食源性低聚肽又称小肽或多肽，是指一种相对分子质量小于1 000 Da 的生物活性肽。食源性低聚肽不需要分解消化就可以被人体直接吸收，吸收速度快，吸收效率高达100%，不仅以主动吸收的方式保存其活性，还可起到载体的作用运输营养物质。Daniel[1]发现小肠中存在小分子低聚肽（二肽、三肽）的肽转运蛋白，并且可以完整地被小肠上皮细胞吸收。此外，食源性低聚肽还具有降血压、降血糖、降低胆固醇、抗菌、调节免疫活性、抗氧化等诸多生物活性。国内有学者对动物源低聚肽展开了研究，本文对近几年动物源低聚肽的制备、纯化方法及抗氧化活性的研究进行分析整理，旨在为优化我国动物源低聚肽的开发利用和后续试验提供理论基础。
1 动物源低聚肽的制备
目前，传统的低聚肽制备方法主要有采用酶水解法、酸碱水解法和微生物发酵法。酸碱水解法制备肽的过程较剧烈，难以控制，且对于肽活性的影响无法掌握，已经逐渐被淘汰。而微生物发酵法虽然比较温和，可以利用菌种在生长过程中分泌的各种酶类的特性来制备所需的生物活性肽，同时可以为生物活性肽附加有益菌的某种作用，但发酵过程比较复杂、产物难控制、杂质多、不适宜产业化生产。因而，酶解法是现在制备低聚肽的常用方法。酶解法不仅易于控制、高效安全，且由于不同的酶对于同种蛋白质酶切位点不同，得到生物活性肽的种类也不相同。
1.1 酶解法
酶解法是制备生物活性肽的常用方法，通过控制酶与底物的比值、pH 值、酶解温度和酶解时间来对特定的蛋白进行水解，以获得目的蛋白水解物。目前低聚肽的制备方法多采用两步酶解法，相比单酶酶解，双酶二步酶解法具有更多的酶切位点，可获得不同的肽序列。卢素珍等[2]研究表明二步酶解法可以有效提高水解物的水解度，降低酶解产物的分子量。蛋白原料来源可以选择富含蛋白的食品，如动植物及真菌。此外，还可选择一些副产物，如动物的骨头、皮、内脏等。蛋白酶可以选用内源性蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）和外源性蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶）。 Zhang 等[3]利用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶从去除内脏的乌骨鸡中（包括头、爪）制备了具有抗氧化活性的4 种特征肽。Gisela 等[4]利用碱性蛋白酶和外肽酶在鸡血水解物中得到了有抗氧化活性的肽。酶具有高度专一性，不同种类的酶具有不同的酶切位点，筛选合适的酶是制备活性低聚肽的关键。此外，选择动物不同提取部位或器官也会影响酶种类的筛选。如Phatthawin 等[5]研究发现利用碱性蛋白酶结合木瓜蛋白酶得到的鸡胸肉蛋白水解物水解度和抗氧化活性更高。而Aguilar 等[6]研究表明，用碱性蛋白酶和风味蛋白酶水解鸡内脏可以获得抗氧化活性较优的水解物。
1.2 辅助酶提取
1.2.1 挤压膨化
挤压膨化是在短时高温高压和强剪切力的条件下作用于物料，目的是让样品内部结构和性质发生改变，蛋白质变性，破坏蛋白质三维结构，从而暴露出更多酶切位点，方便后续水解。顾璐萍等[7]采用挤压膨化协同酶解工艺制备壳膜多肽，发现相比于未经过挤压膨化的对照组，挤压膨化后的蛋壳粉，其总氮回收率、D-葡萄糖醛酸提取量皆有所提高，再经过以抗氧化性作为指标优化酶解工艺，发现在最佳工艺条件下提取出的低聚肽（252~2 435 Da）占壳膜多肽的81.8%。
1.2.2 超声波辅助酶解
超声波处理可以加快样品组织和细胞结构的分解，且不破坏原料的性质。酶解过程中，超声波可以提升酶解底物的传质速率，增加酶与底物的接触面积，进一步加快酶水解蛋白质。徐红萍等[8]利用超声波辅助酶解制备东海海参低聚肽，发现超声波辅助酶解可以显著提高低聚肽的含量和回收率，如在超声波辅助木瓜蛋白酶酶解时，低聚肽回收率和含量比无超声波辅助分别提高32.2%和82.3%。但过高的超声波功率反而会破坏蛋白酶结构，降低低聚肽含量。
1.2.3 微波辅助酶解
微波辅助处理是利用300~300 GHz 的电磁辐射，由于分子间和分子内的摩擦和离子的移动与碰撞，它可以比传统的加热方法更快地加热样品中的溶剂，也可以破坏细胞膜和细胞壁。在酶解过程中，微波技术不仅可以作为热源，也可通过改变酶的结构，使一些新肽段生成。Ketnawa 等[9]研究表明微波辅助酶解可以显著提高鳟鱼骨架蛋白的蛋白溶解度、回收率、水解度和2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline -6-sulphonate，ABTS）阳离子自由基清除率。Nguyen 等[10]也发现微波辅助酶解的鱼副产物蛋白水解度要高于常规组。
