麦角甾醇在食药用真菌中广泛存在，作为一种重要的医药化工原料，它不但可用于甾醇类药物的生产，在受到紫外光照射时还可以转化为维生素D2，从而调节人体钙磷的代谢，促进骨骼的健康[1-5]。另外其还具有调节血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生理活性[6]。
香菇是一种食药用真菌，含有多种营养物质和生物活性成分，其中麦角甾醇是其特征营养物质[7]。目前测定香菇麦角甾醇含量的方法有高效液相色谱法[8]、气相色谱法[9]、紫外分光光度法[10]、比色法、荧光法、电化学法等。其中，高效液相色谱法具有检测灵敏度、准确性高、快速等优点，目前应用较为广泛[11]，但缺点是设备成本高，不适合大批量分析、对样品要求高，某些化合物不适用；气相色谱法分离效果好，操作简单，但检测灵敏度低[12]；比色法、荧光法、电化学法由于灵敏度、操作简便性、样本用量、特异性等原因的限制，极少在麦角甾醇的测定中使用；紫外分光光度法操作简单、成本低[13]，但易受到杂质的影响使测定吸光值偏高。为提高紫外分光光度法检测麦角甾醇的准确度，本研究采用三波长分光光度法[14]，消除杂质背景吸收所带来的影响，测定香菇麦角甾醇含量，并探究超声辅助提取麦角甾醇的最佳工艺条件、纯化方法及其抗氧化能力，为进一步探究香菇麦角甾醇的生理活性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菇（Lentinus edodes）子实体：市售。麦角甾醇标准品（98%）、1，1-二苯基-2-苦味基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2，2-diazobis（3-ethyl Benzothiazole line-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、L-抗坏血酸：北京索莱宝科技有限公司；纯甲醇（色谱纯）：天津市四友精细化学品有限公司；甲醇、石油醚：天津市北辰方正试剂厂；无水乙醇、过硫酸钾：天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钾：天津市申泰化学试剂有限公司；无水硫酸钠：天津市致远化学试剂有限公司；溴化钾：国药集团化学试剂有限公司；乙醚：四川西陇化工有限公司。除特殊标记外其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DE-500 多功能粉碎机：浙江红景天工贸有限公司；MX-S 恒温混匀仪：大龙兴创实验仪器股份公司；KDC-1044L 大容量低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；SB25-12DT 超声波清洗机、SCIENTZ-30YD/A 真空冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；5804R 高速冷冻离心机：德国艾本德公司；SHZDC（Ш）循环水真空泵、DF-101S 磁力加热搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Tensor 27 傅里叶变换红外光谱仪：德国布鲁克光谱仪器公司；G6860A 紫外分光光度计、G1315D-1260 高效液相色谱仪、1260 制备型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 3 种香菇麦角甾醇测定方法
1.3.1 香菇麦角甾醇提取液的制备
新鲜香菇用纯水清洗表面灰土杂质，剪去根部约1 cm，冷冻干燥72 h 后用粉碎机粉碎过40 目筛，4 ℃密封避光保存备用。
称取香菇粉末0.200 g，加入8 mL 甲醇[料液比1∶40（g/mL）]，称重后300 W 超声辅助提取90 min，冷却至室温，称重加甲醇补足质量。抽滤，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，获取上清液即为香菇麦角甾醇提取液。
1.3.2 标准曲线的建立
称取1.500 mg 麦角甾醇标准品，加甲醇定容至30 mL，配制为麦角甾醇标准储备溶液（50 μg/mL），4 ℃避光保存备用。分别吸取0、1、2、3、4、5、6、8 mL 麦角甾醇标准储备溶液于10 mL 容量瓶中，甲醇定容，得到浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40 μg/mL 的系列标准工作液，分别用三波长分光光度法、单波长分光光度法与高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法测定系列标准工作液，并绘制标准曲线。具体测定条件如下。
