吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一种红褐色、芳香、三环邻醌的化合物，是继黄素核苷酸和吡啶核苷酸后被发现的第3 种氧化还原酶的辅因子[1-4]，是一种新型的膳食补充剂。PQQ 可作为辅酶参与电子传递并表现出很强的抗氧化性[5-6]，具有防护肝损伤[7-8]、促进生物体生长[9]、加快神经生长因子合成速率、清除氮自由基等功能[10-11]，也可增强细菌对一些极端条件的耐受性，在食品、医药和化妆品领域都有重要的应用价值[12-13]。
PQQ 合成的骨架为酪氨酸和谷氨酸，2019 年底PQQ 的完整生物合成途径及关键酶催化机制得到初步阐明，其由短肽pqqA 经过S-腺苷基-L-甲硫氨酸合成酶修饰、肽水解、氧化、环化等步骤产生[14]。尽管已经有报道表明化学合成法能得到PQQ，但是化学合成法步骤繁琐、成本高，且环境污染严重，因此生物法生产PQQ更具前景。杨诗颖等[15]对产PQQ 的甲基营养菌进行紫外诱变35 s，稀释涂布在甲醇浓度为3%、4%的平板中进行初筛、复筛，获得一株耐甲醇的高产突变株高脱氮生丝微菌FJNU-6（hyphomicrobium denitrificans FJNU-6），该菌PQQ 产量从86.74 mg/L 提高到158.53 mg/L，提高了82.77%。而郑玲辉等[16]采用复合诱变育种的方法，对生丝微菌TK0415（hyphomicrobium sp.TK0415）进行紫外和亚硝基胍诱变，在80 t 发酵罐中培养240 h 后，PQQ 产量高达1 783 mg/L。Liu 等[17]在96 孔微滴定板上进行数个循环的联合诱变（γ 辐射+微波诱变），高通量筛选到一个高酶活性的稳定突变体H-8，PQQ 浓度比亲本菌株高16.1%。
本试验以一株能产生吡咯喹啉醌的细菌为原始菌株，采用紫外-微波-氯化锂复合诱变技术和高通量筛选方法对其进行菌种选育，使菌株的产PQQ 能力得到显著提升，以期为后续的发酵过程控制以及工业化提供参考。PQQ 生物合成途径见图1[18]。
图1 PQQ 生物合成途径
Fig.1 PQQ biosynthetic pathway
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
原始菌种Y-1 由常州大学药学院生物与食品工程学院实验室提供。
1.1.2 培养基
参考张静等[19]方法配制培养基。氯化锂培养基需要在种子培养基里加入一定浓度的氯化锂。
1.1.3 其他试剂
氢氧化钠、氯化锂：国药集团化学试剂有限公司；PQQ 标准品：山东浩天药业有限公司。
1.2 仪器与设备
3K15 台式高速冷冻离心机：德国Sigma 公司；ELx808 酶标仪：美国BioTek 公司；752 G 紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；1260 GPC 高效液相色谱、ZORBAX SB-C18（5µm，4.6 mm×250 mm）色谱柱：安捷伦科技（中国）有限公司；ZF-7C 手提紫外检测灯：上海顾村电光仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 产吡咯喹啉醌的菌株培养方法
1.3.1.1 种子培养
挑取平板上淡黄色形态饱满的单菌落一环，接入装有40 mL 种子培养基的250 mL 摇瓶中（8 层纱布包扎），于180 r/min、30 ℃条件下摇床培养72 h。
1.3.1.2 发酵培养
待种子液生长至对数期，按4% 的接种量吸取一定的液体种子于发酵培养基中，每个250 mL 摇瓶装液量50 mL，于180 r/min、30 ℃条件下培养168 h。
1.3.1.3 24 孔板培养
将诱变后的菌悬液稀释涂平板，挑取平板上的单菌落转接于装有3 mL 种子培养基的24 孔深孔板中，于30 ℃、180 r/min 振荡培养72 h，再按4% 接种量转接至装有3 mL 发酵培养基的24 孔深孔板中相同条件培养168 h，每个菌株3 个重复。
1.3.2 菌体的形态观察
将生长至对数期的种子液在固体培养基上划线，置于30 ℃培育4~7 d 获得单菌落，观察菌落形态特征的变化，然后进行结晶紫染色，通过光学显微镜观察菌体形态。
1.3.3 菌悬液的制备
将细菌培养液以8 000 r/min 离心10 min，弃上清液，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤离心3 次，重悬于45 mL 的无菌生理盐水中，再接入装有玻璃珠的无菌三角瓶，180 r/min 振荡20 min 打散菌体，然后将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管后，用细胞计数法观察，稀释菌液浓度至108 CFU/mL，此时，浑浊态的细胞液即为待处理菌悬液[20]。