1.2.4 脉冲电场
脉冲电场（pulsed electric fields，PEF）由10~50 kV/cm的电场组成，执行0.2~0.4 MHz 频率的多个短脉冲，可以使蛋白质暴露出新的酶切位点。Lin 等[11]发现脉冲电场可能会破坏蛋白质的非共价键，解离更多的亚基，使蛋白质结构紊乱，释放出更多的小肽，从而显著提高了碱性蛋白酶制备鸡蛋蛋白肽的抗氧化活性。
1.2.5 高静压技术
高静压技术（high hydrostatic pressure，HHP）可以提高蛋白质的水解和消化率，增强所使用酶的活性。此外，高静压技术还可以使蛋白质构象发生变化，使蛋白质分子链延展，暴露出新的酶切位点。Marciniak 等[12]综述了HHP 的发展现状，在酶解过程中HHP 可辅助酶解植物蛋白和肉蛋白，提高酶解效率及活性肽的生产效率。
2 动物源低聚肽的分离纯化
2.1 膜过滤
膜过滤是以选择性透过膜为分离介质，利用混合物中各组分渗透性能不同的特点，通过在膜两边施加一个推动力（浓度差、电位差或压力差等），使原料侧组分选择性地透过膜，对两种组分或多种组分进行分级、分离和富集，以达到分离、提纯和浓缩的目的。膜过滤不仅低成本，高能效，且不会对肽的活性造成影响。但同时，膜过滤也存在易堵塞、不适用于分离分子量相近组分的缺点。因而，在应用时需结合其他分离方法以达到所需分离效果。安攀宇等[13]采用超滤分离法，获得分子量分别为0~1、1~5 kDa 和0~5 kDa的猪血肽，发现分子量小于1 kDa 的肽具有更高的抗氧化活性。
2.2 凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱又称空间排阻色谱法，是通过蛋白质分子量或分子形状的差异来分离样品。当样品从色谱柱顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒而被迅速洗脱，而较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒中，且保留时间不同，分子量越大，流出越早。样品分子量分布范围不同，其分离组分数量也不相同。丁树慧[14]利用凝胶过滤色谱对低值鱼蛋白水解物中分子量小于3 kDa 的抗氧化肽进一步分离为分子量不同的5 个组分。而Nie 等[15]利用该方法将金华火腿酶解液进一步分离为9 个肽组分。此外，根据凝胶色谱出峰的先后顺序不同，凝胶过滤色谱法也可以用于测定肽的相对分子质量分布。Zhang 等[3]利用凝胶过滤色谱法测定了乌鸡肽相对分子质量分布情况并将其分离。
2.3 离子交换色谱
离子交换色谱是由于被分离的物质所带电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种结合作用是可逆的，当改变pH 值或者用逐渐增加离子强度的洗脱液洗脱时，离子交换剂上结合的物质会与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱。且由于不同物质所带电荷不同，其结合能力不同，因而洗脱顺序也不同。Cai 等[16]曾采用DEAE-52 离子交换色谱法对超滤后得到的金枪鱼蛋白水解物进一步分离纯化，得到了4 种不同肽组分。离子交换色谱也可结合其他方法，以目的活性为导向，分离纯化出目的活性最强组分，对后续单一活性肽作用机理研究提供基础。林晓玲[17]采用DEAE-52阴离子交换色谱法和Sephadex G15 葡聚糖凝胶排阻色谱法对最优鸡软骨酶解物进行分离纯化，获得了氧自由基清除活性最大的组分，并通过超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱联用法对纯化组分进行鉴定解析，采用固相合成法合成所鉴定多肽并进行纯度分析和序列验证。
2.4 反相高效液相色谱
