花脸香蘑（Lepista sordida）又名花脸蘑、紫花脸、丁香蘑，隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、白蘑科（Tricholomataceae）、香蘑属（Lepista）[1]，是珍稀的食药兼用菌，主要分布于我国四川、云南、贵州、陕西、山东等地。花脸香蘑子实体肉质细软，颜色呈淡紫色，有特殊蘑菇香味，富含维生素、蛋白质、氨基酸等营养元素[2-3]，以及多糖、二萜等生物活性成分[4-5]。花脸香蘑多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。菌丝发酵液中的胞外多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等活性[6]。王珊珊等[7]以26 ℃、170 r/min 为最佳培养条件获得鸡腿蘑发酵液，并从中提取胞外多糖开展体外抗氧化活性研究，发现发酵时间120 h 下的鸡腿蘑胞外多糖抗氧化活性最强，自由基清除率达（54.80±0.64）%。张嫱[8]在蔗糖15.20 g/L、酪蛋白胨7.0 g/L、接种量6.20%的最优条件下深层培养木蹄层孔菌，利用从中提取的胞外多糖进行生物活性研究，发现随木蹄层孔菌胞外多糖浓度增加，人食管癌Eca109 细胞凋亡增多，当木蹄层孔菌胞外多糖浓度为400 μg/mL 时，对肿瘤细胞的抑制率达到41.73%。于悦等[9]在最适温度24 ℃的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，对其进行免疫活性研究发现蛹虫草胞外多糖可明显提高免疫器官指数，促进T 细胞、B细胞增殖。
但花脸香蘑存在人工栽培周期长、生物转化率低、子实体易碎、虫害重等问题，限制了其规模化、商品化发展。野外采集优良的种质资源是解决以上问题的有效途径之一。赵辉等[10]从野生花脸香蘑中分离、初筛、复筛、选育出了产量较高、遗传性状稳定、农艺性状优良的菌株HL-13，增产率达17.70%。本研究对从四川省达州市通川区罗江镇柳家坝采集到的一株野生菌株进行分类鉴定，从非营养因子方面确定其产胞外多糖所需的接种量、温度、转速等最佳生长条件，并进一步探讨其胞外多糖免疫调节活性，以期为该菌种液体发酵生产提供理论参考，同时为花脸香蘑胞外多糖在新药研发和功能性食品开发等方面开创新的应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料试剂与仪器设备
1.1.1 供试菌株
供试子实体采集于四川省达州市通川区罗江镇柳家坝，通过组织分离获得纯化菌株，编号为E70。
1.1.2 试验试剂
液氮：南充宏图工业气体有限公司；DNA 提取试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂、PCR 产物回收试剂盒、琼脂糖（分析纯）：天根生化科技（北京）有限公司；智能交通系统（intelligent transportation system，ITS）分析引物ITS4/ITS5：生工生物工程（上海）股份有限公司；溴化钾（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640 完全培养液、双抗、胎牛血清、胰蛋白酶（6.5×105 U/L）：美国Gibco 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美国默克公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）：上海碧云天生物技术有限公司；小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7 细胞株、B 细胞Raji细胞株、T 细胞Jurkat 细胞株：中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。
1.1.3 试验仪器
生物安全柜（SE-CJ-1F）：苏州安泰空气技术有限公司；超微量紫外分光光度计（NanoDrop 2000）、傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet 5700）、CO2 恒温培养箱（3111）、Epoch 酶标仪（Multiskan Go）：美国Thermo Fisher Scientific 公司；PCR 仪（Thermal Cycler 2720）：美国应用生物系统公司；化学凝胶成像系统（Chemi Doc XR+）：美国BIO-RAD 公司；电子天平（BSA224S）：奥豪斯仪器（上海）有限公司；全自动压力蒸汽灭菌锅（LDZX-30FA）：上海申安医疗器械有限公司；显微镜（DP72）：日本奥林巴斯公司；冰箱（BCD-521WDPW）：青岛海尔股份有限公司。