1.3.4 紫外诱变
取5 mL 制备的菌悬液加到直径为7 cm 的无菌培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后将培养皿置于磁力搅拌器上。选用功率为15 W 的紫外灯，设置其与培养皿间距30 cm，在正式照射前，将紫外灯预热20 min，然后开启培养皿盖在搅拌下照射0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 s，操作均应在红灯下进行，避免白炽光[21]。吸取100 µL 稀释度为10-4 的菌悬液涂布于平板上，每组做3 个平行，用铝箔纸包好于30 ℃避光培养96 h，防止光修复反应。取未经紫外照射的等浓度菌悬液为对照组，记录每个平板的单菌落数目，按下式计算致死率，绘制致死率曲线。根据诱变效果，确定最佳照射时间，在平板上挑选出生长较快菌落，按照菌落培养的方法进行孔板复筛，比较不同复筛菌株的产量。致死率（Y，%）计算公式如下。
式中：x1 为未经处理的平板上单菌落数目，个；x2为处理后的平板上单菌落数目，个。
1.3.5 微波诱变
选用额定功率为700 W、工作频率为2 450 MHz的微波炉，吸取4 mL 稀释度为10-4 的菌悬液于6 mL玻璃试管中，将玻璃试管放在盛有无菌蒸馏水的50 mL烧杯中，烧杯内的溶液略高于菌悬液的上层液面，每隔15 s 换一次水，以减少微波的热效应造成菌悬液温度过高而导致菌体大量死亡。在P50、P80 挡位下，辐照时间依次为0、5、10、15、30、45、60、75、90 s[22]，吸取100 µL 诱变后的菌液涂布于平板上，每组做3 组平行，用铝箔纸包好于30 ℃避光培养96 h，进行菌落计数，计算致死率，绘制致死率曲线，挑选出长势良好的单菌落，孔板培养并分别测定其产量，确定微波诱变的最佳时间。
1.3.6 氯化锂诱变
取100µL 菌悬液均匀涂布于含浓度梯度为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的氯化锂平板上，30 ℃避光培养96 h，挑选出长势良好的单菌落进行孔板培养，计算致死率，绘制致死率曲线，确定氯化锂诱变的最佳浓度。
1.3.7 复合诱变
在紫外照射的最佳条件下诱变，挑选长势最好的平板，将平板上的菌落刮下配成菌悬液，用生理盐水梯度稀释为10-4、10-5、10-6 浓度的菌悬液，在最佳微波诱变条件下照射，吸100µL 涂布于氯化锂平板上，至30 ℃避光培养96 h，活菌数计算，筛选出产量最高的菌株。
1.3.8 菌株初筛
1.3.8.1 光谱法标准曲线建立
用10 mmol/L NaOH 将5 g/L 的PQQ 标准品逐级稀释至浓度分别为2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 g/L的溶液，经0.22µm 的水系膜过滤，超声脱气得标准品待测液。对不同浓度的PQQ 标准品待测液进行全波长扫描，再将不同浓度的PQQ 标准品分别加入96 孔板中进行酶标仪检测，每组做3 个，检测时要减去空白培养基的吸光度以除去干扰，以PQQ 浓度为横坐标，OD254 或OD330 为纵坐标，建立标准曲线[23]。
1.3.8.2 96 孔板检测发酵液PQQ
取2 mL 发酵液，10 000 r/min 离心10 min，弃沉淀，经0.22 µm 的水系膜过滤后，取100 µL 上清液至96 孔板中用光谱法检测。
1.3.9 菌株复筛
对初筛后的菌株进行复筛，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对PQQ 含量进行检测。HPLC 检测的方法如下[24]：将发酵液8 000 r/min 离心10 min，弃沉淀，用0.22 µm的水系膜过滤上清液。本试验采用ZORBAX SB-C18（5 µm，4.6 mm×250 mm）色谱柱，检测波长330 nm，进样量为10 µL，柱温25 ℃，利用安捷伦高效液相色谱仪测定PQQ 含量。流动相为甲醇（A）和水（C），用三氟乙酸调节pH 值至2.9，经过梯度洗脱，洗脱条件见表1。
表1 洗脱条件
Table 1 Elution conditions
时间/min 0~2.0 2.1~12.0 12.1~15.0溶剂A/%5 5→95 95溶剂C/%95 95→5 5洗脱等度梯度等度
1.3.10 分批发酵验证
