睡眠质量对人体的认知能力、免疫系统、情绪稳定、工作效率和生活质量都有很大的影响，充足的睡眠对维持身心健康至关重要[1]。近年来，失眠逐渐成为一个普遍存在的社会健康问题。根据《2022 年中国睡眠指数报告》调查结果显示，受访者日均睡眠时长为7.40 h，近半数受访者的每晚平均睡眠时长不足8 h（47.55%），16.79% 的受访者每晚平均睡眠时长不足7 h，多数居民睡眠时间不足[2]。而长期睡眠不足不仅会导致失忆、易怒、抑郁、注意力不集中、疲劳等认知功能问题的发生，还会增加各种慢性健康问题的患病风险，如肥胖、炎症、糖尿病和心血管疾病[3-4]。
当前大多数失眠症患者通过服用人工合成药物以改善睡眠状况，如苯二氮卓受体激动剂、抗组胺药、唑吡坦和多塞平等，然而，这些药物有一定的副作用，包括药物依赖、记忆丧失、胃肠问题等；长期使用这些药物还会导致肌肉松弛、成瘾、认知障碍和停药反跳性失眠等不良反应[5-6]。因此，探索新的天然植物源生物活性成分来改善睡眠具有重要意义。
核桃为胡桃科植物，又名胡桃、羌桃，具有丰富的营养价值[7]。核桃中含有丰富的酚类化合物，具有抗菌、抗炎症因子、抗衰老和神经保护等功能[8]；此外，核桃中含有丰富的谷氨酸和褪黑素，是一种能够改善睡眠的天然功能食品[9]。辣木（Moringa oleifera）又名油辣木、鼓槌树，是辣木科辣木属多年热带落叶乔木[10]。辣木中含有大量的优质蛋白、氨基酸、维生素以及多酚、黄酮、多糖等功能活性成分，具有极高的营养价值和药用价值[11]。关于辣木的药用价值有很多报道，包括抗癌[12]、抗疲劳[13]、抗炎症[14]、抗氧化[15]以及降血糖和降血脂作用等[16]。研究表明，辣木中的生物活性物质油酸、β-谷甾醇、豆甾醇对小鼠睡眠具有改善作用[17]。因此，本研究以去皮核桃仁和辣木叶发酵提取物为主要原料，通过感官评价和响应面工艺优化，研制一款口感细腻、风味独特的辣木核桃乳；并以雄性美国癌症研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠为受试动物，探究该产品对小鼠睡眠的改善作用，以期为天然植物源助眠产品的开发提供理论依据和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性ICR 小鼠：斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010；GDMCC 1.2685植物乳杆菌、GDMCC 1.791 瑞士乳杆菌：云南农业大学所属的云南省药食同源功能食品工程研究中心。
辣木叶：云南天佑科技开发有限公司；去皮核桃仁：沧州乐开心食品有限公司；巴比妥钠、戊巴比妥钠（均为99%）：昆明莫纳生物科技有限公司；三聚磷酸钠、异抗坏血酸钠、小苏打（均为99%）：河南省万邦实业有限公司；复配增稠稳定剂HBT-A7301：江苏豪蓓特食品有限公司；白砂糖（99%）：昆明康尔利食品有限公司。
1.2 仪器与设备
Cencrifuge 5804 高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；HF-5L 喷雾干燥机：上海贺帆仪器有限公司；SW-CJ-1F 洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DK-S24 电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；ZBJ-020/025/030 型制冰机：商丘艾斯比尔制冷设备有限公司。
1.3 辣木核桃乳的制备
1.3.1 辣木叶发酵提取物的制备
将辣木叶粉与水按质量比1∶10 混合，高温灭菌（121 ℃、15 min），冷却后接种发酵剂，发酵剂为植物乳杆菌和瑞士乳杆菌按体积比1∶1 制得的复合菌种，接种量为总发酵液质量的0.2%，于（40±2）℃条件下发酵48 h，发酵完成取上清液进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度（170±5）℃，流速5 L/h，收集粉末即为辣木叶发酵提取物。
1.3.2 辣木核桃乳的制备
