山楂(Crataegus pinnatifida Bunge)为蔷薇科,属落叶乔木植物,又名山里红,是中国特有的药果兼用树种,分布于河北、内蒙古、陕西、江苏等省,其味酸甘、性微温,各部分均可入药,具有健胃消食、降脂化浊等诸多功效[1]。山楂中含有山楂酸、黄酮、多糖及多种维生素等成分[2-4],其中山楂果胶属于一种酸性多糖,含量可达6.4%,居所有水果之首,是工业上优质的果胶生产原料[5]。果胶可在果酱、饮料、乳制品等食品加工中用作添加剂[6],此外,在医学领域也表现出巨大的潜力,可以降低胆固醇[7]、抗炎[8]、抗肿瘤[9]、抗氧化[10]、降血脂[11]等。目前我国山楂加工技术落后,深加工产品附加值较低,使其资源浪费严重,亟需引入新理念、新技术以促进其发展。探索高效的山楂果胶提取新工艺,也是当前研究的热点。
目前,大多数果胶来源于天然植物,主要以柑橘、葡萄柚、苹果等为原料[12]。传统的果胶提取方法为酸提法[13],在提取过程中往往需要加入较多的强酸来调整提取溶剂的pH 值,不仅会带来环境污染,而且会使果胶得率受到一定限制。酸性电解水是一种潜在的抗菌剂,具有较强的杀菌功效,会对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的膜功能构成威胁[14],同时细胞壁中存在的蛋白质会被电解水中的活性因子破坏,从而加速果胶的溶解,提高果胶得率[15]。与常规化学试剂相比,电解水成本较低、安全环保、健康无毒。因此,可采用酸性电解水来代替其他强酸性试剂作为提取山楂果胶的提取溶剂。目前,利用超声波辅助电解水提取山楂果胶的研究鲜见。
本文以山楂为研究对象,酸性电解水为提取溶剂,利用超声波进行辅助提取,通过单因素试验及响应面试验优化山楂果胶的提取工艺,并对山楂果胶进行抗氧化活性研究,以期探索一种提取山楂果胶的新方法,为山楂资源的高效开发利用提供新的思路。
山楂干:神威药业中药饮片有限公司;无水乙醇、氢氧化钠:天津市永大化学试剂有限公司;咔唑:上海麦克林生化科技股份有限公司;盐酸、浓硫酸:天津市科密欧化学试剂有限公司;半乳糖醛酸标准品:天津市华东试剂厂;氯化钠:天津市大茂化学试剂厂;维生素C:天津博迪化工股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):上海宝曼生物科技有限公司;硫酸亚铁:天津市四通化工厂;过氧化氢:无锡市晶科化工有限公司;水杨酸:天津华孚尔化工有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅、FW100 高速万能粉碎机:天津市泰斯特仪器有限公司;V-5000 可见分光光度仪:上海元析仪器有限公司;SC-350 立式透明门冷藏柜:青岛海尔集团公司;QUINTIX224-1CN 电子天平:绍兴上虞艾科仪器设备有限公司;80 目分样筛:浙江绍兴陶堰红旗纱筛厂;PB-10 pH 计:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;XY-L5-1000 电解水制备机:宝鸡新宇光机电有限责任公司;LXJ-IIB 离心机:上海安亭科学仪器厂;KQ5200DE 型数控超声清洗器:昆山市超声仪器有限公司。
1.3.1 半乳糖醛酸标准曲线的绘制
根据NY/T 2016—2011《水果及其制品中果胶含量的测定分光光度法》[16]对果胶进行定量。分别配制溶液质量浓度为0.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 mg/L的半乳糖醛酸溶液。取6 支25 mL 具塞刻度试管,加入不同浓度的半乳糖醛酸溶液各1 mL,再分别加入0.25 mL 的咔唑-乙醇溶液,然后迅速加入5 mL 浓硫酸,在80 ℃水浴中振荡加热20 min。冷却后,以蒸馏水为空白调零,在525 nm 处测定不同浓度溶液的吸光度。分别以半乳糖醛酸溶液质量浓度和吸光度为横、纵坐标,绘制标准曲线,经回归分析得到拟合度最佳的线性回归方程为y=0.010 5x+0.008,相关系数R2=0.999 3,表明半乳糖醛酸溶液浓度在0.0~100.0 mg/L范围内与吸光度具有良好的线性相关性。
1.3.2 酸性电解水的制备
