樱桃李多糖提取工艺优化及单糖组成与抗氧化活性测定

罗世博1,热合巴提·努尔夏提1,王俊龙1,辛吴玮2,曹磊1,冯琳1,刘伟1*

(1.伊犁师范大学新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验室,新疆 伊宁 835000;2.新疆天宏润生物科技有限公司,新疆 昌吉 831108)

摘 要:为确定樱桃李多糖的最佳提取工艺,比较热水提取法、酶解法和超声辅助法对多糖提取率的影响,通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察不同提取方式所得樱桃李纯化多糖(Prunus cerasifera pure polysaccharides,PCPPs)的微观结构。在正交试验确定复合酶质量比的基础上,采用单因素结合正交试验优化复合酶法提取樱桃李粗多糖(Prunus cerasifera crude polysaccharides,PCCPs)的最佳工艺为纤维素酶添加量2.0%、果胶酶添加量2.5%、料液比1∶35(g/mL)、酶解时间2.0 h、酶解温度55 ℃。以种植的紫果、红果和野生的紫果、红果为原料,将最佳提取工艺下得到的PCCPs 经纯化、水解、衍生化后,采用液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)分析单糖组成。结果表明,4 种樱桃李多糖均由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 种单糖组成,但含量存在显著差异(P<0.05)。体外抗氧化试验表明,4 种多糖均具有一定的抗氧化能力,其中种植紫果的抗氧化活性最强,对DPPH 自由基和ABTS+自由基清除的IC50值分别为0.04 mg/mL 和0.21 mg/mL。

关键词:樱桃李;多糖;工艺优化;单糖;抗氧化活性

樱桃李(Prunus cerasifera)为蔷薇科李属小乔木,野生种在我国分布于新疆伊犁霍城县大、小西沟海拔1 000~1 600 m 的坡谷地带,是我国珍稀野生植物资源,目前在霍城地区已有上万亩樱桃李人工栽培基地[1],樱桃李因其极高的营养价值和特殊的口感被当地哈萨克牧民所喜食。果实中含有丰富的维生素、氨基酸等营养成分,主要呈红色、紫色和黄色3 种颜色[2]。张静茹等[3]采用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)法对13 份樱桃李资源分析表明,不同颜色果实中均含有槲皮素糖苷、儿茶素、原花青素等多酚类物质;Wang 等[4]对栽培的不同颜色果实的花色苷进行液相色谱质谱联用(high-performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLCMS)分析发现,其主要成分为矢车菊糖苷类化合物,但含量差异显著,紫果提取物中花青素含量最高,其抗氧化活性优于红果和黄果。

多糖是存在于生物体内的由不同单糖组成的天然大分子有机物质,具有丰富的化学结构和抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和免疫调节等生物活性[5-7]。但目前关于樱桃李果实的多糖含量及单糖组成等方面的研究鲜有报道。本研究以野生、栽培樱桃李紫色和红色果实为研究对象,通过扫描电镜比较热水提取法、酶解法和超声辅助法对纯化多糖微观结构的影响;以多糖提取率为评价指标,采用单因素结合正交试验优化提取工艺;通过水解和衍生化工艺及HPLC 分析其单糖组成和含量差异;采用DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力评价多糖提取物的抗氧化活性,以期为樱桃李的综合开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樱桃李:伊犁霍城县大西沟;乙醇、石油醚(均为分析纯):天津市大茂化学试剂厂;三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate,ABTS]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、抗坏血酸(ascorbic acid,VC)(均为分析纯):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;葡萄糖(Glc)标准品、葡萄糖醛酸(GlcA)标准品、半乳糖(Gal)标准品、半乳糖醛酸(GalA)标准品、岩藻糖(Fuc)标准品、阿拉伯糖(Ara)标准品、甘露糖(Man)标准品、鼠李糖(Rha)标准品(纯度均>98%)、果胶酶(500 U/mg)、纤维素酶(200 U/mg):上海士锋生物科技有限公司。

