赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由曲霉属或青霉属产生的一类真菌毒素，具有肾毒性、肝毒性等毒害作用，已被世界卫生组织和国际癌症研究机构归类为2B 类致癌物[1-2]。OTA 广泛存在于各种农副产品中，因此世界各国对各种农副产品进行了严格的监测及监管限制[3-4]。目前，推测OTA 的生物合成途径是由乙酰辅酶A 和丙二酰辅酶A 经聚酮合成酶（polyketide synthases，PKS）作用合成7-甲基蜂蜜曲霉素，然后被细胞色素P450 单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，P450）氧化生成赭曲霉毒素β（ochratoxin β，OTβ），OTβ 和L-苯丙氨酸在非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）作用下形成酰胺键进而形成赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB），OTB 再经卤代酶（halogenase，HAL）氯化，最终得到OTA[5-6]。
黑曲霉（Aspergillus niger）是一种重要的工业丝状真菌，应用于有机酸和胞外酶的生产[7-8]，于1987 年被美国食品和药物管理局（United States Food and Drug Administration，FDA）认定为一般认为安全（generally recognized as safe，GRAS）[9]。然而，黑曲霉也是食品和饲料中最常见的天然污染真菌之一，研究表明，黑曲霉菌株可以产生伏马毒素和赭曲霉毒素。Frisvad 等[10]研究发现在黑曲霉工业菌株中，约有33%能产生OTA，其中包括3 个重要的工业菌株NRRL 337、NRRL 3112和NRRL 3122。Bai 等[11]研究发现，有47% 的黑曲霉菌株产生伏马毒素，53%产生OTA。
对于同一种产毒菌株，其产毒性存在一定差异。在一些黄曲霉种群中存在高比例的非致毒性菌株[12]。在非致毒的黄曲霉（Aspergillus flavus）中，合成黄曲霉毒素的基因簇中存在缺失情况，且缺失种类多样，进而影响到不同的编码区[13]。同样，绝大多数的碳曲霉（Aspergillus carbonus）可以产生OTA，少数则不能[14]。在黑曲霉种群中，大多数的黑曲霉不能产生OTA，但有研究发现一些工业黑曲霉可以产生OTA，且与有机酸、单宁酶和β-半乳糖苷酶产生菌相比，糖化酶产生菌能产生更高水平的OTA[15]。因此，探究黑曲霉之间OTA 生物合成差异十分重要。
黑曲霉3.316 最高生长温度达47 ℃，且能够产生一种耐热的β-葡萄糖苷酶，该酶最适温度能达到60 ℃，β-葡萄糖苷酶具有降解纤维素、提高饮料和葡萄酒风味等作用，因此黑曲霉3.316 具有良好的工业应用前景[16]，而黑曲霉CICC 41702 是一种典型的能够合成OTA 的黑曲霉[17]，本文以黑曲霉3.316 和黑曲霉CICC 41702 为试验对象，利用Illumina 技术分别对两株黑曲霉的基因组进行重测序，并与模式菌株黑曲霉CBS 513.88 的参考基因组进行比较，深度挖掘基因组范围内的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入或删除（insertions or deletions，In-Del）、结构性变异（structural variants，SV）、拷贝数变异（copy number variation，CNV）等信息，揭示两株黑曲霉菌株的基因组水平的差异，对参与OTA 生物合成的基因进行新的特异性生物信息学分析，揭示黑曲霉产OTA 的机制，以期为黑曲霉在工业中的安全使用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
黑曲霉3.316：中国普通微生物菌种保藏管理中心；黑曲霉CICC 41702：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 主要试剂
OTA 标准品：坛墨质检标准物质中心；乙腈（色谱纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；甲酸（色谱纯）：天津市富宇精细化工有限公司；异丙醇（色谱纯）：南京化学试剂股份有限公司；氯仿（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GP1 裂解液：赛默飞世尔科技公司；琼脂粉、酵母提取物（均为分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、无水硫酸镁（均为分析纯）：天津欧博凯化工有限公司；蔗糖、NaNO3、七水合硫酸镁、KCl、四水合硫酸亚铁、K2HPO4、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Fe2SO4·7H2O（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
PDA 培养基：琼脂18 g/L，蔗糖30 g/L，NaNO33 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，四水合硫酸亚铁0.01 g/L，pH6.0~6.5，121 ℃条件下灭菌20 min。CYA培养基：蔗糖30 g/L，酵母提取物5 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO3 3 g/L，K2HPO4 1 g/L，查氏浓缩液10 mL，固体培养基中加入琼脂粉18 g/L，121 ℃、20 min 灭菌。查氏浓缩液：Fe2SO4·7H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.05 g，用水定容至100 mL 容量瓶中[16]。