1.2 菌株纯化
采用组织分离法得到野生子实体的马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）纯培养物。经过3 次纯化（恒温培养箱中25 ℃避光培养，待菌丝长至培养皿2/3 处进行下一次转接）培养获得菌丝纯培养物，保藏于4 ℃冰箱备用。
1.3 花脸香蘑E70 菌种鉴定
采用形态学和分子生物学相结合的方式对花脸香蘑E70 菌株进行鉴定。
1.3.1 形态学鉴定
通过观察新鲜子实体的颜色、形状、大小、菌盖直径、厚度、菌柄长度、粗度以及生长方式等形态特征对其进行形态鉴定，对照图谱、手册等工具书进行初步鉴定。
1.3.2 分子生物学鉴定
称取1 g 菌丝体，按照DNA 提取试剂盒说明书提取花脸香蘑E70 菌丝体的总DNA。用琼脂糖凝胶电泳分析降解程度以及污染情况，用NanoDrop 检测浓度和纯度。以上检测合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA 测序。测序结果登录美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）与GenBank 中已知菌种进行BLAST比对，下载相似度高的ITS 序列，用Clustal W 进行序列比对，MEGA 7.0 软件构建系统发育树，进行系统发育分析。
1.4 花脸香蘑E70 菌株液体摇瓶培养
1.4.1 培养基配制
1.4.1.1 固态基础培养基
200 g 去皮、切片的马铃薯煮20～30 min，至薯片软而不烂，用8 层纱布过滤，取滤液。将马铃薯滤液重新加入锅中，补水至1 000 mL，继续加热沸腾后加入20 g琼脂和20 g 葡萄糖，待样品全部溶解后，倒出，分装，于高压灭菌锅灭菌15 min。
1.4.1.2 液体基础培养基
采用PDA 培养基，具体配方：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL。操作同上。
1.4.2 菌株活化
将高压灭菌后的PDA 固体培养基倾倒至培养皿中，待冷却凝固，挑取花脸香蘑E70 菌丝接到固态基础培养基上，于25 ℃恒温培养，待菌丝长满平面。
1.4.3 摇瓶培养
取150 mL 三角瓶，每瓶装入50 mL 液体基础培养基，于120 ℃、100 kPa 条件下灭菌15 min。将活化后的菌块用刀片切成均等大小的小菌块接种至三角瓶中，摇床培养至长出菌丝球。
1.5 花脸香蘑E70 菌株胞外多糖发酵培养条件优化
1.5.1 单因素实验
取150 mL 三角瓶，每瓶装入50 mL 液体基础培养基，于120 ℃、100 kPa 条件下灭菌15 min。将活化后的菌块切成均等大小的小菌块接种至三角瓶中，在不同环境条件（接种量、温度、转速）下培养，摇床培养至长出菌丝球，测量发酵液中胞外多糖含量。
1.5.2 多糖含量测定
参照任丽蓉等[11]的方法测定胞外多糖含量。
配制葡萄糖标准液（200 mg/L），精确称量110 ℃恒重的葡萄糖20.0 mg，用水溶解，定容至100 mL。精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分别置于100 mL 量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。
标准曲线的制备：分别精密量取上述稀释液和去离子水各70 μL 置于96 孔比色板中，各孔分别加浓硫酸175 μL，反应20 min，加入5% 新配制的苯酚溶液35 μL，反应15 min。以上述70 μL 去离子水所制得的空白溶液为对照，于490 nm 波长处测定各溶液吸光度，以葡萄糖稀释液的浓度（mg/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
花脸香蘑E70 发酵液多糖含量：吸取70 μL 离心后的发酵液上清溶液，按照上述方法，以无菌去离子水为空白对照，测定胞外多糖的吸光度。
1.6 花脸香蘑E70 菌株胞外多糖提取
将花脸香蘑E70 发酵液离心（7 850 r/min、4 ℃、10 min）后，取上清液减压浓缩至原体积的1/3 后，加4 倍体积的无水乙醇搅拌混合，静置过夜，离心（7 850 r/min、4 ℃、10 min）收集沉淀，透析、冷冻干燥后得胞外多糖粗提取物，命名为E70-P。
1.7 傅里叶变换红外光谱检测
称取2 mg 的E70-P 和200 mg 的溴化钾，混合，研磨，压片后，置于傅里叶变换红外光谱仪中，以4 000～400 cm-1 的波数范围对压片进行扫描。
1.8 花脸香蘑E70 菌株胞外多糖的免疫调节活性
将处于对数生长期、状态良好的B 细胞、T 细胞和巨噬细胞，消化稀释至密度为1×105 个/mL 后以每孔100 μL 接种到96 孔板上，为避免边缘效应在边缘孔加入200 μL 磷酸盐缓冲液，置于37 ℃、浓度5% 的CO2 培养箱中孵育24 h。