旋转蒸发仪(Heidolph):香港德祥科技有限公司;多管架自动平衡离心机(TDZ5-WS):长沙湘仪离心机仪器有限公司;数显恒温水浴锅(HH-S1):金坛市医疗仪器厂;酶标仪(Spectra Max M5):美国赛默飞世尔科技公司;高效液相色谱仪(Primaide):日立仪器有限公司;精密鼓风干燥箱(BAO-150A):施都凯仪器设备有限公司;冷冻干燥箱(LGJ-10N):北京亚星仪科科技有限公司;扫描电子显微镜(SEM5000):日本电子株式会社。

1.2 试验方法

1.2.1 樱桃李预处理

樱桃李去核冷冻干燥48 h、粉碎、过60 目筛,以石油醚和乙醇脱脂脱色,备用。

1.2.2 樱桃李多糖的提取

分别称取5 g 预处理樱桃李粉末采用热水提取法[8][料液比1∶40(g/mL),90 ℃,2 h]、酶解法[9][纤维素酶2.5%,果胶酶0.4%,酶解温度50 ℃,1 h,料液比1∶40(g/mL)]和超声辅助法[8][料液比1∶20(g/mL),超声温度50 ℃,250 W,1 h]提取,抽滤,收集滤液,得到樱桃李粗多糖(PCCPs)提取液。

1.2.3 樱桃李多糖的纯化

将樱桃李粗多糖提取液浓缩,加入4 倍体积的乙醇,4 ℃,静置12 h,4 000 r/min 离心10 min,沉淀重新溶于水中,采用Sevage 法[三氯甲烷∶正丁醇=3∶1(体积比)]脱蛋白,取上层的多糖溶液装入截留量为3 000 Da 的透析袋中,透析48 h,真空冷冻干燥,得到樱桃李纯化多糖(PCPPs)。

1.2.4 多糖含量的测定

参考王文韬等[10]的方法以葡萄糖为标准品,采用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量,在620 nm 波长下测定其吸光度,将1.2.2 得到的樱桃李多糖提取液稀释到一定浓度,代入葡萄糖标准曲线y=0.001 5 x+0.047 5,R2=0.999 2。按式(1)计算樱桃李粗多糖提取率(Y,%),式(2)计算樱桃李纯化多糖含量(W,%),式(3)计算樱桃李纯化多糖的提取率(X,%)。

式中:C 为代入标准曲线多糖的质量浓度,mg/mL;V 为样品液的体积,mL;n 为样品液的稀释倍数;m 为预处理后樱桃李的质量,g;m1 为纯化多糖质量,g。

1.2.5 不同提取方式多糖微观结构分析

参考Qiu 等[11]的方法取冷冻干燥的樱桃李纯化多糖,用导电胶带黏附于导电探板上,金溅射喷金60 s后通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)在15 kV 下观察不同提取方法所得樱桃李纯化多糖的微观形态特征。

1.2.6 酶用量单因素试验

参考刘子骐等[12]的方法,采用双酶法以种植红果为原料提取樱桃李粗多糖,固定酶解温度50 ℃,酶解时间2 h,料液比1∶20(g/mL)。准确称取0.5 g 樱桃李粉末,选择纤维素酶和果胶酶质量比为0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%进行单因素试验。

1.2.7 酶用量正交试验

根据单因素试验结果,设计正交试验筛选出最佳复合酶配比,因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factor level design of orthogonal experiment

水平A 纤维素酶用量/%B 果胶酶用量/%1 2 3 1.0 1.5 2.0 1.5 2.0 2.5

1.2.8 复合酶提取工艺单因素试验

参考赵茹等[13]方法,选取料液比[1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)]、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h),对复合酶提取法进一步优化,其中各因素水平为料液比1∶20(g/mL)、酶解温度50 ℃、酶解时间2.0 h。

1.2.9 复合酶提取工艺正交试验

根据单因素试验结果,设计正交试验筛选出最佳复合酶提取条件,因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平设计
Table 2 Factor level design of orthogonal experiment