1.2 仪器与设备
MJX-250B-Z 霉菌培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZQPL-200 立式全温振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；N-1100 旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；CR22N 高速冷冻离心机：日本日立工机公司；1260 液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；CBM-20A-TRIPLEQUADTM 5500 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：日本岛津实验器材有限公司；Covaris 超声波破碎仪：上海土森视觉科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 生长曲线绘制
将黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 分别接种于PDA 平板，3 组平行，置于霉菌培养箱中28 ℃培养5 d，将培养好的平板配制成孢子悬液，吸取500µL 接种于100 mL CYA 液体培养基中，置于摇床中28 ℃振荡培养，分别培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d，用滤纸过滤，置于80 ℃干燥箱中烘干至恒重。
1.3.2 黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 中OTA 的检测
吸取500µL（1×106 个/mL）黑曲霉的孢子悬液，分别接种到100 mL CYA 液体培养基中，25 ℃避光培养，依据QuEChERS 方法，并参考闫航滨等[18]黑茶中OTA提取分析方法，对发酵液中的OTA 进行提取检测。取30 mL 发酵液，然后按体积1∶1 加入乙腈、1∶0.001 加入甲酸和4.5 g 氯化钠，涡旋1 min 后5 000 r/min 离心10 min，取上清液，重复2 次，合并上清液，再加入1.2 g氯化钠、1.2 g 硫酸镁，涡旋1 min 后5 000 r/min 离心10 min，取上清，旋转蒸发浓缩至3.0 mL，用0.22µm 有机系滤膜过滤，然后利用高效液相色谱-荧光检测（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）法检测，并进行质谱分析定性。
1.3.3 DNA 的提取与全基因组重测序
黑曲霉样本用GP1 裂解液将细胞裂解后用氯仿抽提去除裂解液中的杂质，异丙醇沉淀后得到基因组DNA。经电泳检测合格的DNA 样品用超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp 的片段。处理完成后的DNA 片段，再经末端修复、加A 尾、加测序接头、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、片段筛选和纯化步骤完成整个文库制备工作并对文库进行质量检测，库检合格后，由北京诺禾致源科技股份有限公司进行Illumina NovoSeq 测序。
1.3.4 测序数据的变异检测与注释
对原始数据进行过滤，去除低质量和引物污染的reads，获取高质量的clean reads。将黑曲霉3.316 和黑曲霉CICC 41702 获得的clean reads 与参考基因组序列进行比对分析，根据比对情况检测样品的SNP、In-Del、SV 和CNV，并对其结果分析注释。
1.3.5 变异基因功能注释
将变异基因进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）注释。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2019 软件对数据进行处理分析，IBM SPSS Statistics 26 软件进行差异显著性分析（P<0.05 为差异显著，具有统计学意义），利用Origin 2022 绘制图形。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 的生长曲线
两株黑曲霉的生长曲线见图1。
图1 黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 的生长曲线
Fig.1 Growth curves of Aspergillus niger 3.316 and Aspergillus niger CICC 41702
由图1 可知，两株黑曲霉在1~4 d 的生长速率较快，第4 天开始菌丝生长趋于平缓。经过液体培养基培养10 d，两株黑曲霉的菌丝生长速率无明显差异，菌丝体生长速率整体上表现一致。
2.2 黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 的OTA 鉴定
经过CYA 液体培养基培养10 d 后，利用HPLCFLD 法检测黑曲霉3.316 和黑曲霉CICC 41702 发酵液中的OTA，结果见图2。
图2 两种黑曲霉发酵液中OTA 的HPLC 检测图谱