取80 g 去皮核桃仁与水按料液比1∶3（g/mL）混合，胶体磨磨浆后用200 目纱布过滤，得核桃原浆。将核桃原浆置于65 ℃水浴锅上预热，先加入0.6 g 小苏打，再依次加入50 g 白砂糖、16 g 辣木叶发酵提取物、2 g 复配增稠稳定剂、1 g 酪蛋白酸钠、0.5 g 三聚磷酸钠、0.4 g 异抗坏血酸钠，加水定容至1 L，化料15 min后，于均质压力35 MPa 条件下均质5 min，灭菌罐装后即得成品。
1.4 辣木核桃乳工艺优化
1.4.1 单因素试验
以辣木叶发酵提取物添加量、核桃仁添加量、白砂糖添加量为单因素，以感官评分为指标，分别考察当核桃仁添加量为80 g/kg、白砂糖添加量为50 g/kg 时，辣木叶发酵提取物添加量为8、12、16、20、24 g/kg 对产品感官评分的影响；当辣木叶发酵提取物添加量为16 g/kg、白砂糖添加量为50 g/kg 时，核桃仁添加量60、70、80、90、100 g/kg 对产品感官评分的影响；当核桃仁添加量为80 g/kg、辣木叶发酵提取物添加量为16 g/kg 时，白砂糖添加量45、50、55、60、65 g/kg 对产品感官评分的影响。
1.4.2 响应面优化试验
在单因素试验基础上，以X1（辣木叶发酵提取物添加量）、X2（核桃仁添加量）、X3（白砂糖添加量）为单因素，Y（感官评分）为响应值，利用Design-Expert 13 软件对数据进行分析，试验因素与水平见表1。
表1 响应面设计因素及水平
Table 1 Design factors and levels of response surface
因素水平-1 0 1 X1 辣木叶发酵提取物添加量/（g/kg）12 16 20 X2 核桃仁添加量/（g/kg）70 80 90 X3 白砂糖添加量/（g/kg）45 50 55
1.5 感官评定
参考GB/T 31325—2014《植物蛋白饮料 核桃露（乳）》中的方法[18]，由20 名同学（10 男10 女，年龄20～59 岁健康人员）组成感官评定小组。在室温下，取50 mL 辣木核桃乳于无色透明容器中，由感官评定小组进行感官评价，打分范围包括色泽、气味、组织形态、口感4 个指标，具体评分标准见表2。
表2 辣木核桃乳感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards of M.oleifera walnut milk
项目色泽气味组织形态口感评分标准色泽均匀，呈淡绿色色泽较均匀，呈淡绿色色泽不均匀，色泽暗淡核桃香味浓郁，同时具有辣木独特的香味具有核桃和辣木的香味，香味不浓郁核桃或者辣木香味过重，香气不协调组织均匀细腻，无沉淀组织均匀，有少量蛋白质沉淀组织不均匀，有大量沉淀口感细腻，核桃、辣木滋味浓郁，香甜适中口感黏稠，核桃、辣木滋味略淡有颗粒感，辣木味过重，有苦涩味分值17～25 9～＜17 0～＜9 17～25 9～＜17 0～＜9 17～25 9～＜17 0～＜9 17～25 9～＜17 0～＜9
1.6 理化、微生物指标测定
根据GB/T 31325—2014《植物蛋白饮料 核桃露（乳）》中的方法对辣木核桃乳的蛋白质、脂肪含量进行测定[18]；微生物限量执行NY/T 433—2021《绿色食品植物蛋白饮料》[19]；菌落总数按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[20]中的方法测定；大肠菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[21]中的方法测定。
1.7 辣木核桃乳对小鼠的睡眠功效评价
1.7.1 实验动物分组与给药方法
5 周龄SPF 级雄性ICR 小鼠120 只，随机分为3 批，每批40 只，实验开始前，称量实验小鼠初始体质量，并根据小鼠体质量随机分为5 组，分别是空白对照组（95% 生理盐水）、辣木核桃乳低剂量组（10 mL/kg BW）、中剂量组（20 mL/kg BW）、高剂量组（40 mL/kg BW）及阳性对照组（地西泮2 mg/kg BW），灌胃体积0.1 mL/10 g BW。实验小鼠饲养于可控的环境条件下，温度恒定（24±1）℃，相对湿度（50±10）%，12/12 h 明暗循环，自由饮水摄食。实验开始前，小鼠适应性喂养一周，之后各组小鼠分别给予不同受试物，每天灌胃1次，连续灌胃14 d，灌胃前称取小鼠体质量。