1.3.2.1 三波长分光光度法
分别在271.7、282.0、292.9 nm（由紫外扫描特征峰确定）处测定标准工作液的吸光值，按照公式ΔA=A282.0 nm-（A271.7 nm+A292.9 nm）/2 计算ΔA，以ΔA-浓度作图绘制标准曲线。
1.3.2.2 单波长分光光度法
在282 nm 处测定标准工作液吸光值，以吸光值-浓度作图绘制标准曲线。
1.3.2.3 HPLC 法
标准工作液经0.22 μm 膜过滤后，在色谱柱Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱温30 ℃、流动相为纯甲醇、流速1 mL/min、检测波长282 nm、进样量20 μL 的条件下进行检测，以峰面积-浓度作图，绘制标准曲线。
1.3.3 香菇麦角甾醇含量的测定
吸取0.2 mL 香菇麦角甾醇提取液，按照1.3.2 中标准曲线利用外标法测定香菇麦角甾醇含量，计算公式如下。
式中：X 为提取液中麦角甾醇含量，mg/g；K 为根据标准曲线测定的样品中麦角甾醇含量，μg/mL；V 为提取麦角甾醇时加入甲醇的体积，mL；M 为称取待测样品的含量，g。
1.3.4 精密度、重复性、稳定性测定
精密度测定：准确吸取0.2 mL 香菇麦角甾醇提取液，重复测定5 次，在271.7、282.0、292.9 nm 3 个波长测定吸光值；重复性测定：准确吸取5 份香菇麦角甾醇提取液，每份0.2 mL，在3 个波长测定吸光值；稳定性测定：准确吸取0.2 mL 香菇麦角甾醇提取液，分别避光保存0、2、4、8、12、24 h 后，在3 个波长下测定吸光值。通过公式计算出相应的ΔA，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.5 加标回收试验
根据三波长分光光度法建立的麦角甾醇标准曲线测定香菇提取液中麦角甾醇含量。分别移取6 份已知浓度为37.97 μg/mL 的麦角甾醇试液0.3 mL 于比色管中，并加入0.1 mL 麦角甾醇标准溶液，混合均匀，在3 个波长测定吸光值，通过公式计算出ΔA，参照标准曲线得出测量值，根据以下公式计算加标回收率（H，%）。
式中：A 为提取液中麦角甾醇浓度，μg/mL；B 为标准溶液中麦角甾醇浓度，μg/mL；C 为加标实测麦角甾醇浓度，μg/mL。
1.4 香菇麦角甾醇提取工艺优化
称取香菇粉末0.200 g，按料液比1∶40（g/mL）加入甲醇，在300 W 超声波清洗机中40 ℃提取90 min，离心（3 000 r/min、4 ℃、10 min）所得上清液过0.45 μm有机滤膜，获得麦角甾醇粗提物。单因素试验分别研究提取次数（1、2、3 次）、提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）、超声时间（10、30、60、90、120、150 min）、料液比[1∶4、1∶8、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80（g/mL）]对麦角甾醇含量的影响。
根据单因素试验结果，以超声时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）为自变量利用Design-Expert 设计响应面试验，确定最优的麦角甾醇提取条件。响应面因素与水平见表1。
表1 响应面因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface
水平A 超声时间/min B 料液比/（g/mL）C 提取温度/℃-1 0 1 30 60 90 1∶20 1∶40 1∶60 50 60 70
1.5 香菇麦角甾醇纯化及分析
1.5.1 香菇麦角甾醇的纯化