Fig.2 HPLC spectrums of OTA in two Aspergillus niger fermentation broths
由图2 可知，OTA 标准品的出峰时间为10.864 min。黑曲霉3.316 在10.864 min 时未出峰，即在黑曲霉3.316 的发酵液中未检测到OTA，而黑曲霉CICC 41702在10.861 min 时出现峰值，推测该峰为OTA。通过超高效液相色谱质谱联用仪检测后，OTA 标准品的离子丰度比为54.5%，在43.6%~65.5% 的范围内可认定为OTA，黑曲霉CICC 41702 发酵液中的离子丰度比为55.7%，表明该发酵液中存在OTA，而黑曲霉3.316 发酵液中的离子丰度比为1.8%，则不存在OTA。两株黑曲霉中OTA 含量见图3。
图3 黑曲霉3.316 与黑曲霉CICC 41702 中OTA 含量
Fig.3 OTA content of Aspergillus niger 3.316 and Aspergillus niger CICC 41702
由图3 可知，经过CYA 液体培养基培养10 d 后，利用HPLC-FLD 法分别检测黑曲霉3.316 和黑曲霉CICC 41702 发酵液中OTA 的含量，黑曲霉3.316 在经过培养后未检测到OTA，黑曲霉CICC 41702 中OTA含量从第3 天开始明显增加，且随着培养时间的延长，OTA 含量逐渐增高，当培养7 d 时，OTA 含量最高，达到226.3 ng/mL，随后OTA 含量开始降低，这有可能是由于随着培养时间的延长，菌株活力下降和部分OTA出现降解。
2.3 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组重测序分析
利用Illunima 高通量技术对黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 进行全基因组重测序分析见表1。
表1 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组重测序分析数据汇总
Table 1 Data summary of whole-genome resequencing analysis of Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
样本黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316过滤后数据/G 4.20 4.80错误分布率/%0.03 0.03 Q20/%96.49 96.97 Q30/%91.03 91.91 GC 含量/%50.48 49.77比对率/%97.39 92.41平均测序深度/X 92.29 101.96 1 倍覆盖度/%99.97 97.96 4 倍覆盖度/%99.95 97.82
由表1 可知，对原始测试数据进行过滤，分别获得4.20 G 和4.80 G 的过滤后数据，错误分布率均为0.03%。与参考基因组的比对率分别为97.39% 和92.41%，平均测序深度分别为92.29 X 和101.96 X，1 倍覆盖度分别为99.97%和97.96%，4 倍覆盖度分别为99.95%和97.82%。
2.4 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组变异基因检测及注释
2.4.1 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组SNP 检测及注释
SNP 是指可能发生在基因组中某些特定位置的单核苷酸的变异，使用GATK 软件检测单个SNP 变异，然后使用ANNOVAR 软件对检测到的SNPs 进行注释，结果见图4。
图4 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 中SNP 在基因组各区域的分布
Fig.4 Distribution of SNP in Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316 in different regions of genome
由图4 可知，与参考基因组黑曲霉CBS 513.88 比对，黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 分别检测到4 196 个和541 131 个SNP 变异位点。其中分别有574 个和82 181 个位于黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316的基因上游区域，变异比例分别占13.68%和15.18%；分别有832 个和185 658 个位于外显子区域，占19.83%和34.31%；内含子区域分别有243 个和45 647 个，占5.79%和8.44%；位于剪切位点的最少，分别有5 个和216 个；位于基因下游区域的分别有770 个和82 546 个，占18.35% 和15.25%；位于基因间区域的分别有1 482 个和86 985 个，占35.32% 和16.07%。黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 编码区SNP 变异的数据统计见表2。
表2 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 的SNP 变异数据统计
Table 2 Statistics of SNP variation data of Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