1.7.2 直接睡眠实验
各组动物每天分别给予相应的受试物，连续灌胃21 d，于最后一次灌胃60 min 内观察小鼠睡眠情况。小鼠翻正反射作为判断入睡的指标，即将小鼠背卧后，1 min 内不能翻正即认为翻正反射消失，小鼠进入睡眠状态[22]。
1.7.3 延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠实验
为确保小鼠进入睡眠状态，经预实验确定了小鼠戊巴比妥钠注射剂量为45 mg/kg BW。各组小鼠分别给予相应的受试物，连续灌胃21 d，于末次灌胃前12 h 禁食不禁水。末次灌胃30 min 后，各组小鼠腹腔注射45 mg/kg BW 戊巴比妥钠，注射体积为0.08 mL/10 g BW。记录每只小鼠的睡眠潜伏期及睡眠时长（睡眠潜伏期为给药到翻正反射消失的时间，睡眠时长为翻正反射消失到恢复的时间），注射15 min 内未入睡的动物不计入样本数据，观察各实验组是否延长小鼠睡眠时间，判断辣木核桃乳是否与戊巴比妥钠具有协同睡眠作用[23]。
1.7.4 戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验
经预实验确定戊巴比妥钠阈下催眠剂量为28 mg/kg BW。各组小鼠分别给予相应的受试物，连续灌胃21 d，于末次灌胃前12 h 禁食不禁水。末次灌胃30 min 后，各组小鼠腹腔注射28 mg/kg BW 的戊巴比妥钠，注射体积为0.08 mL/10 g BW，记录30 min 内入睡动物数。睡眠发生率（R，%）计算公式如下。
式中：n 为入睡动物数；N 为每组动物数。
1.7.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验
小鼠连续喂养21 d，末次灌胃30 min 后，各组小鼠腹腔注射260 mg/kg BW 的巴比妥钠（该剂量为预实验确定的小鼠100% 入睡剂量），注射量为0.08 mL/10 g BW，记录各组小鼠的睡眠潜伏期[24]。
1.8 数据处理
利用Origin 2021 对实验数据进行分析和绘图，结果以平均值±标准差表示，以单因素方差分析进行显著性检验，p＜0.05 具有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 辣木叶发酵提取物添加量对产品感官评分的影响
辣木叶发酵提取物添加量对辣木核桃乳感官评分的影响如图1 所示。
图1 辣木叶发酵提取物对产品感官评分的影响
Fig.1 Effects of fermented extract of Moringa moringa leaf on sensory scores of products
由图1 可知，当辣木叶发酵提取物添加量为8～16 g/kg 时，随辣木叶发酵提取物添加量的增加，感官评分逐渐上升，当辣木叶发酵提取物添加量为16 g/kg时，产品口感细腻，具有核桃和辣木独特的香味，香气协调，感官评分最高，为91.3；之后随辣木叶发酵提取物添加量的增加，产品中辣木的香味逐渐掩盖核桃的香味，口感不协调且略有苦涩味，感官评分逐渐降低。因此，选择辣木叶发酵提取物添加量为12、16、20 g/kg进行后续响应面试验。
2.1.2 核桃仁添加量对产品感官评分的影响
核桃仁添加量对辣木核桃乳感官评分的影响如图2 所示。
图2 核桃仁添加量对产品感官评分的影响
Fig.2 Effects of walnut kernel addition on sensory scores of products
由图2 可知，随着核桃仁添加量的增加，产品感官评分先升高后降低，当核桃仁添加量为80 g/kg 时，产品体系稳定，组织均匀细腻，口感最好，感官评分最高，达到94.6。当核桃仁添加量较低时，产品核桃风味不足，评分较低；当核桃仁添加量过高时，会发生蛋白质沉淀现象，产品底部出现颜色较深的区域或者略微分层。因此，选择核桃仁添加量为70、80、90 g/kg 进行后续响应面试验。
2.1.3 白砂糖添加量对产品感官评分的影响
白砂糖作为该产品的主要甜味剂，其添加量对产品的感官评分有着重要影响，结果如图3 所示。
图3 白砂糖添加量对产品感官评分的影响