以4% 的接种量将种子液接种到500 mL 发酵培养基中，装液量为100 mL，在30 ℃、180 r/min 下摇床培养。培养24 h 左右，每隔12 h 往摇瓶内补加甲醇1.5 g/L，并用氨水将pH 值控制为6.8~7.0，直到发酵结束。发酵过程中，每隔24 h 取样测定菌体pH 值、OD600以及PQQ 产量。
1.3.11 遗传稳定性研究
将复合诱变得到的高产菌株进行平板传代，连续传4 代，每代均按照1.3.8、1.3.9 中方法进行PQQ 的产量测定，选出遗传稳定性较好且产量最高的菌株进行保藏。
1.4 数据处理
所有试验结果以平均值±标准差表示，所有数据采用Excel 和Orgin 2021 软件进行统计和分析及作图。
2 结果与分析
2.1 光谱法检测PQQ 波长的确定
PQQ 标准品的全波长扫描结果见图2。
图2 PQQ 标准品的全波长扫描结果
Fig.2 Full wavelength scan of the PQQ standard
由图2 可知，通过光谱法全波长扫描PQQ 标准品溶液，建立了PQQ 的高通量筛选方法。全波谱扫描不同浓度的PQQ 标准品（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 g/L），结果发现其在254 nm 和330 nm 处有两个吸收峰，但254 nm 处的峰杂，考虑到发酵液在254 nm左右有蛋白、核酸等吸收值的物质，溶剂或流动相会受到干扰，而在330 nm 处吸收值的物质较少，因此选择330 nm 作为检测波长。
本试验选择研究PQQ 浓度和OD330 的关系，结果如图3 所示。
图3 光谱法标准曲线
Fig.3 Spectrometric standard curve
由图3 可知，OD330 和PQQ 浓度的线性关系为y=5.772 9 6x-0.181 8，R2=0.999 86，线性关系良好。利用光谱法能更加快速简便地测定PQQ 浓度，操作简单快捷，可用于大批次的诱变试验样品的测定。
2.2 HPLC 法检测PQQ
本试验采用的流动相为甲醇和水，色谱柱为ZORBAX SB-C18（5µm，4.6 mm×250 mm），考虑到色谱柱的耐酸性，将流动相的水用三氟乙酸调至pH 值为2.9 左右。再将准备好的标准品（0.125、0.250、0.500、1.000、2.500 g/L）进行HPLC 检测，每个浓度连续进样2 次，检测波长330 nm，标准曲线的测定结果见表2。
表2 标准品中PQQ 含量标准曲线
Table 2 Standard curve of PQQ content in standard products mAU
PQQ 浓度/（g/L）0.125 0.250 0.500 1.000 2.500 HPLC 峰面积第一次检测908.67 1 898.09 4 345.87 8 675.69 21 294.32第二次检测890.37 1 887.03 4 352.63 8 700.01 21 510.76平均值899.52 1 892.56 4 349.25 8 687.85 21 402.54
以PQQ 峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见图4。
图4 HPLC 法标准曲线
Fig.4 HPLC standard curve
由图4 所知，HPLC 回归方程为y=8 633.773 33x-108.207 67，R2=0.999 71，线性关系良好，结果表明本试验建立的HPLC 法检测PQQ 具有良好的可行性，可用于突变菌株的复筛检测。
2.3 诱变结果
2.3.1 紫外诱变选育高产菌株
紫外诱变对致死率的影响结果见图5。
图5 紫外照射时间对致死率的影响
Fig.5 Effect of UV exposure time on lethality
由图5 可知，菌株的致死率与紫外照射时间成正比，当处理50 s 和60 s 时，致死率分别为81%和89%。为获得较高的正突变率、方便诱变菌株的筛选，诱变致死率选择在80%~90%，在此范围内所处理剂量确定为各诱变剂的最佳诱变剂量，因此挑选被照射50~60 s范围内的菌株进行诱变，将诱变后的菌株用光谱法进行初筛，得到54 株诱变菌株，再用HPLC 法进行复筛发酵测定，得到诱变菌株UV5-Y，产量从初始57.0 mg/L提高到80.5 mg/L，提高了41%。部分紫外诱变菌株的产量见表3。
表3 部分紫外照射菌株的筛选结果
Table 3 Screening results of some UV-irradiated strains
菌株编号原始菌UV5-Y UV5-R UV6-R UV7-Y UV7-R PQQ 产量/（mg/L）57.0±1.0 80.5±0.8 72.3±1.8 68.5±2.2 66.6±1.1 79.8±0.9提高率/%0 41 27 20 17 40