免疫活性实验：用RPMI-1640 完全培养液配制不同浓度的E70-P 溶液（1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL）后依次加入100 μL 到96 孔板上为实验组，空白组（CK）加入100 μL 的细胞培养液，阳性组加入100 μL 质量浓度为5 μg/mL 的脂多糖（LPS）溶液。加入CCK-8 溶液，使用酶标仪在波长450 nm 处测定吸光度，并放置在显微镜下观察细胞形态。按公式（1）计算细胞增殖率。
式中：p 为细胞增殖率，%；D0 为培养液平均吸光度；D1 为空白组平均吸光度；D2 为药物组或阳性组平均吸光度。
1.9 数据处理
实验结果采用单因素方差分析进行统计学分析，采用Tukey 法进行显著性检验。采用GraphPad Prism 8 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 菌种鉴定
2.1.1 形态鉴定
花脸香蘑E70 子实体形态图见图1。
图1 花脸香蘑E70 子实体形态
Fig.1 Fruiting body morphology of Lepista sordida E70
由图1 可知，花脸香蘑E70 子实体呈紫色，中等偏小。菌盖直径3.0～7.5 cm，表现为近圆形，表面光滑，中间浅紫色，边缘深紫色，边缘内卷，呈波状或瓣状，且具有不明显的条纹。菌褶呈淡紫色，较稀，直生或弯生，延生，不等长。菌肉带淡紫色，薄。菌柄同菌盖色，长3.0～6.5 cm，粗0.2～1.0 cm，靠近基部常弯曲，实心。菌肉具有芳香气味。结合《中国大型真菌》初步鉴定为花脸香蘑[12]。
2.1.2 分子生物学鉴定
取50 μL PCR 扩增后的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。
图2 花脸香蘑E70 ITS-PCR 检测电泳图
Fig.2 ITS-PCR electrophoretic image for detection of Lepista sordida E70
由图2 观察到DNA 样品条带清晰、明亮、无杂质，产物回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
PCR 产物扩增长度为碱基656 bp。将获得的ITS序列上传至NCBI 获得序列号OQ727395。以口蘑属（Tricholoma）为外群，进行系统发育树的构建。花脸香蘑E70 序列测定结果见图3。
图3 基于rDNA ITS 构建的花脸香蘑E70 系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of Lepista sordida E70 based on rDNA ITS
由图3 可知，香蘑属内多个菌株聚成2 支，其中OQ727395 与香蘑属（Lepista）、花脸香蘑种（sordida）处于同一分支，与其他类群明显分开。其中，OQ727395与印度的花脸香蘑基因序列同源性为98.84%。结合形态特征，可以将E70 菌株鉴定为花脸香蘑。
2.2 花脸香蘑E70 菌株菌落和菌丝生长情况
花脸香蘑E70 菌株菌落生长特征见图4。
图4 花脸香蘑E70 菌株菌落生长特征
Fig.4 Colony growth characteristics of Lepista sordida E70
25 ℃培养箱条件下，花脸香蘑E70 菌株长满培养皿的时间为14 d，由图4 可知，菌落在PDA 培养基上初为白色，后变为淡紫色，菌丝浓密呈绒毛状。菌落生长速度为6.45 mm/d。进一步计算菌落面积，结果显示菌落面积增长极高度显著（P＜0.000 1），说明花脸香蘑E70 菌株长势良好，可进行下一步液体摇瓶培养。
花脸香蘑E70 菌株菌丝直径生长特征如图5 所示，菌丝生长特征如图6 所示。
图5 花脸香蘑E70 菌株菌丝直径生长特征
Fig.5 Mycelial diameter growth characteristics of Lepista sordida E70
图6 花脸香蘑E70 菌株菌丝生长特征
Fig.6 Mycelial growth characteristics of Lepista sordida E70
由图5、图6 可知，花脸香蘑E70 菌株的菌丝形态为无色透明，具有锁状联合结构。菌丝直径大小在生长过程中无显著性差异，但菌丝生长速率表现为先增加后减小并逐步趋于稳定。
2.3 花脸香蘑E70 菌株产胞外多糖培养条件初筛结果分析
2.3.1 接种量对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量影响
接种量对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量影响如图7 所示。