Fig.3 Effects of added white granulated sugar on sensory scores of products
由图3 可知，随着白砂糖添加量的增加，产品的感官评分先升高后逐渐降低。当白砂糖添加量为45 g/kg 时，产品甜味不足，口感略淡；当白砂糖添加量为50 g/kg时，产品口感细腻，香味醇厚，感官评分最高；当白砂糖添加量过高时，造成产品过甜，严重影响产品整体的口感，感官评分降低。因此，选择白砂糖添加量为45、50、55 g/kg 进行后续响应面试验。
2.2 响应面优化结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
在单因素试验结果的基础上，以X1（辣木叶发酵提取物添加量）、X2（核桃仁添加量）、X3（白砂糖添加量）为单因素，Y（感官评分）作为响应值进行响应面优化试验。试验设计及结果见表3。
表3 响应面试验设计与结果
Table 3 Response surface test design and results
试验号X3 白砂糖添加量1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X1 辣木叶发酵提取物添加量-1 1-1 1-1 1-1 X2 核桃仁添加量-1-1 0 0 0 0-1-1 1 1 0 0 0 0-1 1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1-1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Y 感官评分84.7 82.8 83.4 87.1 81.4 82.6 80.0 79.3 83.8 82.7 84.3 81.6 92.1 92.8 91.5 92.3 93.1
2.2.2 模型建立及方差分析
对试验数据进行多元回归拟合分析，得到的回归模型方程为Y=92.36+0.287 5X1-0.100 0X2-0.662 5X3+1.40X1X2-0.475 0X1X3-0.400 0X2X3-0.500 7X12-2.79X22-6.47X32。
回归模型方差分析如表4 所示。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
方差来源模型X1 X2 X3 X1X2 X1X3 X2X3 X12 X22 X32自由度F 值29.29 0.479 9 0.058 1 2.55 5.69 0.655 0 0.464 5 78.48 23.83 127.83 p 值＜0.000 1 0.510 8 0.816 5 0.154 4 0.048 5 0.445 0 0.517 4＜0.000 1 0.001 8＜0.000 1显著性极显著显著极显著极显著极显著残差失拟项纯误差总和R2 R2Adj平方和363.16 0.661 3 0.080 0 3.51 7.84 0.902 5 0.640 0 108.12 32.83 176.12 9.64 8.09 1.55 372.80 0.974 1 0.940 9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方40.35 0.661 3 0.080 0 3.51 7.84 0.902 5 0.640 0 108.12 32.83 176.12 1.38 2.70 0.388 0 6.95 0.045 9显著
由表4 可知，回归模型显著性检验p＜0.000 1，说明二次多元回归模型极显著；回归模型失拟项显著，表明此模型可用于试验拟合。决定系数R2=0.974 1、调整系数R2Adj=0.940 9，表明该模型拟合程度良好，试验操作可信度高，可以解释辣木核桃乳感官评分的变化。F 值可知，各因素对辣木核桃乳感官评分影响程度的顺序为X3（白砂糖添加量）＞X1（辣木叶发酵提取物添加量）＞X2（核桃仁添加量），即白砂糖添加量对辣木核桃乳感官评分影响最大，核桃仁添加量对辣木核桃乳感官评分影响最小。
2.2.3 最优工艺的确定和验证