将最佳条件获得的麦角甾醇粗提物经减压浓缩回收甲醇（50 ℃），浓缩液为浸膏1；浸膏1 溶于纯水，所得混悬液用石油醚反复萃取3 次（萃取剂∶混悬液=1∶1，体积比），回收石油醚（40 ℃），浓缩液为浸膏2；浸膏2 用1 mol/L KOH-95% 乙醇溶液溶解，30 ℃加热搅拌回流3 h，回收乙醇（50 ℃），浓缩液为浸膏3；浸膏3溶于纯水，所得混悬液用石油醚萃取5 次，将石油醚萃取液水洗至中性，用0.5 mol/L KOH 水溶液充分振荡洗涤3 次，再次水洗至中性，后用无水硫酸钠脱水干燥，过滤吸水后的无水硫酸钠颗粒，回收石油醚，浓缩液为浸膏4；浸膏4 溶于乙醇溶液，4 ℃冷却获得絮状结晶，浓缩溶剂，-7 ℃冷却结晶，冷冻离心[4 ℃、3 500 r/min、20 min]分离出结晶体，经过两次重结晶后真空冷冻干燥获得麦角甾醇粉末，将粉末配制成浓度为2 mg/mL的进样溶液，利用制备型高效液相色谱仪进一步分离麦角甾醇得到纯度更高的单体化合物。制备条件为C18 色谱柱（20 nm×250 nm，5 μm），流动相为纯甲醇（色谱纯），流速8 mL/min，紫外检测波长282 nm，进样量2 mL，柱温为室温。
1.5.2 香菇麦角甾醇结构表征
1.5.2.1 香菇麦角甾醇结构的确定
利用Chem Draw 19.0、Chem 3D 绘制香菇麦角甾醇化学结构和3D 结构，可知麦角甾醇的基本结构及其含有的主要基团，包括羟基（—OH）、碳碳双键
和甲基（—CH3）。
1.5.2.2 高效液相色谱测定
将制备的单体化合物溶于甲醇，经0.22 μm 膜（有机系）微滤后进行高效液相色谱分析，在C18 色谱柱（4.6 nm×250 nm，5 μm），流动相为纯甲醇（色谱纯），流速1 mL/min，检测波长282 nm，进样量20 μL 的条件下测定麦角甾醇含量。
1.5.2.3 紫外可见光谱扫描
以无水乙醇为对照，采用紫外分光光度计进行全波长扫描，扫描范围200～800 nm。
1.5.2.4 傅里叶变换红外光谱扫描
以溴化钾为空白对照，采用压片法测样，扫描波数范围4 000～400 cm-1。
1.6 香菇麦角甾醇纯化产物抗氧化活性测定
以维生素C 为对照，参照文献[15-16]的方法分别测定香菇麦角甾醇清除DPPH 自由基和ABTS+自由基的能力。
1.7 数据处理
数据以平均值±标准差表示，用Graphpad 8.0 软件进行单因素方差分析和独立样本t 检验，并用Origin 8.0 软件作图。以P＜0.05 判定为差异显著。
2 结果与分析
2.1 3 种香菇麦角甾醇测定方法的比较
2.1.1 标准曲线的建立
采用三波长分光光度法、单波长分光光度法和高效液相色谱法建立麦角甾醇的标准曲线见图1。
图1 香菇麦角甾醇标准曲线的建立
Fig.1 Standard curve of ergosterol in Lentinus edodes
由图1 可知，三波长分光光度法、单波长分光光度法、HPLC 法得到的回归方程分别为Y1=0.013 6X1-0.004 2（R2=0.999），Y2=0.025 9X2-0.008 2（R2=0.999 6），Y3=31.637X3+4.107 9（R2=0.999 9），表明麦角甾醇在0～40 μg/mL 具有良好的线性关系。
2.1.2 3 种检测方法的比较
3 种检测方法测定麦角甾醇含量结果如表2 所示。
表2 3 种检测方法测定麦角甾醇含量的比较
Table 2 Comparison of three detection methods for measuring ergosterol content
方法三波长分光光度法试验号1 2 3 1 2 3 1 2 3浓度/（μg/mL）30.812 5 30.779 4 30.779 4 36.266 4 36.112 0 36.293 4 30.919 9 30.994 9 30.989 7麦角甾醇含量/（mg/g）2.465 2.462 2.462 2.901 2.889 2.903 2.474 2.480 2.479平均含量/（mg/g）2.463±0.001单波长分光光度法2.898±0.006 HPLC 法2.477±0.003
由表2 可知，采用三波长分光光度法、单波长分光光度法、HPLC 法测定香菇提取液中麦角甾醇含量分别为（2.463±0.001）、（2.898±0.006）、（2.477±0.003）mg/g，发现三波长分光光度法和高效液相色谱法测定的结果几乎一致，而单波长分光光度法测量结果偏高，可能由于在282.0 nm 波长下，香菇麦角甾醇提取液中的部分杂质也存在吸收，从而使吸光值偏高。
2.1.3 精密度、重复性、稳定性试验
三波长分光光度法测定麦角甾醇含量精密度试验结果如表3 所示。
表3 三波长分光光度法测定麦角甾醇含量精密度试验结果
Table 3 Precision test result of ergosterol content detected by three-wavelength spectrophotometry