用12 L 去离子水溶解13 g 氯化钠,启动电解水制备机,设定电流20 A、电压20 V,运行15 min,最终得到pH 值约为2.25 的酸性氧化电解水[17]。
1.3.3 山楂果胶的提取
将山楂干进行粉碎,过80 目分样筛备用。称取1.00 g 山楂粉末,按照一定的料液比加入调好pH 值的酸性电解水溶液中,再将其放入超声清洗器中超声处理一定时间,5 000 r/min 条件下离心15 min,取上清液,加入4 倍体积无水乙醇溶液,放置于4 ℃环境下静置过夜,5 000 r/min 条件下离心15 min,收集沉淀得到山楂果胶。
1.3.4 山楂果胶得率的测定
将山楂果胶定容至一定体积,按照绘制标准曲线操作步骤,根据公式(1)计算山楂果胶得率(G,%)。
式中:C 为待测山楂果胶溶液所含半乳糖醛酸的质量浓度,mg/L;V 为待测山楂果胶溶液的定容体积,mL;X 为山楂果胶沉淀的稀释倍数;M 为山楂粉的质量,g。
1.3.5 单因素试验
1.3.5.1 pH 值对山楂果胶得率的影响
将电解水分别加入锥形瓶中,固定料液比1∶30(g/mL)、超声时间60 min、超声温度60 ℃,用盐酸调节pH 值,研究不同pH 值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)对山楂果胶得率的影响。
1.3.5.2 料液比对山楂果胶得率的影响
将电解水分别加入锥形瓶中,在pH 值为1.5、超声时间60 min、超声温度60 ℃的条件下,研究不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)]对山楂果胶得率的影响。
1.3.5.3 超声时间对山楂果胶得率的影响
将电解水分别加入锥形瓶中,在pH 值为1.5、超声温度60 ℃、料液比1∶30(g/mL)的条件下,研究不同超声时间(20、40、60、80、100 min)对山楂果胶得率的影响。
1.3.5.4 超声温度对山楂果胶得率的影响
将电解水分别加入锥形瓶中,在pH 值为1.5、超声时间60 min 的条件下,研究不同超声温度(50、60、70、80、90 ℃)对山楂果胶得率的影响。
1.3.6 响应面优化试验设计
根据单因素试验结果,采用Design-Expert 8.0.6 软件,遵循Box-Behnken 原理,以山楂果胶得率为响应值,pH 值、料液比、超声时间、超声温度为考察因素,进行响应面分析,因素与水平见表1。
表1 响应面因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface
水平A 料液比/(g/mL)B 超声时间/min C pH 值D 超声温度/℃-1 0 1 1∶20 1∶30 1∶40 40 60 80 1.0 1.5 2.0 70 80 90
1.3.7 山楂果胶的抗氧化活性测定
1.3.7.1 山楂果胶DPPH 自由基清除率
参考杜丽娟等[18]的方法,配制0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 山楂果胶溶液,取不同浓度的溶液0.1 mL,加入3.9 mL 的0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液,混合均匀,26 ℃条件下静置30 min,以蒸馏水代替样品管为空白对照,VC 为阳性对照组,用可见分光光度仪在517 nm 波长处测定吸光度,按公式(2)计算DPPH 自由基清除率(D,%)。
式中:A0 为空白组吸光度;A1 为样品组吸光度;A2为样品对照组(乙醇替代反应)的吸光度。
1.3.7.2 山楂果胶羟自由基清除率
参考Chen 等[19]的方法,配制0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 山楂果胶溶液,在试管中各取1 mL 待测溶液加入1 mL 的9 mmol/L FeSO4 溶液和9 mmol/L H2O2,26 ℃条件下静置10 min,最后加入9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1 mL 启动反应,混合均匀,在37 ℃水浴保温30 min,冷却至室温,以蒸馏水代替样品管为空白对照,VC 为阳性对照组,在510 nm 波长处测定其吸光度,按公式(3)计算羟自由基清除率(Q,%)。