回归模型通过响应面法得到的最好工艺条件为辣木叶发酵提取物添加量16.12 g/kg、核桃仁添加量79.94 g/kg、白砂糖添加量49.74 g/kg。结合实际情况，将上述最佳工艺参数进行调整：辣木叶发酵提取物添加量为16 g/kg、核桃仁添加量为80 g/kg、白砂糖添加量为50 g/kg，在该条件下得到的辣木核桃乳感官评分为93.2，与理论值接近。
2.3 理化、微生物指标测定结果分析
表5 为辣木核桃乳理化、微生物指标检测结果。
表5 辣木核桃乳理化、微生物指标检测结果
Table 5 Test results of physicochemical and microbial indexes of M.oleifera walnut milk
项目指标要求检测结果蛋白质含量/（g/100 g）≥0.55 2.12脂肪含量/（g/100 g）≥2.0 3.1菌落总数/（CFU/g）＜102 14大肠菌群/（CFU/g）＜1未检出
由表5 可知，辣木核桃乳中蛋白质含量为2.12 g/100 g，脂肪含量为3.1 g/100 g，菌落总数为14 CFU/g，大肠菌群未检出，各指标均符合国家标准。
2.4 辣木核桃乳对小鼠睡眠的影响
2.4.1 辣木核桃乳对小鼠体质量的影响
对各实验组小鼠体质量进行分析，如表6 所示。
表6 辣木核桃乳对小鼠体质量的影响
Table 6 Effects of M.oleifera walnut milk on body weight of mice g
注：同列相同小写字母表示差异不显著，p＞0.05。
组别空白对照组辣木核桃乳低剂量组辣木核桃乳中剂量组辣木核桃乳高剂量组阳性对照组延长戊巴比妥钠睡眠时间实验35.51±1.79a 34.97±1.63a 35.33±0.98a 35.17±2.02a 35.43±1.77a戊巴比妥钠阈下剂量实验35.03±1.89a 35.45±1.58a 35.34±1.01a 35.32±1.45a 35.23±1.58a巴比妥钠睡眠潜伏期实验34.87±1.71a 35.17±1.18a 35.08±1.61a 34.72±1.95a 35.24±0.88a
由表6 可知，各实验组小鼠体质量均无显著性差异，说明辣木核桃乳对小鼠体质量增长无显著影响。
2.4.2 辣木核桃乳对小鼠直接睡眠的影响
辣木核桃乳对小鼠直接睡眠的影响结果见表7。
表7 辣木核桃乳对小鼠直接睡眠作用
Table 7 Direct sleep effect of M.oleifera walnut milk on mice
组别空白对照组辣木核桃乳低剂量组辣木核桃乳中剂量组辣木核桃乳高剂量组阳性对照组动物数睡眠动物数睡眠发生率/%8 8 8 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
由表7 可知，在末次灌胃60 min 内，各组小鼠都没有直接睡眠现象发生，说明辣木核桃乳对小鼠无直接睡眠作用。
2.4.3 辣木核桃乳对延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响
辣木核桃乳对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时长的影响见图4。
图4 辣木核桃乳对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时长的影响
Fig.4 Effects of M.oleifera walnut milk on sleep duration in mice induced by pentobarbital sodium
由图4 可知，辣木核桃乳低、中、高剂量组的睡眠时长分别为（28.64±5.69）、（34.55±7.39）、（41.84±6.28）min，与空白对照组（25.97±8.86）min 相比，辣木核桃乳各剂量组小鼠睡眠时长分别延长了10.28%、33.04%、61.11%，各组均对戊巴比妥钠催眠诱导的小鼠睡眠时长有积极影响，但辣木核桃乳低剂量组无显著差异（p＞0.05），辣木核桃乳中剂量组差异显著（p＜0.05），辣木核桃乳高剂量差异极显著（p＜0.01）。阳性对照组的睡眠时长为（47.74±8.27）min，与空白对照组相比，睡眠时长极显著延长83.83%（p＜0.01），且与高剂量组相比差异显著（p＜0.05）。结果表明，一定剂量的辣木核桃乳可以有效延长小鼠睡眠时长，且具有量效关系。