图7 接种量对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响
Fig.7 Effect of inoculum amount on the extracellular polysaccharide yield of Lepista sordida E70
由图7 可知，接种量对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量存在明显影响。随接种量的增加，胞外多糖含量呈现先增加后减少的趋势。当接种量为5 个（0.1 cm2/个）时，花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量为（3.04±1.18）g/L；接种量为20 个时，花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量最大，为（5.49±0.71）g/L；接种量为30 个时，花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量为（4.63±0.91）g/L。最终选择20 个接种量开展进一步实验。
2.3.2 温度对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响
温度对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响如图8 所示。
图8 温度对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响
Fig.8 Effect of temperature on the extracellular polysaccharide yield of Lepista sordida E70
由图8 可知，温度为15～40 ℃时，均可产生胞外多糖，15 ℃时，胞外多糖含量为（0.51±0.06）g/L。随温度上升，胞外多糖含量增加，当温度为25 ℃时，胞外多糖含量最高，为（5.46±0.57）g/L。30～40 ℃时，胞外多糖含量下降，40 ℃时，胞外多糖含量为（4.33±0.44）g/L。最终选择25 ℃作为最佳培养温度。
2.3.3 转速对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响
转速对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响如图9 所示。
图9 转速对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量的影响
Fig.9 Effect of rotational speed on the extracellular polysaccharide yield of Lepista sordida E70
由图9 可知，转速140 r/min 时，花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量为（3.14±0.13）g/L；转速180 r/min 时，胞外多糖含量为（6.07±0.26）g/L；转速240 r/min 时，胞外多糖含量为（3.51±0.70）g/L。结果表明，转速过高或过低均不利于花脸香蘑E70 菌株胞外多糖的积累，花脸香蘑E70 产胞外多糖的最佳转速为180 r/min。
2.4 E70-P 的傅里叶变换红外光谱图分析
花脸香蘑E70 菌株胞外多糖傅里叶变换红外光谱如图10 所示。
图10 花脸香蘑E70 菌株胞外多糖傅里叶变换红外光谱
Fig.10 Fourier transform infrared spectrum of the extracellular polysaccharide of Lepista sordida E70
由图10 可知，在4 000～500 cm-1 范围内有明显信号 峰，3 435.82 cm-1 处 是 O—H 伸 缩 振 动 峰；2 917.12 cm-1 处是—CH2 伸缩振动峰；1 636.34 cm-1 处是
伸缩振动峰；1 471.91 cm-1 处是C—H 面内弯曲振动峰；1 155.50、1 080.23、1 023.49 cm-1 处是C—O伸缩振动峰[13-14]。由此可知，E70-P 具有多糖结构特征。
2.5 花脸香蘑E70 菌株胞外多糖的免疫调控活性分析
2.5.1 E70-P 对巨噬细胞增殖和形态的影响
巨噬细胞是先天性免疫系统中参与免疫反应、炎症和其他稳态过程的单核吞噬细胞[15]。E70-P 对巨噬细胞增殖的影响如图11 所示。
图11 E70-P 对巨噬细胞增殖的影响