式中:A0 为空白组吸光度;A1 为样品组吸光度;A2为样品对照组(H2O 代替水杨酸)的吸光度;
每项试验均进行3 次,试验结果用平均值±标准差表示。利用Design-Expert 8.0.6、SPSS、Origin 2021 等软件对数据进行绘制和处理。
pH 值对山楂果胶得率的影响如图1 所示。
图1 pH 值对山楂果胶得率的影响
Fig.1 Effect of pH on the yield of hawthorn pectin
由图1 可知,随pH 值的升高,山楂果胶得率呈现出先增大后减小的变化趋势,当pH 值小于1.5 时,山楂果胶的得率较低,这是因为提取溶液中的水溶性果胶在强酸的作用下会发生脱脂裂解[20],从而导致山楂果胶得率降低。当pH 值为1.5 时,糖苷键打开较为完全,因此山楂果胶得率达到最高。在pH 值大于1.5 以后,山楂果胶的得率下降,这是因为当酸度减弱时,非水溶性原果胶向水溶性果胶的转化能力显著降低,从而使山楂果胶得率降低。因此,选择提取山楂果胶的pH 值为1.0、1.5、2.0 进行后续试验。
料液比对山楂果胶得率的影响如图2 所示。
图2 料液比对山楂果胶得率的影响
Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of hawthorn pectin
由图2 可知,当电解水添加量小于1∶30(g/mL)时,电解水添加量增大会使山楂果胶的得率升高,可能是由于在电解水添加量较小时,提取液的黏度较大,导致山楂中果胶难以扩散,不能完全水解;当料液比为1∶30(g/mL)时,山楂果胶的得率达到最大;当电解水添加量大于1∶30(g/mL)时,随电解水添加量增加会使山楂果胶得率的逐渐降低,这可能是由于溶剂用量过大时,提取出的山楂果胶在溶液中的含量过低,沉淀效果不佳,导致山楂果胶的得率降低[21]。因此,选择提取山楂果胶的料液比为1∶20、1∶30、1∶40(g/mL)进行后续试验。
超声时间对山楂果胶得率的影响如图3 所示。
图3 超声时间对山楂果胶得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on the yield of hawthorn pectin
由图3 可知,山楂果胶得率随超声时间的延长呈现出先升高后降低的变化规律,在60 min 时达到最高。这主要是由于超声波的作用时间太短时,不利于山楂果胶的充分溶出;而在超声波和高温的共同作用下,提取时间过长可能会导致部分山楂果胶双重降解,导致得率降低。因此,选择提取山楂果胶的超声时间为40、60、80 min 进行后续试验。
超声温度对山楂果胶得率的影响如图4 所示。
图4 超声温度对山楂果胶得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasound treatment temperature on the yield of hawthorn pectin
由图4 可知,当超声温度低于80 ℃时,山楂果胶的得率会随着超声温度的升高而升高,这是因为超声温度较高时,细胞壁和表皮组织会变得更加松弛,使非水溶性原山楂果胶能够更好地转化为水溶性山楂果胶;当超声温度为80 ℃时,山楂果胶的得率达到最大值;当超声温度高于80 ℃时,山楂果胶的得率呈下降趋势,这可能是因为超声温度太高,会导致山楂果胶发生降解[22]。因此,选择提取山楂果胶的超声温度为70、80、90 ℃进行后续试验。
2.2.1 回归方程的建立
响应面试验结果如表2 所示。
表2 响应面试验结果
Table 2 Results of response surface test