反相高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，是当前液相色谱的主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。反向液相色谱法适用于分离分子量较小的肽组分，对于分子量小于1 kDa 的肽组分具有较高的分辨能力。Lan 等[18]通过RP-HPLC 建立了南极磷虾的肽谱图，并分离出23 个分子量为218.0~745.3 Da 的具有清除自由基和抑制脂质过氧化能力的低聚肽。
2.5 结构鉴定
质谱（mass spectrometry，MS）法是唯一可以确定分子式的方法，目前常用的蛋白质鉴定方法就是质谱法。样品经离子化后，不同质荷比的离子经质量分析器分开后会被检测器检测并记录下来，经计算机处理后以质谱图的形式表现出来，最终确定样品的相对分子质量和分子结构的方法。质谱法的出现使对蛋白质的研究从鉴定深入到结构，具有重要意义。刘文颖等[19]采用正交加速电喷雾串联四极杆-飞行时间质谱仪测得乌鸡低聚肽铁的分子结构为苏氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸（threonine-serine-glycine-methionine-proline，TSGMP）。Wang 等[20]利用质谱法鉴定了凤尾鱼鱼粉蛋白水解物中具有抗氧化和抗菌活性的肽段结构为苏氨酸-脯氨酸-丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸（threonine-proline-serine-alanine-glycine-lysine，TPSAGK）、丝氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸（serineasparagine-leucine-glycine-glycine-lysine，SNLGGK）。明确具有抗氧化活性低聚肽的肽段结构，有助于更好地研究其作用机理。
2.6 动物源抗氧化低聚肽的分离纯化
抗氧化低聚肽的制备目前多采用以抗氧化活性为导向来分离纯化，最后再进一步对其序列进行结构鉴定的方式。采用该方法已经鉴定的肽见表1。此外，利用生物信息学技术也可获取低聚肽。通过电脑数据库快速预测，根据结构和功能关系，预测可能会表现出特定活性的肽序列，定位蛋白来源的“加密肽”，预测其会通过哪些特定的酶来释放，模拟优化酶解，然后经合成验证活性。左爱华等[21]采用高效液相色谱-串联质谱分析鉴定海参低聚肽中的肽段序列，利用数据库及构效关系对其中可能存在降压活性的肽进行活性筛选，发现了9 个可能存在降压活性的肽，需进一步合成鉴定。但由于抗氧化低聚肽数据库还不够完善，该方法目前还存在制约因素。
表1 具有抗氧化活性的动物源低聚肽
Table 1 Animal-derived oligopeptides with antioxidant activity
注：甘氨酸（glycine，G）；丙氨酸（alanine，A）；缬氨酸（valine，V）；亮氨酸（leucine，L）；异亮氨酸（isoleucine，I）；脯氨酸（proline，P）；丝氨酸（serine，S）；苏氨酸（threonine，T）；组氨酸（histidine，H）；谷氨酸（glutamic acid，E）；天冬氨酸（aspartic acid，D）；谷氨酰胺（glutamine，Q）；天冬酰胺（asparagine，N）；赖氨酸（lysine，K）；精氨酸（arginine，R）；半胱氨酸（cysteine，C）；甲硫氨酸（methionine，M）；苯丙氨酸（phenylalanine，F）；酪氨酸（tyrosine，Y）；色氨酸（tryptophan，W）。
蛋白来源低值海洋鱼乌鸡金枪鱼金华火腿乌鸡凤尾鱼鱼粉肽段结构TPSAGK TSGMP QGD、GEQSN、PKK、GPQ、GEEGD、YEGGD、GEGER、GEGQR、GPGLM、GLNGDRGD KRQKYD EF、EEL、EHPT、AGGF TPSAGK、SNLGGK肽的制备方法碱性蛋白酶、中性蛋白酶超滤<1 kDa凝胶过滤色谱法反相高效液相色谱法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中性蛋白酶、木瓜蛋白酶超滤<1 kDa反相液相色谱Q-TOF2 正交加速电喷雾串联质谱仪胃蛋白酶超滤DEAE-52 离子交换色谱Sephadex G-25 凝胶过滤色谱反相液相色谱蛋白质测序仪和电喷雾电离质谱酶解切向流过滤尺寸排阻色谱反相高效液相色谱LC-MS/MS（液相色谱串联质谱）木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶膜过滤分子排阻色谱法反相液相色谱质谱碱性蛋白酶、中性蛋白酶纳滤反相液相色谱质谱活性抗氧化金属Fe 螯合肽抗氧化抗氧化、抗炎症抗氧化抗氧化、抗菌参考文献[14][19][16][15][3][20]