Fig.11 Effect of the extracellular polysaccharide of Lepista sordida E70 on the proliferation of macrophages
由图11 可知，与空白组相比，一定浓度范围内的E70-P 和LPS 阳性组对巨噬细胞具有极显著或极高度显著增殖效果（P＜0.01、P＜0.000 1）。在1.25～40 μg/mL的浓度范围内，E70-P 对巨噬细胞的增殖效果先增强后减弱，10 μg/mL 浓度的细胞活力最佳，增殖率为24.16%。以上结果表明E70-P 对正常巨噬细胞无药物毒害作用，且有明显增殖作用。
2.5.2 E70-P 对T 细胞增殖和形态的影响
T 细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞，参与机体的免疫调节[16]。E70-P 对T 细胞增殖和形态的影响如图12 所示。
图12 E70-P 对T 细胞增殖的影响
Fig.12 Effect of the extracellular polysaccharide of Lepista sordida E70 on the proliferation of T cells
由图12 可知，与空白组相比，一定浓度范围内的E70-P 刺激T 细胞24 h 后显示显著促进细胞增殖的作用（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.000 1），当E70-P 终浓度为20、40 μg/mL 时效果优于阳性组（21.14%），40 μg/mL药物组浓度下细胞活力最佳，增殖率达到31.69%，且对正常T 细胞无药物毒性。
2.5.3 E70-P 对B 细胞增殖和形态的影响
B 细胞来源于骨髓的多能干细胞，在体液免疫中通过其表面的B 细胞受体识别并结合抗原，分化产生抗体清除病原体，来达到免疫调节作用[17]。E70-P 对B细胞增殖和形态的影响如图13 所示。
图13 E70-P 对B 细胞增殖的影响
Fig.13 Effect of the extracellular polysaccharide of Lepista sordida E70 on the proliferation of B cells
由图13 可知，与空白组相比，E70-P 各药物组和LPS 阳性组均能显著提高细胞增殖活性（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001、P＜0.000 1），表明E70-P 对B 细胞无损害作用，且随浓度增加，呈现剂量效应关系，40 μg/mL药物组效果最佳，增殖率最高，达65.89%。
3 讨论与结论
野生种质资源的鉴定是对其进行保护性开发和利用的重要前提。传统形态学鉴定法主要以子实体的表型为依据，但香蘑属与口蘑属、杯伞属和金钱菌属之间的形态特征差异不显著，仅凭形态特征无法准确判断。而DNA 条形码分子鉴定依赖不同个体间核苷酸序列的差异，可以实现菌种的准确鉴定和划分[18]。李佳佳[19]利用ITS、IGS、LSU、mtSSU 和EF1-α 等DNA 条形码对香蘑属7 个种、共85 个菌株进行分子生物学鉴定，发现ITS 基因测序成功率最高，为86.36%，且只有ITS 基因准确识别出7 个香蘑属物种。陆欢等[20]也通过ITS 测序将一株供试菌株鉴定为花脸香蘑（Lepista sordida）。本研究从野外采集的子实体中分离出E70菌株，并采用形态学鉴定法和ITS 序列分析法将其鉴定为花脸香蘑（Lepista sordida）。不同野生花脸香蘑菌丝的生长具有差异性，研究其生长特征可以为挖掘更优良菌种提供数据支撑。王红艳等[21]研究发现一株野生香蘑属真菌在最适温度25 ℃时，菌丝生长速度达到最大，为（3.507±0.061）mm/d。隋业璇等[22]以PDA、加富PDA 及改良PDA 3 种固体培养基对野外分离的花脸香蘑菌丝体进行培养，发现菌丝长满培养基的时间分别为18、20、20 d。这与本研究结果存在较大差异，本研究结果发现，野生花脸香蘑E70 菌株长满PDA 培养基的时间为14 d，且菌丝生长速度为6.45 mm/d，说明该菌株的菌丝具有生长速度快、菌丝体粗壮、气生菌丝旺盛等生长优势。