样品1 2 3 4 5 A271.7 nm 0.707 1 0.710 2 0.708 9 0.709 8 0.708 9 A282.0 nm 0.916 1 0.916 0 0.915 9 0.917 3 0.917 4 A292.9 nm 0.312 2 0.308 7 0.310 1 0.311 7 0.312 9 ΔA 0.406 5 0.406 6 0.406 4 0.406 6 0.406 5麦角甾醇含量/（mg/g）2.415 6 2.416 2 2.415 3 2.416 2 2.415 9平均含量/（mg/g）2.415 8±0.003 0 RSD/%0.01
由表3 可知，在三波长（271.7、282.0、292.9 nm）下分别测定5 个样品吸光值，ΔA 分别为0.406 5、0.406 6、0.406 4、0.406 6 和0.406 5，因此，麦角甾醇含量依次为2.415 6、2.416 2、2.415 3、2.416 2、2.415 9 mg/g，其相对标准偏差（n=5）为0.01%，表明三波长分光光度法检测香菇麦角甾醇精密度高。
三波长分光光度法测定麦角甾醇含量重复性试验结果见表4。
表4 三波长分光光度法测定麦角甾醇含量重复性试验
Table 4 Repeatability test of ergosterol content detected by three-wavelength spectrophotometry
样品1 2 3 4 5 A271.7 nm 0.713 1 0.718 5 0.719 3 0.738 2 0.714 6 A282.0 nm 0.934 0 0.942 7 0.941 3 0.939 8 0.936 5 A292.9 nm 0.315 4 0.314 4 0.312 2 0.316 2 0.320 3 ΔA 0.419 8 0.426 3 0.425 6 0.412 6 0.419 1麦角甾醇含量/（mg/g）2.493 8 2.532 2 2.528 0 2.451 7 2.489 9平均含量/（mg/g）2.499 1±0.029 0 RSD/%1.17
由表4 可知，样品中麦角甾醇的平均含量为（2.499 1±0.029 0）mg/g，相对标准偏差（n=5）为1.17%，表明三波长分光光度法测定麦角甾醇含量的重复性良好。
三波长分光光度法测定麦角甾醇含量稳定性试验结果见表5。
表5 三波长分光光度法测定麦角甾醇含量稳定性试验
Table 5 Stability test of ergosterol content detected by three-wavelength spectrophotometry
时间/h 0 2 4 8 12平均含量/（mg/g）2.534 1±0.002 0 RSD/%0.09 24 A271.7 nm 0.729 7 0.731 4 0.725 1 0.728 9 0.734 2 0.729 3 A282.0 nm 0.957 9 0.957 6 0.954 1 0.956 7 0.956 4 0.950 5 A292.9 nm 0.331 8 0.329 8 0.330 3 0.331 2 0.325 9 0.319 6 ΔA 0.427 2 0.427 0 0.426 4 0.426 7 0.426 4 0.426 1麦角甾醇含量/（mg/g）2.537 4 2.536 5 2.532 9 2.534 4 2.532 6 2.530 9
由表5 可知，避光条件下，平均麦角甾醇含量为（2.534 1±0.002 0）mg/g，相对标准偏差为0.09%，表明麦角甾醇粗提物在24 h 内稳定性良好。
2.1.4 加标回收试验结果分析
三波长分光光度法测定麦角甾醇含量加标回收率试验结果见表6。
表6 三波长分光光度法测定麦角甾醇含量加标回收试验结果
Table 6 Recovery test result of ergosterol content detected by three-wavelength spectrophotometry
试验号 1 2 3 4 5 6样品浓度/（μg/mL）37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97 37.97标准品浓度/（μg/mL）49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52 49.52实测浓度/（μg/mL）42.89 42.91 42.86 42.88 42.92 42.98 42.84 42.87 42.93 42.94 42.97 42.88实际回收率/%平均回收率/%总平均回收率/%总RSD/%99.35 99.76 98.75 99.15 99.96 101.17 98.34 98.95 100.16 100.36 100.97 99.15 99.56±0.20 99.67±0.84 0.85 98.95±0.20 100.57±0.67 98.65±0.30 100.26±0.10 100.06±0.91