由表3 可知，部分菌株经紫外照射后其产量均比原始菌提高，尤其是UV5-Y 的提高幅度最大，提高率为41%，其余菌株产量虽有所提高，但提高率均低于UV5-Y，所以选择UV5-Y 的紫外诱变条件的基础上进行复合诱变，以进一步筛选高产菌株。
2.3.2 微波诱变选育高产菌株
微波诱变时间、诱变的功率都与菌株的致死率有关，微波诱变对致死率的影响结果见图6。
图6 微波诱变时间对致死率的影响
Fig.6 Effect of microwave mutagenesis time on lethality
由图6 可知，诱变时间越长，诱变菌株的致死率越高。在P50 挡位下，当微波诱变时间达到90 s 时，致死率达到100%，而在P80 挡位下，照射60 s，致死率也达到了100%。在P50 挡位下，诱变时间为60 s，菌株的致死率为85%；而在P80 挡位下，菌株在诱变15 s的时候致死率为87%。因此，选用以上致死率在80%~90%范围内的菌株。
用光谱法先对该范围内的菌株进行初筛，筛选出82 株诱变菌株，再用HPLC 法进行复筛发酵测定，得到诱变菌株MWP8-15Y，产量提高到68.7 mg/L，提高了18%。部分微波诱变菌株的产量见表4。
表4 部分微波诱变菌株的筛选结果
Table 4 Screening results of microwave mutagenesis strains
菌株编号原始菌株MWP5-3R MWP5-3Y MWP5-6R MWP5-6Y MWP8-15R MWP8-15Y MWP8-45R MWP8-45Y PQQ 产量/（mg/L）58.3±0.9 63.5±1.7 64.8±2.5 68.6±1.9 62.3±0.9 63.0±2.1 68.7±0.7 67.2±1.6 61.1±1.9提高率/%0 9 11 18 7 8 18 15 5
由表4 可知，部分菌株经微波诱变后其PQQ 产量均比原始菌提高，其中MWP5-6R 与MWP8-15Y 的提高幅度最大，提高率为18%，其余菌株产量虽有所提高，但提高率均低于MWP5-6R 与MWP8-15Y，所以选择MWP5-6R 或者MWP8-15Y 的微波诱变条件的基础上进行复合诱变，以进一步筛选高产菌株。
2.3.3 氯化锂诱变选育高产菌株
氯化锂诱变处理的结果见图7。
图7 氯化锂诱变的致死率
Fig.7 Lethality rate induced by lithium chloride
由图7 可知，在一定范围内，氯化锂浓度越大，菌株的致死率越高，当氯化锂浓度超过0.4%时，菌株的致死率达到85%，在最佳诱变范围内，因此确定0.4%为氯化锂的最适诱变浓度。
光谱法筛选出71 株诱变菌株后，再用HPLC 法复筛，得到诱变菌株LICL-4Y，产量提高到74.8 mg/L，提高了30%。部分氯化锂诱变菌株的产量见表5。
表5 部分氯化锂诱变菌株的筛选结果
Table 5 Screening results of mutagenic strains induced by lithium chloride
菌株编号原始菌株LICL-1Y LICL-1R LICL-31Y LICL-31R LICL-4Y LICL-4R LICL-41Y LICL-41R LICL-6Y LICL-6R PQQ 产量/（mg/L）57.5±0.5 70.6±1.2 68.3±2.9 68.7±1.7 65.4±3.2 74.8±1.6 67.3±0.8 73.1±0.9 66.1±1.5 73.6±1.4 70.0±0.7提高率/%0 23 19 19 14 30 17 27 15 28 22
由表5 可看出，部分菌株经氯化锂诱变后其PQQ产量均较原始菌有所提高，其中LICL-4Y 的提高幅度最大，提高率为30%，其余菌株产量虽有所提高，但提高率均低于LICL-4Y，由此可以看出LICL-4Y 的诱变效果较好，因此选择在LICL-4Y 的氯化锂诱变条件的基础上进行复合诱变，以进一步筛选PQQ 的高产菌株。
2.3.4 复合诱变选育高产菌株
符合诱变处理的结果见表6。
表6 部分复合诱变菌株的筛选结果
Table 6 Screening results of compound mutagenic strains
菌株编号原始菌株C5Y-6-4 C5Y-6-6 C5Y-15-4 C5Y-15-6 C5Y-45-4 C5Y-45-6 C7R-6-4 C7R-6-6 C7R-15-4 C7R-15-6 C7R-45-4 C7R-45-6 PQQ 产量/（mg/L）58.1±1.8 134.9±1.0 121.1±2.4 111.6±1.9 104.2±2.1 98.8±4.7 100.4±2.2 86.5±2.5 88.3±2.2 82.1±3.7 78.6±3.1 67.2±4.0 66.1±2.6提高率/%0 132 108 92 79 70 73 49 52 41 35 16 14