真菌菌丝液体发酵具备周期短、产量高、成本低、安全无污染等优点，在工业生产方面得到广泛应用[23]。不少研究者为促进花脸香蘑菌丝生长优化了培养基配方。唐萌[24]研究发现，对花脸香蘑菌丝生长情况起主要作用的因素是培养基中蔗糖含量，其次是硫酸镁含量，并确定了其最佳培养基组成为蔗糖30 g、硫酸镁1 g、酵母粉6 g、磷酸二氢钾0.1 g。也有学者研究不同转速、温度、接种量对花脸香蘑菌丝体含量的影响，刘法显等[25]以菌种发酵后干生物量为指标，发现影响花脸香蘑发酵的最主要因素是温度。本研究以花脸香蘑E70 菌株菌丝发酵产胞外多糖含量为指标，发现在其产胞外多糖中起主要非营养因素作用的是温度，最佳温度条件为25 ℃，温度过高或过低都会影响酶的活性，从而影响胞外多糖的合成；最佳转速条件为180 r/min，摇瓶转速过小，溶氧量小，跟不上生长需求，转速过大会导致菌丝球过于紧密，限制其生长以及代谢产物的合成；最佳接种量为20 个，接种量过大会导致花脸香蘑E70 菌丝生长过快，营养物质、溶解氧等跟不上生长需求，代谢废物增多，不利于胞外多糖的合成，接种量过小会延长培养时间。在以上条件下，花脸香蘑E70 菌株胞外多糖含量高达（6.07±0.26）g/L，是范敏等[26]采用等离子体诱变、选育的花脸香蘑菌株胞外多糖含量的2.7 倍。
胞外多糖作为一种天然免疫调节剂，能够促进免疫细胞增殖，增强免疫系统对免疫抑制、微生物感染、恶性肿瘤等疾病的治疗效果[27]。马晓颖等[28]采用CCK-8法检测鲍姆纤孔菌胞外多糖对巨噬细胞增殖情况的影响，结果显示50、100、200 μg/mL 浓度范围内巨噬细胞的活力与对照组相比分别增加了20.5%～50%。于悦等[9]研究发现蛹虫草胞外多糖对B 淋巴细胞的增殖有促进效果，且高剂量组效果更佳。而花脸香蘑是名贵食用菌品种之一，具有很高的食用和药用价值，其胞外多糖也表现出了良好的免疫调节作用[29]。胡欣蕾等[30]将花脸香蘑胞外多糖作用于小鼠巨噬细胞，发现浓度为1.6 mg/mL 时，巨噬细胞的存活率最佳，为145.14%，且能够显著促进肿瘤坏死因子和白介素-6 的分泌（P＜0.05）。本研究从花脸香蘑E70 菌株菌丝发酵液中提取出花脸香蘑E70 菌株胞外多糖（E70-P），并对其免疫调节活性进行探究，发现对巨噬细胞增殖效果最佳的E70-P 浓度为10 μg/mL，增殖率为24.16%（P＜0.01）；对T 细胞和B 细胞增殖效果最佳的E70-P 浓度为40 μg/mL，增殖率分别达到31.69% 和65.89%（P＜0.000 1），进一步证实了E70-P 具有增强免疫的作用。
综上所述，本研究通过ITS 序列鉴定由达州农科院野外采集、分离的E70 菌株为花脸香蘑（Lepista sordida），其胞外多糖可通过深层发酵快速获得。非营养因子对花脸香蘑E70 菌株胞外多糖合成有明显的影响，高产胞外多糖最佳非营养因子为接种量20 个、温度25 ℃、转速180 r/min。傅里叶变换红外光谱结果显示E70-P 具有典型的多糖信号峰，对其开展免疫调节活性研究，结果显示E70-P 对巨噬细胞RAW 264.7、T 细胞和B 细胞均无细胞毒性作用，且能够明显提高细胞增殖率，最高可达65.89%。研究结果为人工开发利用花脸香蘑E70 菌株胞外多糖提供依据。
[1] 戴玉成, 周丽伟, 杨祝良, 等. 中国食用菌名录[J]. 菌物学报,2010,29(1):1-21.DAI Yucheng, ZHOU Liwei, YANG Zhuliang, et al. A revised checklist of edible fungi in China[J]. Mycosystema, 2010, 29(1): 1-21.
[2] 胡先运,李香莉,张勇民,等.花脸香蘑菌丝体氨基酸分析[J].氨基酸和生物资源,2007,29(1):51-52.HU Xianyun, LI Xiangli, ZHANG Yongmin, et al. Analysis of amino acids in Lepista sordida mycelia[J]. Biotic Resources, 2007,29(1):51-52.
[3] 胡先运,江家志,罗心毅.花脸香蘑子实体蛋白质营养评价[J].氨基酸和生物资源,2011,33(4):55-57.HU Xianyun, JIANG Jiazhi, LUO Xinyi. Protein nutrition evaluation in Lepista sordida fruiting body[J]. Biotic Resources, 2011, 33(4):55-57.
[4] 孟玲,黄芳,赵晨,等.花脸香蘑发酵全液多糖提取条件的研究[J].食用菌学报,2009,16(4):61-63.MENG Ling,HUANG Fang,ZHAO Chen,et al.Optimization of parameters affecting polysaccharide extraction from submerged cultures of Lepista sordida[J].Acta Edulis Fungi,2009,16(4):61-63.
[5] MAZUR X, BECKER U, ANKE T, et al. Two new bioactive diterpenes from Lepista sordida[J]. Phytochemistry, 1996, 43(2): 405-407.