由表6 可知，回收率范围在98%～102%，相对标准偏差为0.85%，小于2%，证明三波长分光光度法准确度较高。
2.2 香菇麦角甾醇提取工艺的优化
2.2.1 单因素试验结果分析
单因素试验结果见图2。
图2 香菇麦角甾醇提取单因素试验结果
Fig.2 Single factor experiment results of Lentinus edodes ergosterol extraction
由图2 可知，香菇麦角甾醇的含量随提取次数的增加而增加，提取两次后趋于平缓，1 次提取就能提取出香菇粉中的大部分麦角甾醇；香菇麦角甾醇提取超声时间为60 min 时，麦角甾醇的含量最高，为2.944 1 mg/g；料液比为1∶40（g/mL）时，香菇麦角甾醇的含量最高，为3.150 6 mg/g；提取温度为60 ℃时，香菇麦角甾醇的含量最高，可达2.991 2 mg/g。
2.2.2 响应面试验结果
对所测得的模型进行分析，结果见表7、表8。
表7 响应面试验结果
Table 7 Response surface test results
标准顺序16 13 12 10 1 14 15试验号2 9 6 3 4 8 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 17 7 5 11 12 13 14 15 16 17 A 超声时间/min 60 60 60 60 30 60 60 90 60 90 30 90 90 60 60 30 30 B 料液比/（g/mL）1∶40 1∶40 1∶60 1∶60 1∶20 1∶40 1∶40 1∶20 1∶20 1∶40 1∶60 1∶60 1∶40 1∶20 1∶40 1∶40 1∶40 C 提取温度/℃60 60 70 50 60 60 60 60 50 50 60 60 70 70 60 70 50提取含量/（mg/g）2.974 1 3.087 1 3.129 7 2.680 6 2.925 0 2.797 6 2.965 9 2.645 3 2.084 7 2.775 9 2.516 8 3.847 9 3.364 7 2.516 8 2.887 6 2.953 5 2.637 1
表8 响应面回归模型方差分析
Table 8 Analysis of variance of response surface regression models
注：**表示影响极显著（P＜0.01）。
因素模型自由度A B C AB显著性**********AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和2.19 0.18 0.72 0.40 0.37 0.019 7.27×10-5 0.23 0.037 0.25 0.048 1.38×10-3 0.046 2.23 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方0.24 0.18 0.72 0.40 0.37 0.019 7.27×10-5 0.23 0.037 0.25 6.83×10-3 4.59×10-4 0.012 F 值35.58 26.40 105.72 58.41 53.64 2.71 0.011 34.22 5.48 37.09 P 值＜0.000 1 0.001 3＜0.000 1 0.000 1 0.000 2 0.143 4 0.920 7 0.000 6 0.051 8 0.000 5****0.040 0.988 0
由表8 可知，F 值为35.58，表明模型具有非常重要的意义。失拟项P=0.988 0＞0.05，表明模型拟合程度良好，该模型成立。模型相关系数R2=0.957 7，调整系数为0.951 1，说明实际与预测值具有较高的拟合度。二次项因素PA2=0.000 6、PB2=0.051 8、PC2=0.000 5，PC2＜PA2＜PB2，二次项A2、C2 在提取过程中的影响极显著，B2影响不显著。利用Design-Expert 对3 个自变量进行二次多元线性回归分析，得到回归方程为Y=2.94+0.15A+0.30B+0.22C+0.30AB+0.068AC+0.004265BC+0.24A2-0.094B2-0.25C2。
