷、腐殖质、氨态氮、原酒己酸乙酯含量均有较大的提高，pH 值更接近7，表明窖泥培养液对窖泥质量的提高有明显的促进作用[30]。
3 结论
本研究结果4 个因素对窖泥培养液中己酸含量影响依次为老窖泥添加量（A）＞培养时间（D）＞培养温度（C）＞黄水添加量（B），通过回归模型的预测得到窖泥培养液中己酸最大产值的最佳工艺，改进后的最佳条件为老窖泥添加量11.80%、黄水添加量10.80%、培养温度37 ℃、培养时间37 d，窖泥培养液中己酸含量为7.27 g/L。说明该模型与实际情况拟合较好。将窖泥培养液对浓香退化窖池进行养护，对养护前后窖泥的质量变化进行分析可知，经过3 个轮次窖泥培养液对退化窖池养护，pH 值由4.42 上升为6.76，呈弱酸性。有效钾、有效磷、氨态氮、腐殖质含量上升幅度较大。感官评价方面，窖泥色泽逐渐加深，由灰色逐步向黑色转变，窖泥板结情况消失，窖香味逐渐增加。窖池所产原酒的己酸乙酯含量稳步提升，最终达到3.47 g/L。表明窖泥培养液对窖泥质量的提高有明显的促进作用。对该窖泥培养液的优化和应用的探究，为退化窖池的复壮和新窖池的养护提供了理论基础和技术支持。
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