样本黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316 SNP总量4 196 541 131转换数2 888 369 441颠换数1 308 171 690转换与颠换的比率2.208 2.152全基因组杂合率/%0.098 11.768
黑曲霉CICC 41702 的同义突变占其SNP 总量的48.80%，错义突变占50.00%，黑曲霉3.316 则分别为69.47% 和30.18%。由表2 可知，黑曲霉CICC 41702和黑曲霉3.316 的SNP 转换与颠换的比率分别为2.208 和2.152。黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316的全基因组SNP 突变均以T∶A>C∶G 和C∶G>T∶A 为主要突变类型。
2.4.2 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组In-Del 检测及注释
InDel 是指在DNA 中插入或删除≤50 bp 的序列，使用GATK 检测InDels，随后使用ANNOVAR 进行注释见图5。
图5 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 中InDel 在基因组各区域的分布
Fig.5 Distribution of InDel in Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316 in different regions of genome
由图5 可知，与参考基因组黑曲霉CBS 513.88 比对，分别有211 个和13 878 个位于黑曲霉CICC 41702和黑曲霉3.316 的基因上游区域，变异比例分别占18.25%和22.04%；分别有210 个和3 433 个位于外显子区域，占5.45% 和18.17%；内含子区域分别有164 个和7 461 个，占14.19%和11.85%；位于剪切位点的最少，分别有14 个和92 个；位于基因下游区域的分别有83 个和15 133 个，占7.18%和24.03%；位于基因间区域的分别有233 个和12 858 个，占20.16% 和20.42%。黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 编码区InDel 变异的数据统计见表3。
表3 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 的InDel 变异数据统计
Table 3 Statistics of InDel variation data of Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
样本黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316 InDel总量1 156 62 968插入数540 31 642缺失数616 31 207全基因组杂合率/%0.011 1.443
由表3 可知，黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316分别检测到InDel 总量为1 156 个和62 968 个。黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 分别检测到540 个和31 642 个插入数，占46.71%和50.25%；检测到616 个和31 207 个缺失数，占53.29%和49.56%。
2.4.3 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组SV检测及注释
SV 是指具有相对较大长度（>50 bp）的基因组变异，包括缺失、重复、插入、倒位和易位，使用Break-Dancer 软件检测插入、删除、倒位、染色体内易位和染色体间易位突变，结果见表4。
表4 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 的SV 变异数据统计
Table 4 Statistics of SV variation data of Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
样本黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316 SV 总量141 757插入数9 11缺失数60 411倒位数23 43染色体内易位数28 148染色体间易位数21 108
由表4 可知，黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316分别检测到SV 总量为141 个和757 个。其中黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 分别检测到9 个和11 个插入数、60 个和411 个缺失数、23 个和43 个倒位数、28 个和184 个染色体内易位数、21 个和108 个染色体间易位数。使用ANNOVAR 进行注释，结果见图6。
图6 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 中SV 在基因组各区域的分布
Fig.6 Distribution of SV in Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316 in different regions of genome