各因素交互作用如图3～图5 所示。
图3 超声时间和料液比交互作用的响应面图和等高线图
Fig.3 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic time and material liquid ratio
图4 超声时间和提取温度交互作用的响应面图和等高线图
Fig.4 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic time and extraction temperature
图5 料液比和提取温度交互作用的响应面图和等高线图
Fig.5 Response surface and contour map of interaction between material liquid ratio and extraction temperature
由图3～图5 可知，料液比（B）和提取温度（C）交互作用的响应面图相对平缓，等高线呈圆形，说明料液比（B）和提取温度（C）的交互作用不显著。超声时间（A）和料液比（B）、超声时间（A）和提取温度（C）的等高线皆呈马鞍形，但超声时间（A）和料液比（B）交互作用的响应面坡度更陡峭，因此，超声时间（A）和料液比（B）的交互作用对香菇麦角甾醇含量的影响最大，交互作用的影响程度为AB＞AC＞BC。这与方差分析结果相符。
通过软件分析，筛选出香菇麦角甾醇的最佳提取条件为超声时间89.75 min、料液比1∶59.41（g/mL）、提取温度69.34 ℃，麦角甾醇含量的预测值为3.868 78 mg/g。为方便试验操作，条件调整为超声时间90 min、料液比1∶59（g/mL）、提取温度69 ℃。在此条件下进行3 次验证试验，发现麦角甾醇含量均为3.781 4 mg/g，证明该模型拟合效果良好，预测结果稳定可靠。
2.3 香菇麦角甾醇纯化产物分析
2.3.1 高效液相色谱结果分析
纯化后香菇麦角甾醇高效液相色谱分析结果如图6 所示。
图6 纯化后麦角甾醇高效液相色谱图
Fig.6 High performance liquid chromatogram of purified ergosterol
由图6 可知，试验发现4 ℃结晶晶体短小而分散，-7 ℃晶体呈针状且密集，因此，采用-7 ℃结晶。纯化后麦角甾醇经HPLC 检测，仅有1 个色谱峰，制备得到白色针状结晶，根据标准曲线计算得麦角甾醇纯度可达96%以上。
2.3.2 紫外可见光谱分析
纯化后麦角甾醇与麦角甾醇标准品紫外可见光谱分析如图7 所示。
图7 纯化后麦角甾醇与麦角甾醇标准品紫外可见光图谱
Fig.7 Ultraviolet spectrum of purified ergosterol and ergosterol standard
由图7 可知，纯化后的麦角甾醇和麦角甾醇标准品（98%）在250～300 nm 有3 个明显的吸收峰（271.7、282.0、292.9 nm），且纯化麦角甾醇与麦角甾醇标准品的峰形变化与整体趋势基本一致，说明两种物质具有相同的生色基团和助色基团，是同一种物质。
2.3.3 傅里叶变换红外光谱分析
傅里叶变换红外光谱分析结果如图8、图9 所示。
图8 麦角甾醇化学结构式及3D 结构
Fig.8 Chemical structure and 3D structure of ergosterol
图9 纯化后麦角甾醇与麦角甾醇标准品的红外图谱
Fig.9 Infrared spectrum of purified ergosterol and ergosterol standard
由图8 和图9 可知，麦角甾醇的基本结构及含有的主要基团包括羟基、甲基、碳碳双键，其中羟基（—OH）的伸缩振动吸收峰在3 437.06 cm-1 处，甲基（—CH3）的反对称伸缩振动吸收峰在2954.87 cm-1处，甲基（—CH3）的对称伸缩振动吸收峰在2 871.94 cm-1 处，碳碳双键
的伸缩振动吸收峰在1 604.74 cm-1 处，甲基（—CH3）的反对称变形振动吸收峰在1 456.22 cm-1处，甲基（—CH3）的对称变形振动吸收峰在1 382.93 cm-1 处，羟基（—OH）的弯曲振动吸收峰在1 033.82 cm-1，碳碳双键