试验号因素B 超声时间1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 料液比-1-1-1-1-1-1 0 0 0-C pH 值-1 D 超声温度0-1 0 0 0 0 1-1 1 1 0 0 1 0-1 1 0 0 0-0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1-1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29-1 0-1 1 0 1 0-0 0 1 0 0 1 0 0-1 0 1 0 0 1 0 0-1 1-1 1 0 0 1-0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1-1 0 0 0-1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0山楂果胶得率/%6.01 6.56 6.69 7.22 5.86 6.49 5.94 5.93 6.05 5.21 6.19 7.22 5.57 7.24 6.90 6.72 7.25 7.24 5.98 5.72 4.87 5.89 4.08 6.19 6.13 5.68 6.14 6.57 4.48
利用Design-Expert 8.0.6 软件,对表4 的试验结果进行二次多项式回归拟合,得到回归方程Y=7.17-0.3A-0.16B-0.32C+0.14D+0.22AB-0.55AC+0.079AD-0.63BC+0.34BD+0.19CD-0.26A2-0.7B2-1.15C2-0.38D2。
2.2.2 回归模型的方差分析
回归分析结果见表3。
表3 回归分析结果
Table 3 Results of regression analysis
注:**表示影响极显著(P<0.01)。
变异来源模型自由度14 A B C D AB显著性******AC AD BC BD CD****A2 B2 C2 D2 F 值11.71 10.87 3.19 11.81 2.23 1.97 11.89 0.25 15.56 4.55 1.35 4.16 31.15 84.15 9.38 P 值<0.000 1 0.005 3 0.095 6 0.004 0 0.157 5 0.181 8 0.003 9 0.627 6 0.001 5 0.051 1 0.264 4 0.060 8<0.000 1<0.000 1 0.008 4******残差失拟项纯误差总差平方和16.73 1.11 0.33 1.21 0.23 0.20 1.21 0.025 1.59 0.46 0.14 0.42 3.18 8.59 0.96 1.43 1.34 0.091 18.16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28均方1.20 1.11 0.33 1.21 0.23 0.20 1.21 0.025 1.59 0.46 0.14 0.42 3.18 8.59 0.96 0.10 0.13 0.023 5.87 0.051 4
由表3 可知,该回归模型P<0.01,具有极显著性;同时该模型R2=0.921 3,R2Adj=0.842 6,说明预测值与实际值具有高度相关性,试验误差小。由方差分析结果可知,模型的一次项A、C,交互项AC、BC,二次项B2、C2、D2 影响极显著(P<0.01)。其他相关因素的影响不显著。根据F 值大小可知,各因素对山楂果胶得率的影响顺序为pH 值>料液比>超声时间>超声温度。综上,该模型可用于山楂果胶的提取工艺优化。
2.2.3 响应面分析
各因素交互作用响应面及等高线如图5 所示。
图5 各因素交互作用响应面及等高线
Fig.5 Response surfaces and contour plots of the effects of interactions between extraction parameters on the yield of hawthorn pectin
响应面曲线越陡峭则,表示各个因素之间的交互作用越明显,曲线平缓则表示交互作用较弱;等高线中图形越圆则说明各因素之间的交互作用越弱,相反就越强[23]。由图5 可知,A(料液比)与C(pH 值),B(超声时间)与C(pH 值)相互交互的响应面图较陡,等高线图呈较为扁的椭圆形,即AC、BC 对山楂果胶得率的影响显著。A(料液比)与B(超声时间)、A(料液比)与D(超声温度)、B(超声时间)与D(超声温度)、C(pH 值)与D(超声温度)之间交互作用的等高线呈现较圆的椭圆形,即AB、AD、BD、CD 对山楂果胶得率的影响不显著,与方差分析结果相吻合。