通过按照紫外、微波和氯化锂的单一诱变结果确定最佳诱变条件：紫外照射50 s、微波（350 W）照射60 s和氯化锂浓度为0.4%。复合诱变后平板上的突变菌株菌落大小不一，多数长势缓慢退化，菌苔稀薄，少数生长较快。经初筛获得复合诱变突变菌株97 株，分别对其进行液体发酵培养并测定发酵产物中PQQ 的含量，由表6 可知，菌株C5Y-6-4 的产量最高达到134.9 mg/L，比原始菌株提高了132%。
2.4 高产菌株形态特征分析
原始菌株与高产菌株C5Y-6-4 的菌落形态见图8。
图8 原始菌株与高产菌株C5Y-6-4 的菌落形态
Fig.8 Colony morphology of the original strain and the highyielding strain C5Y-6-4
由图8 可知，平板上的菌落较小，边缘光滑且有光泽，随着菌龄增加，菌落表面略微出现褶皱，而诱变后的菌株菌落面积更小，表面更湿润、饱满，呈现微黄色。结果表明，经过复合诱变后，菌株的菌落形态发生明显变化。而在电子显微镜下观察菌株的菌体形态发现，诱变前后的菌株形态未发生明显变化，说明从形态上观察，复合诱变后的菌株是PQQ 产生菌。
2.5 高产菌株C5Y-6-4 分批发酵验证
为进一步考察高产菌株C5Y-6-4 的工业发酵性能，在500 mL 摇瓶中进行分批发酵，以原始菌株作对照，高产菌株C5Y-6-4 的发酵过程曲线如图9 所示。
图9 原始菌株和高产菌株C5Y-6-4 在摇瓶中的发酵过程曲线
Fig.9 Fermentation process curves of the original strain and the high-yield strain C5Y-6-4 in shaking bottles
由图9 可知，前24 h 菌株生长较为缓慢，pH 值变化幅度不大；在发酵48 h 后，菌株的pH 值明显下降，甲醇作为唯一碳源和能量来源而迅速被消耗，菌体快速进入对数生长期，高浓度的甲醇能刺激菌体的大量生长，而低浓度的甲醇则无法维持菌体的正常代谢，致使菌体大量衰亡，因此，每隔12 h 开始补加甲醇，并用氨水调节pH 值同时补充氮源，补加碳氮源在一定程度上延长了生命周期，但PQQ 的产量没有明显的提升；PQQ 直至96 h 才开始大量分泌至发酵液中，生物量也稳步增加，高产菌株C5Y-6-4 的吸光度达到6.142（OD600，168 h），此时产量为134.9 mg/L。
2.6 高产菌株的遗传稳定性分析
对表6 中产量大于100 mg/L 的5 株菌株（C5Y-6-4、C5Y-6-6、C5Y-15-4、C5Y-15-6、C5Y-45-6）进行遗传稳定性试验，结果如图10 所示。
图10 PQQ 高产菌株遗传稳定性
Fig.10 Genetic stability of PQQ high-yielding strains
由图10 可知，菌株C5Y-6-6、C5Y-15-6、C5Y-45-6传至第四代时产量比第一代分别降低了19%、14%、23%，高产性能不稳定。菌株C5Y-6-4、C5Y-15-4 高产性能相对稳定，其中，菌株C5Y-6-4 产量最高，四轮传代培养的PQQ 含量在133.8 mg/L 上下波动。因此选择突变株C5Y-6-4 进行分批发酵验证。
3 结论
本研究利用紫外-微波-氯化锂复合诱变一株能产生吡咯喹啉醌的细菌，通过96 孔板高通量筛选和高效液相色谱法检测，选育出一株遗传稳定的吡咯喹啉醌高产菌株C5Y-6-4，摇瓶产量为134.9 mg/L，是原始菌株的1.32 倍，连续传四代突变株遗传稳定，为工业化生产吡咯喹啉醌提供了较好的菌株和菌种育种的科学依据。本文通过诱变育种在摇瓶上得到较好的效果，在工业化上有较好的前景。在今后的研究中可以对该突变株结合动力学分析对发酵工艺进行优化，以及在发酵罐上对发酵不同时期的溶氧、pH 值、碳氮源含量及罐内补料方式等条件进行调控，以期进一步提高PQQ 的产量。
[1] DUINE J A, FRANK J Jr. The prosthetic group of methanol dehydrogenase.Purification and some of its properties[J].The Biochemical Journal,1980,187(1):221-226.