水平X 酶解温度/℃Y 料液比/(g/mL)Z 酶解时间/h 1 2 3 45 50 55 1∶30 1∶35 1∶40 1.0 1.5 2.0

1.2.10 单糖分析

1.2.10.1 多糖水解

参考Liu 等[14]方法稍加改动,准确称取樱桃李多糖5.0 mg 至10 mL 密封瓶中,加入5 mL、2 mol/L TFA,115 ℃水解6 h。水解后少量多次加入甲醇,直至TFA挥发完全,加2.0 mL 水复溶。

1.2.10.2 单糖衍生化

参考黄小兰等[15]方法稍加改动,分别精确吸取100 μL 樱桃李纯化多糖水解液和2 mg/mL 的Man、Rha、GalA、GlcA、Gal、Glc、Ara、Fuc 单糖标准品溶液,加 入100 μL、0.6 mol/L NaOH 和200 μL、0.5 mol/L PMP-甲醇溶液,70 ℃反应1.4 h。冷却至室温后加入200 μL、0.3 mol/L HCl 中和,再加入相同体积的二氯甲烷涡漩1 min,萃取5 次,取上清液用于HPLC 分析。

1.2.10.3 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipes XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温27 ℃、流速0.8 mL/min、检测波长245 nm、进样量20 μL、流动相为0.1 mol/L 磷酸钠缓冲溶液(pH 值为6.89)∶乙腈=83∶17(体积比)。

1.2.10.4 线性关系

精密量取20 μL 各衍生化的单糖标准品溶液,均匀混合,分别进样10、15、20、25、30 μL,按照“1.2.10.3”的条件进行测定,以单糖质量为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,计算相关系数,结果见表3。

表3 单糖线性关系考察
Table 3 Linear relationship of different monosaccharides

单糖标准品Man GlcA Rha GalA Glc Gal Ara Fuc标准曲线y=0.147 06 x+0.003 75 y=0.129 56 x+0.011 65 y=0.139 58 x+0.007 37 y=0.124 41 x+0.010 13 y=0.119 91 x+0.011 43 y=0.145 94 x+0.020 09 y=0.202 29 x+0.015 91 y=0.113 45 x+0.015 91 R2 0.999 9 0.999 5 0.997 7 0.999 7 0.999 6 0.997 8 0.999 6 0.999 0线性范围/μg 0.429 2~1.287 5 0.416 7~1.250 1 0.425 0~1.275 0 0.429 2~1.287 5 0.429 2~1.287 5 0.433 3~1.299 9 0.437 5~1.125 0 0.416 7~1.250 1

1.2.11 不同种类樱桃李多糖抗氧化活性测定

1.2.11.1 DPPH 自由基清除活性

参考Zhang 等[16]的方法,分别取50 μL 不同浓度待测样品溶液置于酶标板中,加入100 μL、0.15 mmol/L的DPPH 自由基溶液,于室温避光反应30 min 后,在517 nm 处测定样品的吸光值。DPPH 自由基清除率的按下列公式计算。

式中:X 为DPPH 自由基清除能力,%;As 为含所有试剂的吸光值;Aj 为样品空白组的吸光值;Ac 是用水代替多糖溶液的反应体系的吸光值。

1.2.11.2 ABTS+自由基清除能力

室温下配制7 mmol/L ABTS 试剂和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液,等体积混合后避光反应12 h,用蒸馏水稀释至734 nm 处吸光值为0.7 左右。取50 μL 不同浓度的樱桃李多糖溶液,加入150 μL ABTS 工作液在酶标板中混匀,室温下避光反应6 min,以VC 为对照品,734 nm 处测定吸光值,ABTS+自由基清除率按下列公式计算。

式中:Y 为ABTS+ 自由基清除能力,%;As 为含所有试剂的吸光值,Ac 为样品溶液被水替代的反应体系的吸光值;Aj 为ABTS+工作液被蒸馏水替代的反应体系的吸光值。

1.3 数据处理

试验重复3 次,结果采用平均值±标准差的形式表示,采用Origin 8.5 软件绘图,采用IBM SPSS Statistics 26 软件对数据进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对樱桃李纯化多糖提取率的影响

比较不同提取方式对樱桃李纯化多糖提取率的影响见表4。

表4 不同方法提取樱桃李纯化多糖提取率
Table 4 Extraction rate of PCPPs extracted by different methods