2.2.4 验证试验
利用Design-Expert 8.0.6 软件对超声波辅助电解水法提取山楂果胶的工艺进行优化预测,确定了最佳工艺参数:pH1.55、料液比1∶22.91(g/mL)、超声温度80.15 ℃、超声时间54.83 min,在此条件下,山楂果胶得率的预测值为7.305%。考虑到实际操作性,调整工艺参数为pH1.55、料液比1∶23(g/mL)、超声温度80 ℃、超声时间55 min。在此最优提取工艺条件下进行3 次重复试验,得到实际山楂果胶得率为(7.207±0.134)%,与模型预测到的理论值拟合程度高,表明试验结果具有可行性。
超声波辅助电解水提取法与其他方法对山楂果胶得率的对比如图6 所示。
图6 3 种方法提取山楂果胶得率比较
Fig.6 Comparison on the yield of hawthorn pectin extracted by three methods
由图6 可知,超声波辅助电解水法得率最高,其次是超声波辅助酸水法,传统酸提法得率最低。与王炜清等[24]用电解水提取石榴皮渣果胶相比于超纯水提取工艺,提取得率提高了2.2%的结果相一致。这是由于酸性电解水的低pH 值和高氧化还原电位能够破坏细胞膜,导致细胞膜通透性增强,进而推测细胞壁中的蛋白质可能会被电解水中的活性因子破坏,而超声波进一步增强了果胶溶出,使得率增加。相比于超声波辅助酸提法和传统酸提法,采用酸性电解水可以减少盐酸的用量,这对降低成本、绿色环保方面具有突出贡献。
2.4.1 山楂果胶的DPPH 自由基清除能力
山楂果胶的DPPH 自由基清除能力如图7 所示。
图7 山楂果胶和VC 对DPPH 自由基清除效果
Fig.7 Scavenging effects of hawthorn pectin and VC on DPPH free radicals
由图7 可知,随山楂果胶和VC 浓度增加,其DPPH 自由基清除能力均不断升高。山楂果胶清除DPPH 自由基的效果弱于VC。在0.4~2.0 mg/mL 浓度范围内,VC对DPPH 自由基的清除率保持在84%以上,山楂果胶在浓度为0.4~1.6 mg/mL 时,DPPH 自由基清除率呈缓慢上升趋势,当山楂果胶浓度为1.6 mg/mL时,对DPPH 自由基清除率趋于平缓,可达(58.98±1.77)%。结果表明,山楂果胶具有良好的清除DPPH自由基能力。
2.4.2 山楂果胶的羟自由基清除能力
山楂果胶的羟自由基清除能力如图8 所示。
图8 山楂果胶和VC 对羟自由基清除效果
Fig.8 Scavenging effects of hawthorn pectin and VC on hydroxyl free radicals
由图8 可知,随着山楂果胶和VC 浓度的增大,其清除羟自由基的能力均不断升高。山楂果胶清除羟自由基的效果弱于VC。山楂果胶在0.4~2.0 mg/mL 浓度范围内,VC 对羟自由基的清除率保持在86% 以上;羟自由基清除能力随着山楂果胶浓度的增加而升高,当山楂果胶浓度为2.0 mg/mL 时,对羟自由基的清除率可达到(66.79±1.08)%,结果表明,山楂果胶具有良好的清除羟自由基能力。
利用超声波辅助电解水法对山楂果胶提取工艺进行研究,通过响应面优化试验,确定最佳提取工艺为pH1.55、超声温度80 ℃、超声时间55 min、料液比1∶23(g/mL),所得山楂果胶得率可达到(7.207±0.134)%。抗氧化试验结果发现用超声波辅助电解水提取的山楂果胶对DPPH 自由基、羟自由基都有较好的清除作用。本研究为山楂副产物资源的综合利用、天然食品抗氧化活性物质的开发、提高山楂产业的多元化竞争力奠定坚实的技术基础。
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Optimization of Ultrasound-Assisted Electrolytic Water Extraction Process and Antioxidant Activity of Hawthorn Pectin
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