[2] WANG C X,ZHANG B R,ZHANG H Y,et al.Effect of dietary pyrroloquinoline quinone disodium in sows on intestinal health of the offspring[J].Food&Function,2020,11(9):7804-7816.
[3] QIN R, SUN J Y, WU J, et al. Pyrroloquinoline quinone prevents knee osteoarthritis by inhibiting oxidative stress and chondrocyte senescence[J]. American Journal of Translational Research, 2019,11(3):1460-1472.
[4] MISRA H S, RAJPUROHIT Y S, KHAIRNAR N P. Pyrroloquinoline-quinone and its versatile roles in biological processes[J]. Journal of Biosciences,2012,37(2):313-325.
[5] LIU L X, ZHANG Y Y, LIU T, et al. Pyrroloquinoline quinone protects against exercise-induced fatigue and oxidative damage via improving mitochondrial function in mice[J]. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2021,35(4):e21394.
[6] NAKANO M, KAMIMURA A, WATANABE F, et al. Effects of orally administered pyrroloquinoline quinone disodium salt on dry skin conditions in mice and healthy female subjects[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology,2015,61(3):241-246.
[7] KIM J, KOBAYASHI M, FUKUDA M, et al. Pyrroloquinoline quinone inhibits the fibrillation of amyloid proteins[J]. Prion, 2010,4(1):26-31.
[8] KOBAYASHI M, KIM J, KOBAYASHI N, et al. Pyrroloquinoline quinone (PQQ) prevents fibril formation of alpha-synuclein[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,349(3):1139-1144.
[9] MING D X,HUANG C Y,WANG W H,et al.Effects of diet supplemented with excess pyrroloquinoline quinone disodium on growth performance, blood parameters and redox status in weaned pigs[J].Animals,2021,11(2):359.
[10] 马科,吴贞贞,杨雪鹏.还原态吡咯喹啉醌清除氮自由基能力研究[J].食品与机械,2021,37(5):6-9,46.MA Ke, WU Zhenzhen, YANG Xuepeng. The research on scavenging nitrogen radical ability of reduced pyrroloquinoline quinone[J].Food&Machinery,2021,37(5):6-9,46.
[11] 杨亚欣,刘天,李彤,等.一株吡咯喹啉醌产生菌的筛选和初步鉴定[J].生物技术通讯,2018,29(5):609-612,624.YANG Yaxin, LIU Tian, LI Tong, et al. Isolation and preliminary identification of a pyrroloquinoline quinone producing strain[J].Letters in Biotechnology,2018,29(5):609-612,624.