辣木核桃乳对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响见图5。
图5 辣木核桃乳对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响
Fig.5 Effects of M.oleifera walnut milk on sleep latency induced by pentobarbital sodium in mice
由图5 可知，辣木核桃乳低、中、高剂量组及阳性对照组的睡眠潜伏期分别为（9.12±1.49）、（8.19±0.84）、（5.16±1.03）、（3.45±0.78）min，与空 白对照 组（10.20±2.07）min 相比，各组小鼠睡眠潜伏期分别缩短了10.59%、19.71%、49.41%、66.18%，其中低、中剂量组无显著差异（p＞0.05），辣木核桃乳高剂量组及阳性对照组差异极显著（p＜0.01），而辣木核桃乳高剂量组及阳性对照组之间无显著差异（p＞0.05）。
2.4.4 辣木核桃乳对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠的影响
辣木核桃乳对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量注射后睡眠发生率结果如表8 所示。
表8 辣木核桃乳对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠的影响
Table 8 Effects of M.oleifera walnut milk on subthreshold dose hypnosis by pentobarbital sodium in mice
注：*表示与空白对照组比较差异显著，p＜0.05；**表示与空白对照组比较差异极显著，p＜0.01。
组别空白对照组辣木核桃乳低剂量组辣木核桃乳中剂量组辣木核桃乳高剂量组阳性对照组动物数睡眠动物数8 8 8 8 8 1 2 5 7 8睡眠发生率/%12.5 25.0 62.5*87.5**100.0**
由表8 可知，与空白对照组相比，辣木核桃乳低剂量对小鼠睡眠发生率无显著影响（p＞0.05），辣木核桃乳中剂量组显著提高了小鼠的睡眠发生率（p＜0.05），辣木核桃乳高剂量组和阳性对照组极显著提高了小鼠的睡眠发生率（p＜0.01）。
2.4.5 辣木核桃乳对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响
辣木核桃乳对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期结果如图6 所示。
图6 辣木核桃乳对巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期的影响
Fig.6 Effects of M.oleifera walnut milk on sleep latency induced by barbiturate sodium in mice
由图6 可知，与空白对照组相比，辣木核桃乳中剂量组显著缩短了小鼠睡眠潜伏期（p＜0.05），辣木核桃乳高剂量组和阳性对照组极显著缩短了小鼠的睡眠潜伏期（p＜0.01），而辣木核桃乳低剂量组无显著影响（p＞0.05）。结果表明，一定剂量的辣木核桃乳具有缩短小鼠睡眠潜伏期的作用。
3 结论
本研究通过单因素和响应面优化结果表明，当辣木叶发酵提取物添加量为16 g/kg、核桃仁添加量为80 g/kg、白砂糖添加量为50 g/kg 时，辣木核桃乳感官评分达到93.2，理化、微生物指标均符合相关国家标准。动物实验结果证明，一定剂量的辣木核桃乳可以延长戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时长、缩短小鼠的睡眠潜伏期和提高戊巴比妥钠阈下剂量的小鼠睡眠发生率。综上，该辣木核桃乳品质优良，对小鼠睡眠具有明显改善作用，为天然植物来源助眠产品的开发和应用提供理论依据。
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