由图6 可知，分别有6 个和46 个位于黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 的基因上游区域，变异比例分别占4.26%和6.08%；分别有59 个和217 个位于外显子区域，占41.84%和28.67%；内含子区域分别有3 个和6 个，占2.13%和0.79%；位于基因下游区域的分别有3 个和55 个，占2.13% 和7.27%；位于基因间区域的分别有17 个和85 个，占12.06% 和11.23%。对两株黑曲霉的SV 变异长度进行分析，结果见图7。
图7 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 中SV 的长度分布
Fig.7 Length distribution of SV in Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
由图7 可知，在黑曲霉CICC 41702 检测到的SV总量中发现，超过30%的SV 长度为300~400 bp，其次有25% 的SV 长度>1 200 bp，大约有18% 的SV 长度在200~300 bp。在黑曲霉3.316 检测到的所有SV 变异中发现，超过33%的SV 长度为300~400 bp，其次有23% 的SV 长度在100~200 bp，大约有17% 的SV 长度>1 200 bp。
2.4.4 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 全基因组CNV 检测及注释
CNV 是一种结构性变异，显示基因组中的缺失或重复，对检测到的CNV 由ANNOVAR 进行注释，结果见图8。
图8 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 中CNV 在基因组各区域的分布
Fig.8 Distribution of CNV in Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316 in different regions of genome
由图8 可知，经过注释发现分别有16 个和47 个CNV 位于黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316 的基因上游区域，变异比例分别占14.29%和10.35%；分别有59 个和244 个位于外显子区域，占52.68%和53.74%；内含子区域分别有4 个和2 个，占3.57%和0.44%；位于基因下游区域的分别有7 个和71 个，占6.25% 和15.64%；位于基因间区域的分别有18 个和59 个，占12.07% 和13.00%。使用CNVnator 检测潜在缺失和重复的CNV，结果见表5。
表5 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 的CNV 变异数据统计
Table 5 Statistics of CNV data of Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
样本黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316 CNV总量121 454拷贝数增加数25 2拷贝数减少数87 452 CNV 重复的总长度/bp 422 400 61 300 CNV 缺失的总长度/bp 212 500 2 082 700
由表5 可知，黑曲霉CICC 41702 和黑曲霉3.316分别检测到CNV 总量为121 个和454 个。其中黑曲霉CICC 41702 检测到25 个拷贝数增加数，增加的总长度为422 400 bp，87 个拷贝数缺失数，缺失总长度为212 500 bp。黑曲霉3.316 检测到2 个拷贝数增加数，增加的总长度为61 300 bp，452 个拷贝数缺失数，缺失的总长度为2 082 700 bp。
2.5 OTA 合成途径中的关键基因在黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 中的变异检测及注释
将两株黑曲霉的变异结果与参考基因组黑曲霉CBS 513.88 比对，分析OTA 生物合成途径中关键酶的变异情况，结果见表6。
表6 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 的5 种关键酶的变异数据统计
Table 6 Statistics of variation data of five key enzymes in Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
样本SNP InDel SV CNV黑曲霉3.316黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316黑曲霉CICC 41702黑曲霉3.316黑曲霉CICC 41702 PKS/个6 269 6 347 17 8 2 8 3 NRPS/个4 201 2 237 3 4 2 2 0 P450/个4 102 0 419 5 5 4 6 4 bZIP/个679 0 186 1 4 0 3 0 HAL/个90 0 11 0 0 0 0 0总数/个15 341 8 1 200 26 21 8 19 7