3 动物源低聚肽的抗氧化活性
3.1 构效关系
大量的研究表明低聚肽的抗氧化活性与其氨基酸组成、分子量大小以及空间构象有关[22-25]。疏水性氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蛋氨酸）可以增加肽在脂质中的溶解度以及自由基之间的相互作用。芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸）可以提供质子清除自由基。酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）和碱性氨基酸（组氨酸、精氨酸、赖氨酸）可以清除羟基自由基、螯合金属离子。含硫氨基酸（蛋氨酸）易被氧化为蛋氨酸亚砜。其他氨基酸例如甘氨酸有可能是提供质子的一个潜在靶点，可以维持多肽骨架的强大柔韧性，作为单一的供氢体来中和活性氧。
3.2 活性机理
3.2.1 自由基清除能力和结合促氧化金属离子能力
活性氧（reactive oxygen species，ROS）是由氧衍生的自由基。ROS 包括超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）、过氧基（RO2·）、烷氧基（RO·）和氧化剂及容易转化为自由基的非自由基等，如次氯酸（HOCl）、臭氧（O3）、单线态氧（1O2）和过氧化氢（H2O2）。自由基的清除一般通过抗氧化肽的供氢供电子能力[26]。抗氧化肽所含的氨基酸种类、肽序列、分子量大小等构效关系都会影响其对ROS 的清除能力。
有些金属离子在生物体内具有重要的生理功能。但大多数金属具有还原性，尤其是一些如铁、锰、铜、锌等过渡金属，它们可以进行氧化还原反应，从而产生活性氧/氮自由基，引起氧化应激。同时金属离子也会介导脂质的过氧化反应[27]，例如，人体血浆中的亚铁离子与H2O2 发生的芬顿（Fenton）反应，产生·OH，从而催化膜脂质过氧化。抗氧化肽可以通过螯合金属离子，使其不能与过氧化物结合或使金属离子保持原有价态，不能还原分子氧，减少活性氧/氮自由基的产生。此外，抗氧化肽也可以通过提供氢原子与脂质氧化产生的脂质过氧自由基（LOO·）反应，形成较为稳定的氢过氧化物，从而阻断脂质自由基的链式反应。
3.2.2 调节人体抗氧化防御系统
人体存在多种抗氧化防御系统，可以通过清除ROS、与ROS 结合使其转化为稳定的无毒分子或修复ROS 对蛋白质、脂质、DNA 造成的损伤，来降低ROS对机体的危害。抗氧化防御系统可以分为酶和非酶性。酶抗氧化系统包括过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和非酶抗氧化系统VE、VC、β-胡萝卜素、谷胱甘肽等。
抗氧化肽也可以通过信号通路蛋白来调节抗氧化系统。核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是一种细胞外源性和氧化应激反应的主要转录因子，可以调节编码抗氧化蛋白、硫醇分子及其生成酶、解毒酶和应激反应蛋白的广泛基因的表达，从而减轻炎症和氧化损伤[28]。血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）可以降解亚铁血红素，形成抗氧化剂胆绿素或胆红素来消除ROS[29]。NAD（P）H：醌氧化还原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]是一种保护性抗氧化剂，可以保持一些内源性抗氧化剂的活性或还原状态[30]。Nrf2 可以直接调节HO-1 启动子活性并控制NQO1 的表达。而Nrf2 的活性由kelch 样ECH 关联蛋白（kelch like ECH associated protein 1，Keap1）控制，在正常细胞中，Keap1 与Nrf2 螯合，且将Nrf2 桥接到基于Gul3 的E3 连接酶来促进泛素化和之后的降解。当Keap1 被ROS 或电子修饰后，构象发生改变，使得Keap1 与Nrf2 解离，Nrf2进入到细胞核中，sMAF 转录因子通过其亮氨酸拉链结构域与Nrf2 结合，形成NRF2-MAF 复合物，识别抗氧化反应元件（antioxidant responseelement，ARE）并与之结合，激活抗氧化基因的转录和翻译，并诱导HO-1、NQO1 等抗氧化酶生成[28，31]。而抗氧化肽可以通过与Keap1 或Nrf2 结合，使Keap1 与Nrf2 分离，增加自由Nrf2 进入细胞核的数量来提高抗氧化能力。