[6] 柏秋月,邓百万,杨学英,等.4 株羊肚菌胞外多糖含量及其生物活性的研究[J].食品研究与开发,2020,41(8):25-31.BAI Qiuyue, DENG Baiwan, YANG Xueying, et al. Study on extracellular polysaccharide content and biological activity of four Morchella strains[J]. Food Research and Development, 2020, 41(8):25-31.
[7] 王珊珊,孙敏,王永霞,等.鸡腿蘑胞外多糖的形貌结构及分子量动态变化与抗氧化的相关性研究[J].生物技术通报,2021,37(2):129-137.WANG Shanshan,SUN Min,WANG Yongxia,et al.Correlation detween the dynamic changes of morphological structure and molecular weight of Coprinus comatus extracellular polysaccharides and their antioxidant activity[J]. Biotechnology Bulletin, 2021, 37(2):129-137.
[8] 张嫱.木蹄层孔菌胞外多糖的结构表征、化学修饰及生物活性研究[D].合肥:合肥工业大学,2022.ZHANG Qiang. Structure characterization, modification and bioactivities of exopolysaccharide from Fomes fomentarius[D].Hefei:Hefei University of Technology,2022.
[9] 于悦,陈卓,王亚非,等.蛹虫草胞外多糖的制备、结构分析及其免疫活性[J].食品科学,2021,42(23):106-113.YU Yue, CHEN Zhuo, WANG Yafei, et al. Preparation, structure and immune modulatory activity of exopolysaccharide from Cordyceps militaris[J].Food Science,2021,42(23):106-113.
[10] 赵辉,孙传齐,何雪梅,等.花脸香蘑菌株‘达香蘑1 号’选育[J].食用菌学报,2022,29(5):43-52.ZHAO Hui, SUN Chuanqi, HE Xuemei, et al. Breeding of Lepista sordida strain'Daxiangmo-1'[J].Acta Edulis Fungi,2022,29(5):43-52.
[11] 任丽蓉,樊莹润,李泽林,等.金耳多糖对环磷酰胺诱导免疫低下小鼠的保护作用[J].食品研究与开发,2023,44(9):85-90.REN Lirong, FAN Yingrun, LI Zelin, et al. Protective effect of Tremella aurantialba polysaccharide on cyclophosphamide-induced immunocompromised mice[J]. Food Research and Development,2023,44(9):85-90.
[12] 卯晓岚.中国大型真菌[S].郑州:河南科学技术出版社,2000.MAO Xiaolan. The macrofungi in China[S]. Zhengzhou: Henan Science and Technology Press,2000.
[13] 李运,张霁,刘飞,等.FTIR 结合SVR 对三七总多糖含量快速预测[J].光谱学与光谱分析,2018,38(6):1696-1701.LI Yun, ZHANG Ji, LIU Fei, et al. Prediction of total polysaccharides content in P. notoginseng using FTIR combined with SVR[J].Spectroscopy and Spectral Analysis,2018,38(6):1696-1701.
[14] 沈诗钰,孙威江,唐琴,等.基于近红外光谱技术的白茶可溶性糖总量快速测定研究[J].天然产物研究与开发,2019,31(1):16-23.SHEN Shiyu, SUN Weijiang, TANG Qin, et al. Rapid determination of total water-soluble sugars in white tea by near-infrared spectroscopy[J]. Natural Product Research and Development, 2019, 31(1):16-23.
[15] LIU Y F,ZHANG J S,TANG Q J,et al.Physicochemical characterization of a high molecular weight bioactive β-D-glucan from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum[J]. Carbohydrate Polymers,2014,101:968-974.
[16] DONG C. Cytokine regulation and function in T cells[J]. Annual Review of Immunology,2021,39:51-76.
[17] MAURI C, BOSMA A. Immune regulatory function of B cells[J].Annual Review of Immunology,2012,30:221-241.
[18] 岳万松,刘绍雄,李雪松,等.花脸香蘑菌株ITS 序列分析及二级结构预测[J].中国食用菌,2021,40(10):64-70.YUE Wansong, LIU Shaoxiong, LI Xuesong, et al. Analysis of ITS sequence and secondary structure prediction of Lepista sordida strains[J].Edible Fungi of China,2021,40(10):64-70.