注:同列不同小写字母表示存在显著性差异(P<0.05)。

纯化多糖含量/%75.93±2.28a 77.40±1.96a 78.11±1.23a提取方法超声辅助提取热水提取酶解法纯化多糖提取率/%6.56±0.42b 6.73±0.17b 8.05±0.14a

由表4 可知,酶解法提取樱桃李纯化多糖提取率显著高于超声辅助提取和热水提取,其中酶解法樱桃李多糖的提取率为(8.05±0.14)%,超声辅助提取樱桃李桃李多糖的提取率为(6.56±0.42)%,热水提取樱桃李桃李多糖的提取率为(6.73±0.17)%。

2.2 不同提取方法多糖微观结构分析

不同提取方式对樱桃李纯化多糖微观结构的影响见图1。

图1 不同提取方式对樱桃李纯化多糖微观结构的影响
Fig.1 Influence of different extraction methods on microstructure of PCPPs

由图1 可知,樱桃李纯化多糖主要以片状分布,且结构比较完整,说明多糖组分聚合紧密且分子之间有较强的相互作用。由图1A 可知,超声辅助提取的樱桃李纯化多糖主要为小块状结构,且片段之间有较多的间隙,这说明超声可以提高细胞壁和细胞膜的破坏速度,从而使多糖溶出。由图1B 可知,热水浸提的纯化多糖样品呈片状结构,表面光滑且具有孔洞结构,结构比较紧密。由图1C 可知,酶解法的纯化多糖为聚集的片状结构,存在大量的细丝分支且相互堆积在一起,这种多分支结构,可能会使樱桃李多糖暴露出更多活性基团,从而具有更好的生物活性[18]。以上结果说明不同提取方法对樱桃李纯化多糖的表观结构有较大的影响。白冰瑶等[17]研究表明热水提取的恰玛古多糖具有片状致密的形貌,而超声提取法呈现出不规则形状,且表面有孔洞、不平整。方嘉沁等[18]研究表明超声提取的莲子心多糖形状更为碎片化,而酶辅助和热水提取法结构较为相似。

2.3 酶用量单因素试验

酶用量对樱桃李粗多糖提取率的影响见图2。

图2 酶用量对樱桃李粗多糖提取率的影响
Fig.2 Influence of enzyme dosage on extraction rate of PCCPs

由图2 可知,随着酶用量的增加,粗多糖提取率也随之增加,当纤维素酶、果胶酶用量分别为1.5% 和2.0% 时,樱桃李粗多糖提取率达到最高,当酶用量继续增加时多糖提取率下降,说明酶用量已接近充分酶解,因此选用纤维素酶用量为1.0%、1.5% 和2.0%,果胶酶1.5%、2.0%和2.5%进行正交试验。

2.4 复合酶正交试验结果分析

复合酶法提取樱桃李多糖的正交试验结果如表5所示,方差分析结果如表6 所示。

表5 复合酶配比正交试验结果
Table 5 Orthogonal experimental results of compound enzyme ratio

试验组A 纤维素酶用量B 果胶酶用量C 空白1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2提取率/%51.33±1.48 54.29±1.14 55.47±2.08 44.70±0.80 49.95±1.10 55.02±0.60 56.81±1.70 55.39±1.21 59.86±2.20 K2 K3 161.09 149.65 172.06 152.84 159.63 170.35

表6 复合酶配比方差分析结果
Table 6 Analysis of variance of compound enzyme ratio

注:**表示影响极显著(P<0.01);*表示影响显著(P<0.05)。

方差来源截距A 纤维素酶用量B 果胶酶用量误差总计Ⅲ类平方和25 025.985 5.211 3.268 1.911 25 260.325自由度1 2 2 2 9均方25 025.985 2.605 1.634 0.955 F 值26 194.039 8.044 5.046 P 值<0.001**0.040*0.081

由表5 和表6 可知,酶的最佳配比为纤维素酶用量2%,果胶酶用量2.5%。其中纤维素酶用量对多糖的提取影响显著(P<0.05),果胶酶用量不显著(P>0.05)。