的变形振动吸收峰在567.06 cm-1处，将纯化后麦角甾醇与麦角甾醇标准品进行对比，发现两者趋势一致，再与参考文献[17-18]对比分析，确定该物质为麦角甾醇单体。
2.4 香菇麦角甾醇抗氧化试验结果分析
香菇麦角甾醇抗氧化试验结果如图10 所示。
图10 香菇麦角甾醇纯化产物的DPPH·及ABTS+·清除率
Fig.10 Scavenging rates of DPPH·and ABTS+·by purified products of ergosterol in Lentinus edodes
由图10 可知，香菇麦角甾醇浓度为2.0 mg/mL时，清除DPPH 自由基的能力达（41.84±0.47）%，清除DPPH 自由基的IC50 为（0.72±0.06）mg/mL；浓度达到0.24 mg/mL 时，ABTS+自由基的清除能力最强，达（31.71±0.45）%，清除ABTS+自由基的IC50为（0.17±0.01）mg/mL。
3 讨论与结论
以香菇为原料，采用超声辅助提取获得麦角甾醇粗提物，再利用溶剂提取法、重结晶法和制备型高效液相法制备单体麦角甾醇的工艺路线可行。建立的三波长分光光度法能够快速、准确地测定香菇麦角甾醇含量，使用设备常见，测定方法简单，且能高度拟合高效液相法测定的精确度，说明该法能将吸收光谱上下平移，校正倾斜度，消除杂质对紫外吸收波长的影响、排除干扰[19-20]。与其他已报道单波长分光光度法测定麦角甾醇相比，本方法精确度、灵敏度更高。
根据超声条件开展单因素试验，发现麦角甾醇含量随超声时间的延长先增加后降低，这可能是因为长时间的超声破坏麦角甾醇较稳定的甾核和膜基质形成的疏水作用力，使其空间结构发生改变导致[17]。同理认为，提取温度过高对麦角甾醇的结构造成破坏，降低含量；随溶剂添加量增加，溶质与溶剂接触更加充分促进溶解，当接触程度最大化后，再增加溶剂，对含量无明显影响。在单因素试验的基础上，选取中心条件设计响应面试验并应用Design-expert 进行响应面分析，得到香菇麦角甾醇提取的最佳条件为超声时间90 min、料液比1∶59（g/mL）、提取温度69 ℃，麦角甾醇含量的预测值为3.868 78 mg/g，实测值为3.781 4 mg/g。郭华等[21]利用甲醇超声辅助提取法，高效液相紫外检测法测得香菇麦角甾醇含量为4.8 mg/g；崔丹丹[2]利用（甲醇∶三氯甲烷=4∶1，体积比）超声辅助皂化提取法，HPLC 测得香菇菌盖与菌柄麦角甾醇含量分别为（7.8±0.2）、（5.2±0.6）mg/g；Villares 等[22]利用（甲醇∶三氯甲烷=1∶2，体积比）超声辅助提取法，反相高效液相色谱测得香菇麦角甾醇含量为3.6 mg/g。上述试验均采用超声提取，利用空化作用促进溶剂和香菇粉的接触面积，从而提高麦角甾醇含量且皂化能进一步促进提取。但Barreira 等[23]利用正己烷索氏提取，高效液相紫外检测法测得香菇麦角甾醇含量为0.4 mg/g；Hammann等[24]利用正己烷冷提取，气相色谱质谱联用法测得香菇麦角甾醇含量为1.8 mg/g。说明合适的提取剂、提取方法和测定方法都是影响香菇麦角甾醇含量的重要因素。超声辅助提取与索氏提取、冷提取等传统提取方法相比，具有操作简单、得率高的优点，因此采用超声辅助提取作为试验的提取方法更为适用。
将纯化后的麦角甾醇单体化合物进行结构表征，测定其纯度可达96%以上，紫外光谱表明从香菇中提取的麦角甾醇单体化合物与试验标准品具有相同的特征峰且整体趋势相同[25]，红外光谱表明提取麦角甾醇特征基团所处峰位与标准品完全一致[26-27]，确定提取单体化合物为麦角甾醇。制备麦角甾醇结晶过程中发现4 ℃下晶体短而涣散，-7 ℃晶体似针状且含量更高。可能的原因是4 ℃为麦角甾醇平衡结晶温度，液体温度达到理论结晶温度时并不能结晶，而必须在其温度以下的某一温度才开始结晶。
DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除率常用于评价物质的抗氧化活性[28-29]，香菇麦角甾醇纯化产物DPPH 自由基的IC50 为（0.72±0.06）mg/mL，其抗氧化能力在0～0.5 mg/mL 迅速提高，0.5～2.0 mg/mL 趋于平缓。清除ABTS+自由基的IC50 为（0.17±0.01）mg/mL，其抗氧化能力在0～0.16 mg/mL 逐渐提高，0.16～0.24 mg/mL 迅速提高。该结果与前人研究一致[15-16]，可能是因为天然抗氧化物质
与自由基结合，增强清除自由基能力。
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