[19] 李佳佳. 香蘑属DNA 条形码的研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学,2017.LI Jiajia. The research on DNA barcode of Lepista[D]. Shenyang:Shenyang Agricultural University,2017.
[20] 陆欢,王小艳,尚晓冬,等.不同碳氮源对花脸香蘑胞外酶活性的影响[J].菌物学报,2021,40(12):3286-3303.LU Huan, WANG Xiaoyan, SHANG Xiaodong, et al. Effects of different carbon and nitrogen sources on extracellular enzyme activities of Lepista sordida[J].Mycosystema,2021,40(12):3286-3303.
[21] 王红艳,孔维祎,王竹青,等.一株野生香蘑属真菌的鉴定及其生物学性质[J].贵州农业科学,2019,47(6):55-58.WANG Hongyan, KONG Weiyi, WANG Zhuqing, et al. Identification and biological characteristics of a wild mushroom Lepista sp.[J].Guizhou Agricultural Sciences,2019,47(6):55-58.
[22] 隋业璇,徐伟良,李春冬,等.一株草原野生花脸香蘑菌种培养基的筛选研究[J].农业与技术,2023,43(3):14-17.SUI Yexuan, XU Weiliang, LI Chundong, et al. Screening of culture medium for a wild Lentinus edodes strain in grassland[J]. Agriculture and Technology,2023,43(3):14-17.
[23] CASILLO A, LANZETTA R, PARRILLI M, et al. Exopolysaccharides from marine and marine extremophilic bacteria: Structures,properties, ecological roles and applications[J]. Marine Drugs,2018,16(2):69.
[24] 唐萌.花脸香蘑的液体发酵条件筛选及多糖提取方法优化[D].长春:吉林大学,2017:1-64.TANG Meng. Optimization of fermentation conditions and extracting methods of polysaccharides from Lepista sordida[D]. Changchun:Jilin University,2017:1-64.
[25] 刘法显,于长青,姚笛,等.花脸香蘑菌丝体发酵条件的优化[J].食品研究与开发,2016,37(22):169-172.LIU Faxian, YU Changqing, YAO Di, et al. Optimization of Lepista sordida mycelia fermentation conditions[J]. Food Research and Development,2016,37(22):169-172.
[26] 范敏,王丽宁.等离子体诱变选育高产胞外多糖花脸香蘑菌株[J].生物技术通报,2021,37(11):119-124.FAN Min, WANG Lining. Breeding of Lepista sordida with highyield exopolysaccharide by plasma mutagenesis[J]. Biotechnology Bulletin,2021,37(11):119-124.
[27] 王姣姣, 袁平川, 许寒池, 等. 禾谷镰刀菌胞外多糖诱导SGC-7901 细胞凋亡作用及其机制研究[J]. 天然产物研究与开发,2022,34(7):1204-1212.WANG Jiaojiao, YUAN Pingchuan, XU Hanchi, et al. Mechanism of apoptosis induced by exopolysaccharides from Fusarium graminearum on SGC-7901 cells[J].Natural Product Research and Development,2022,34(7):1204-1212.
[28] 马晓颖, 肖军, 龚娜, 等. 基于LPS 炎症模型探究鲍姆纤孔菌(Sanghuangporus baumi)菌丝多糖对巨噬细胞RAW 264.7 的免疫调节作用[J].食品工业科技,2023,44(20):407-413.MA Xiaoyin, XIAO Jun, GONG Na, et al. The immunomodulatory effect of polysaccharide extracted from Sanghuangporus baumi mycelia in LPS-induced RAW264.7 macrophages[J]. Science and Technology of Food Industry,2023,44(20):407-413.
[29] 刘法显. 花脸香蘑液体发酵及其多糖的提取和免疫活性初步研究[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2016.LIU Faxian. Lepista sordida liquid fermentation and polysaccharide extraction and preliminary study on immunological activity[D].Daqing:Heilongjiang Bayi Agricultural University,2016.
[30] 胡欣蕾,田雪梅,李文香,等.花脸香蘑菌丝体多糖提取条件优化及其体外免疫活性[J].食品科学,2017,38(20):185-190.HU Xinlei, TIAN Xuemei, LI Wenxiang, et al. Extraction and immune modulatory activities in vitro of polysaccharides from Lepista sordida mycelia[J].Food Science,2017,38(20):185-190.