2.5 复合酶提取单因素试验结果分析

2.5.1 酶解温度对粗多糖提取率的影响

酶解温度对樱桃李粗多糖提取率的影响见图3。

图3 酶解温度对樱桃李粗多糖提取率的影响
Fig.3 Influence of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of PCCPs

由图3 可知,在酶解温度40~45 ℃时其粗多糖提取率随酶解温度的升高而增加,当酶解温度继续升高时,提取率先趋于稳定,当酶解温度超过50 ℃后,樱桃李粗多糖提取率呈下降趋势。由于酶解温度升高,使酶活力增强的同时促进多糖分子运动,从而促进细胞内多糖的释放和溶剂的进入,从而提高粗多糖的溶出,但酶解温度过高会使酶变性,酶活性降低,使粗多糖提取率下降[19]。因此,选择45、50、55 ℃进行正交试验。

2.5.2 酶解时间对粗多糖提取率的影响

酶解时间对樱桃李粗多糖提取率的影响见图4。

图4 酶解时间对樱桃李粗多糖提取率的影响
Fig.4 Influence of enzymatic hydrolysis time on extraction rate of PCCPs

由图4 可知,当酶解时间达到1.5 h 时樱桃李粗多糖的提取率达到最高,随酶解时间的进一步延长,粗多糖提取率呈现降低态势。当酶解刚开始时,酶吸附在提取物的表面,在提取物表面发挥催化作用,随着酶解时间延长酶与底物完全接触,粗多糖提取率趋于稳定;但酶解时间过长,酶活力发生下降,且部分粗多糖发生水解,故粗多糖提取率呈下降趋势[20-21]。因此,选择酶解时间1.0、1.5、2.0 h 进行后续试验。

2.5.3 料液比对粗多糖提取率的影响

料液比对樱桃李粗多糖的影响见图5。

图5 料液比对樱桃李粗多糖的影响
Fig.5 Influence of material-to-liquid ratio on extraction rate of PCCPs

由图5 可知,当料液比为1∶20~1∶35(g/mL)时溶剂用量与樱桃李粗多糖的提取率呈正相关,适当地增加溶剂用量,能扩大多糖在樱桃李内外的浓度差,从而提高溶剂在细胞中的扩散速率,溶出更多的多糖,而当溶剂用量大于1∶35(g/mL)时,粗多糖提取率反而下降,酶与底物接触机会降低,细胞壁降解速度减慢所致[19,22]。因此,选择料液比1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)进行后续试验。

2.6 复合酶提取工艺正交试验结果

复合酶提取工艺正交试验结果见表7。

表7 复合酶提取工艺正交试验结果
Table 7 Orthogonal test results of compound enzyme extraction process

试验组X 酶解温度Y 料液比Z 酶解时间1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2提取率/%49.20±1.47 54.66±4.45 55.80±2.45 45.72±2.48 59.93±2.55 46.77±2.29 56.28±0.50 58.56±2.90 47.68±4.76 K2 K3 k1 k2 k3 R 159.65 152.42 162.52 53.22 50.81 54.17 3.37 151.19 173.15 150.25 50.40 57.72 50.08 7.64 154.53 148.05 172.01 51.51 49.35 57.34 7.99

复合酶提取粗多糖提取率方差分析结果表8。

表8 复合酶提取粗多糖提取率方差分析结果
Table 8 Analysis of variance of extraction rate of crude polysaccharides by compound enzyme method

注:**表示影响极显著(P<0.01);*表示影响显著(P<0.05)。

方差来源模型截距X 酶解温度Y 料液比Z 酶解时间误差总计Ⅲ类平方和232.429 25 025.985 18.061 111.994 102.375 1.911 25 260.325自由度6 1 2 2 2 2 9均方38.738 25 025.985 9.030 55.997 51.187 0.955 F 值40.546 26 194.039 9.452 58.610 53.577 P 值0.024*<0.001**0.096 0.017*0.018*