3.2.3 调节细胞凋亡
线粒体是控制细胞凋亡的重要机制之一，高含量的ROS 会使线粒体膜电位发生改变，诱导促细胞凋亡因子的释放，从而使细胞发生凋亡。线粒体的凋亡途径与Bcl 蛋白家族（Bax、Bcl-2）有关，Kong 等[32]研究发现三文鱼心脏动脉球中3 种抗氧化肽可以下调促凋亡蛋白Bax，上调抗凋亡蛋白Bcl-2 来减少UVB 照射的人表皮生化细胞HaCaT 发生细胞凋亡。该研究还表明当线粒体中ROS 含量过高时，线粒体膜通透性发生变化，从而细胞色素C 进入到细胞质中与启动子半胱氨酸蛋白酶Caspase-9 结合，激活细胞凋亡执行蛋白Caspase-3。而外源细胞凋亡途径的启动则依赖于Caspase-8 蛋白激活死亡受体。此外，抗氧化肽也可以通过激活或抑制其他信号通路来调节细胞凋亡。Deng等[33]发现合成肽半胱氨酸-色氨酸-组氨酸-苏氨酸-组氨酸（cysteine-tryptophan-histidine-threonine-histidine，CWHTH）不仅可以通过激活信号通路PI3K/Akt 来激发下游底物抑制细胞凋亡，还可以抑制与细胞凋亡密切相关的细胞外信号调节激酶1 和2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2）及c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）。
3.2.4 其他
过量的ROS 也会引起机体的炎症反应，危害人体健康。刘睿等[34]研究表明核桃低聚肽可以提高抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性，提高抗氧化物GSH 含量，降低脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，抑制白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等血清炎症因子。肠道微生物的平衡也与人体健康密切相关，肠道菌群的失衡会导致生物体抗氧化活性的降低[35]。Han 等[36]发现从金枪鱼籽中筛选出的新肽亮氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酸-半胱氨酸（leucine-cysteine-glycine-glutamine-cysteine，LCGEC）可以维持小鼠肠道菌群的平衡，提高肠道衍生代谢产物3-吲哚丙酸（3-indolepropionic acid，IPA）和短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），发挥抗氧化作用。抗氧化肽也可以增强对氧化应激损伤的抵抗性。Wu 等[37]通过百草枯胁迫和热胁迫实验发现，海参肽可以提高秀丽隐杆线虫的耐热性和活动能力来增强其抗应激能力，从而延长寿命。
4 展望
目前关于动物源抗氧化肽的制备方法包括以抗氧化活性为导向的肽的制备和生物信息学技术，由于肽数据库还不够完善，现阶段还是前者使用较多。动物源抗氧化低聚肽虽然可以应用在功能性食品、保健品、特殊食品及药物等方面，但目前关于抗氧化低聚肽的研究还是多集中于实验室阶段，对于下游的食品开发应用较少。且对于动物源抗氧化低聚肽的风味、颜色以及其与食品基质的相互作用特点还未有明确研究。此外，尽管有许多关于动物源抗氧化肽对于DNA、脂质、蛋白质、炎症、细胞凋亡等作用方面的研究，以探讨其抗氧化活性机理，但对于动物源抗氧化肽在各通路之间的交叉作用还有待进一步深入。而且对于大多数动物源抗氧化肽的稳定性、生物有效性、毒理安全性和最低有效剂量等问题还未完全阐明。
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