[12] RUCKER R, CHOWANADISAI W, NAKANO M. Potential physiological importance of pyrroloquinoline quinone[J]. Alternative Medicine Review: a Journal of Clinical Therapeutic, 2009, 14(3):268-277.
[13] AKAGAWA M, NAKANO M, IKEMOTO K. Recent progress in studies on the health benefits of pyrroloquinoline quinone[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2016,80(1):13-22.
[14] LATHAM J A, BARR I, KLINMAN J P. At the confluence of ribosomally synthesized peptide modification and radical S-adenosylmethionine(SAM)enzymology[J].The Journal of Biological Chemistry,2017,292(40):16397-16405.
[15] 杨诗颖,陈佳,柯崇榕,等.吡咯喹啉醌产生菌的筛选及其培养基优化[J].药物生物技术,2014,21(5):429-432.YANG Shiying,CHEN Jia,KE Chongrong,et al.Screening and fermentation optimization for a pyrroloquinoline quinone producing strain[J].Pharmaceutical Biotechnology,2014,21(5):429-432.
[16] 郑玲辉,杜敏娜,朱小容,等.一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法:CN106282044B[P].2019-10-29.ZHENG Linghui, DU Minna, ZHU Xiaorong, et al. Hyphomicrobium sp. strain and preparation method for pyrroloquinoline quinone:CN106282044B[P].2019-10-29.
[17] LIU D, HU Z C, KE X, et al. Breeding of Gluconobacter oxydans with high PQQ-dependent D-sorbitol dehydrogenase for improvement of 6-(N-hydroxyethyl)-amino-6-deoxy-α-L-sorbofuranose production[J].Biochemical Engineering Journal,2020,161:107642.
[18] BARR I, STICH T A, GIZZI A S, et al. X-ray and EPR characterization of the auxiliary Fe-S clusters in the radical SAM enzyme PqqE[J].Biochemistry,2018,57(8):1306-1315.
[19] 张静,刘孟粟,秦志杰,等.吡咯喹啉醌高产菌株选育及发酵优化[J].食品与发酵工业,2022,48(16):56-64.ZHANG Jing,LIU Mengsu,QIN Zhijie,et al.Breeding and fermentation optimization of high titer pyrrorole-quinoline quinone strain[J].Food and Fermentation Industries,2022,48(16):56-64.
[20] 廖灿. 定向驯化选育高产吡咯喹啉醌脱氮生丝微菌[D]. 福州:福建师范大学,2016.LIAO Can. Directional domesticating breeding high-yielding pyrroloquinoline quinone producing hyphomicrobium denitrificans[D].Fuzhou:Fujian Normal University,2016.
[21] 魏静远, 李大攀, 赵炜楠, 等. 高效液相色谱法分析吡咯喹啉醌[J].生物技术通讯,2015,26(2):241-244.WEI Jingyuan, LI Dapan, ZHAO Weinan, et al. Determination of pyrroloquinoline quinine by high performance liquid chromatography[J].Letters in Biotechnology,2015,26(2):241-244.
[22] 王俊芳,张震,申梦雨,等.复合诱变选育壳聚糖酶高产菌种及产酶条件优化[J].中国酿造,2021,40(5):108-112.WANG Junfang, ZHANG Zhen, SHEN Mengyu, et al. Breeding of high-yield chitosanase strain by compound mutation and optimization of enzyme production conditions[J].China Brewing,2021,40(5):108-112.
[23] 赵赛赛,张小丹,贾晓妍,等.高产硝酸盐还原酶Staphylococcus simulans ZSJ6 的复合诱变选育及其酶学性质研究[J].生物技术通报,2023,39(4):103-113.ZHAO Saisai, ZHANG Xiaodan, JIA Xiaoyan, et al. Investigation on the complex mutagenesis selection of high-yield nitrate reductase strain Staphylococcus simulans ZSJ6 and its enzymatic properties[J].Biotechnology Bulletin,2023,39(4):103-113.
[24] 朱道洋, 魏春雨, 余晓斌. 吡咯喹啉醌产生菌的筛选和菌种鉴定[J].食品与发酵工业,2021,47(10):159-163.ZHU Daoyang, WEI Chunyu, YU Xiaobin. Screening and identification of pyrroloquinoline quinone producing strains[J]. Food and Fermentation Industries,2021,47(10):159-163.