由表7 可知,樱桃李粗多糖酶解法提取的最优组合是X3Y2Z3,而试验中提取率最高的组合是X2Y2Z3,因此进行验证试验,其提取率为(60.32±1.02)%高于X2Y2Z3 组合,因此确定樱桃李粗多糖的最佳提取工艺为纤维素酶用量2.0%、果胶酶用量2.5%、酶解温度55 ℃、酶解时间2.0 h 和料液比为1∶35(g/mL)。由表8 可知,料液比和酶解时间对多糖的提取率影响显著(P<0.05),酶解温度对提取率的影响不显著(P>0.05)。比较F 值可知,各因素对提取率的影响大小顺序为料液比(Y)>酶解时间(Z)>酶解温度(X)。

2.7 不同种类樱桃李多糖含量测定

不同樱桃李纯化多糖提取率及含量测定结果见表9。

表9 不同樱桃李纯化多糖提取率及含量测定结果
Table 9 Extraction rate and content determination results of PCPPs

注:同列不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。

样品种植紫果(PP)种植红果(PR)野生紫果(WP)野生红果(WR)纯化多糖提取率/%10.25±0.21a 8.25±0.21c 9.07±0.16b 8.48±0.09c纯化多糖含量/%81.69±1.66a 76.01±1.91b 77.07±1.36b 82.31±0.91a

由表9 可知,在最佳提取条件下种植紫果的纯化多糖提取率最高为10.25%,野生红果纯化多糖含量最高为82.31%,其中种植红果纯化多糖的提取率及多糖含量最低,分别为8.25%和76.01%。

2.8 单糖分析

单糖混合标准品与樱桃李单糖组成成分HPLC 结果见图6,樱桃李单糖单糖含量见表10。

图6 单糖混合标准品与樱桃李纯多糖单糖组成成分HPLC 图
Fig.6 HPLC spectrum of mixed standard monosaccharide sample and monosaccharide composition of PCPPs

表10 不同种类樱桃李纯化多糖单糖含量
Table 10 Content of PCPPs in different types%

样品种类Man GlcA Rha Glc Gal Ara单糖总量PP 2.71 7.74 12.80 9.87 13.10 6.34 52.57 PR 3.47 7.60 16.09 9.20 14.20 6.36 56.92 WP 2.78 7.23 18.77 5.41 13.78 6.33 54.30 WR 3.41 7.61 14.22 6.74 11.39 5.54 48.91

由图6 和表10 可知,樱桃李纯化多糖均由Man、GlcA、GalA、Glc、Gal 和Ara 6 种单糖组成,但不同种类樱桃李纯化多糖的单糖含量具有一定的差异,其中PR的单糖含量最高,WP 其次,WR 中单糖含量最低。其中PP 的Gal 的含量最高,占单糖总量的24.92%,其次为Rha、Glc 和GlcA 分别占24.35%、18.77% 和14.72%。PR、WP、WR 中Rha 的含量最高,分别占总单糖的28.27%、34.69%和29.07%。

2.9 抗氧化活性测定结果分析

2.9.1 DPPH 自由基清除活性

DPPH 自由基清除能力见图7。

图7 DPPH 自由基清除能力
Fig.7 DPPH radical scavenging ability

由图7A 可知,樱桃纯化多糖对DPPH 自由基有较强的清除能力,且清除能力均随浓度的升高而不断增强,呈现出明显的剂量效应,但其抗氧化活性低于阳性对照VC 的抗氧化活性,当样品浓度大于3 mg/mL时,PP、PR 和WP 对DPPH 自由基的清除能力达到90%以上;由图7B 可知,PP 对DPPH 自由基的清除能力最强,其IC50 值为0.04 mg/mL,WP、WR 和PR 的IC50 值分别为0.42、1.18、0.73 mg/mL。

2.9.2 ABTS+自由基清除活性

ABTS+自由基清除能力见图8。

图8 ABTS+自由基清除能力
Fig.8 ABTS+radical scavenging ability

由图8A 可知,樱桃李纯化多糖对ABTS+自由基有较强的清除能力,其清除能力能达到90%以上,且呈现出明显的剂量效应。由图8B 可知,PP 对ABTS+自由基的清除能力最高,其IC50 值为0.21 mg/mL,WP、WR和PR 的IC50值分别为0.28、0.55 mg/mL 和0.31 mg/mL。其对ABTS+自由基清除能力顺序为VC>PP>WP>PR>WR,与DPPH 自由基清除能力的结果一致。

3 结论

通过多糖含量测定和SEM 微观结构分析比较热水提取法、酶解法和超声辅助法对樱桃李多糖提取的影响,优化复合酶法提取工艺,最佳工艺为纤维素酶添加量2.0%、果胶酶添加量2.5%、料液比1∶35(g/mL)、酶解时间2.0 h、酶解温度55 ℃,在此条件下种植红果粗多糖提取率达到(60.32±1.02)%。采用HPLC 技术对不同来源樱桃李纯化多糖作进一步分析,结果表明Man、GalA、Rha、Gal、Glc 和Ara 为其主要组成单糖,但含量存在明显差异;樱桃李纯化多糖均表现出一定的体外抗氧化活性。本研究为进一步开发利用樱桃李提供参考依据。

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Optimization of Polysaccharide Extraction Process and Analysis of Monosaccharide Composition and Antioxidant Activity of Prunus cerasifera

LUO Shibo1,NUERXIATI·Rehebati1,WANG Junlong1,XIN Wuwei2,CAO Lei1,FENG Lin1,LIU Wei1*
(1.University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang,Yili Normal University,Yining 835000,Xinjiang,China;2.Xinjiang Tianhongrun Biotechnology Co.,Ltd.,Changji 831108,Xinjiang,China)

Abstract:In order to determine the optimal extraction process of polysaccharides from Prunus cerasifera,the influence of hot water extraction method,enzymolysis extraction method,and ultrasound-assisted extraction method on polysaccharide extraction rate were compared,and the microstructures of pure polysaccharides from Prunus cerasifera(PCPPs)obtained by different extraction methods were observed with scanning electron microscope(SEM).Orthogonal experiment determined the compound enzyme mass ratio,and on this basis,single factor experiments,orthogonal experiments,and compound enzyme methods were combined to optimize the extraction process of crude polysaccharides from Prunus cerasifera(PCCPs)as follows:cellulase dosage of 2.0%,pectase dosage of 2.5%,material-to-liquid ratio of 1∶35(g/mL),enzymatic hydrolysis time of 2.0 h,and enzymatic hydrolysis temperature of 55 ℃. With cultivated purple fruits and red fruits,as well as wild purple fruits and red fruits as raw materials,the monosaccharide composition was analyzed by high-performance liquid chromatography(HPLC)after purification,hydrolysis,and derivatization of the PCCPs obtained by the optimal extraction process.The results showed that four polysaccharides from Prunus cerasifera all consisted of six monosaccharides,including mannose,glucuronic acid,rhamnose,glucose,galactose,and arabinose,but the content of these monosaccharides was significantly different(P<0.05). The results of in vitro antioxidant experiments showed that the four polysaccharides had certain antioxidant activity,among which polysaccharides from cultivated purple fruits showed the strongest antioxidant activity,with the half inhibitory concentration value(IC50)for DPPH and ABTS+radical scavenging of 0.04 mg/mL and 0.21 mg/mL,respectively.

Key words:Prunus cerasifera;polysaccharides;process optimization;monosaccharides;antioxidant activity

DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2024.20.013

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2022D01C455)

作者简介:罗世博(1999—),女(汉),研究生,研究方向:植物资源中活性成分分析。

*通信作者:刘伟(1985—),男(汉),博士,研究方向:天然产物化学。

引文格式:

罗世博,热合巴提·努尔夏提,王俊龙,等.樱桃李多糖提取工艺优化及单糖组成与抗氧化活性测定[J].食品研究与开发,2024,45(20):100-107.

LUO Shibo,NUERXIATI·Rehebati,WANG Junlong,et al. Optimization of Polysaccharide Extraction Process and Analysis of Monosaccharide Composition and Antioxidant Activity of Prunus cerasifera[J]. Food Research and Development,2024,45(20):100-107.

加工编辑:王雪

收稿日期:2023-08-10