经分析发现黑曲霉3.316 中检测到共有45 种PKS、24 种NRPS、53 种P450、1 种HAL、11 种碱性亮氨酸拉链转录因子（basic leucine zipper，bZIP）发生变异，黑曲霉CICC 41702 中检测到共有16 种PKS、6 种NRPS、10 种P450、1 种bZIP 发生变异。由表6 可知，在黑曲霉3.316 中，从编码上述蛋白的基因中共检测到15 341 个SNP、1 200 个InDel、21 个SV、19 个CNV，在黑曲霉CICC 41702 中共检测到8 个SNP、26 个In-Del、8 个SV、7 个CNV。将这些变异基因进行GO 和KEGG 注释分析，结果见图9。
图9 黑曲霉CICC 41702、黑曲霉3.316 的5 种关键酶变异基因的GO 注释分析和KEGG 注释分析
Fig.9 GO annotation analysis and KEGG annotation analysis of five key enzyme variation genes of Aspergillus niger CICC 41702 and Aspergillus niger 3.316
由图9 可知，黑曲霉3.316 注释到的生物学过程主要有氧化还原、细胞代谢、生物合成、DNA 依赖型转录调控、甾类化合物合成、胞外多糖生物合成、酒精代谢；分子功能主要有转移酶活性，转移除氨基酰基以外的酰基、氧化还原酶活性、血红素结合、铁离子结合、辅酶结合、甲基转移酶活性、3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]合成酶活性、锌离子结合、DNA 结合、3-β-羟基-δ-5-甾醇脱氢酶活性、序列特异性DNA 结合、序列特异性DNA 结合转录因子活性、DTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶活性、水解酶活性等；细胞组分主要为细胞核等[19]。黑曲霉CICC 41702 注释到的生物学过程主要有氧化还原、脂肪酸生物合成、细胞代谢、生物合成；分子功能主要有氧化还原酶活性、转移酶活性、锌离子结合、甲基转移酶活性、3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白]合成酶活性、辅酶结合、血红素结合、铁离子结合等；细胞组分主要为细胞膜。KEGG 通路分析结果显示，黑曲霉3.316中有299 个变异基因注释在铁蛋白合成酶、245 个6-甲基水杨酸合成酶、221 个胶粘毒素/曲氯菌素生物合成肽合成酶、190 个镰孢氨酸C 合成酶、154 个AP-1样转录因子、150 个细胞色素P450 家族619、145 个短卷曲螺旋蛋白、132 个萘-γ-吡喃酮聚酮合酶、105 个棘孢菌素聚酮合酶、101 个黄素卤化酶、95 个苯乙酸2-羟化酶、80 个真菌一氧化氮还原酶、40 个苯丙氨酸解氨酶等代谢通路。
对黑曲霉OTA 合成途径中5 个关键酶的基因进行比对，结果见表7。
表7 黑曲霉3.316 的OTA 合成途径中5 种关键基因的变异数据统计
Table 7 Statistics of variation data of five key genes in OTA synthesis pathway of Aspergillus niger 3.316
基因An15g07920（PKS）An15g07910（NRPS）An15g07900（P450）An15g07890（bZIP）An15g07880（HAL）SNP非同义突变12 0 0 0 0同义突变3 0 0 0 0上游/下游40 0 0 0 0 InDel 12 0 0 0 0 SV 0 0 0 0 0 CNV 1 1 1 0 1总数/个68 1 1 0 0
由表7 可知，在黑曲霉3.316 中的编码PKS 的An15g07920 基因检测到68 个变异，其中55 个SNP，包括12 个非同义突变，3 个同义突变；12 个InDel；1 个CNV 变异。An15g07920 基因显示在外显子区域的1 854 501 位到1 878 100 位缺失，缺失长度为23 600 bp，推测An15g07920 基因的部分缺失可能导致了两株黑曲霉OTA 生物合成的差异。
3 讨论与结论
尽管在许多工业过程中，黑曲霉已被赋予GRAS，但其在工业应用中可能会产生真菌毒素[20]。黑曲霉CBS 513.88 的全基因组序列公布为研究OTA 生物合成途径奠定了基础[21]。到目前为止，对于黑曲霉的OTA 生物合成途径中的关键酶PKS、NRPS、P450、bZIP，已通过基因失活和表达试验，进行了功能表征，证实这些基因与OTA 的生成密切相关[17，22-24]。黑曲霉CBS 513.88 经过培养后可以产生OTA[25]，黑曲霉CBS 513.88 在23 ℃暗培养5.5 d 后，在YES、YEG 和YEA 固体培养基上，OTA 浓度分别达到4.19、3.64、21.93µg/g干菌丝，这一结果与本试验的变异结果相符合。Vesth等[26]利用黑曲霉片段基因组测序，比较26 种黑曲霉的种间和种内变异，发现次生代谢和调控是曲霉种类划分的重要因素。Castellá 等[27]对4 株碳曲霉进行重测序，与参考基因组比对发现产OTA 的菌株比不产毒的菌株有更多的突变。
通过对两株黑曲霉全基因组重测序的变异数据进行分析，SNP 变异类型包括转换和颠换，一般情况下二者的比率为2~2.5，本试验中两株黑曲霉的结果均符合该范围。杂合率越高，代表变异数量越高，因此黑曲霉3.316 比黑曲霉CICC 41702 有更高的SNP 和InDel 变异。总体上，黑曲霉CICC 41702 的SV 变异长度大于黑曲霉3.316 的SV 长度。黑曲霉3.316 中SNP 数量、InDel 数量、SV 数量和CNV 数量分别是黑曲霉CICC 41702 的129 倍、54.5 倍、5.4 倍和3.8 倍，表明黑曲霉CICC 41702 与参考基因组更接近。这一结果符合参考基因组黑曲霉CBS 513.88 和黑曲霉CICC 41702 可以产生OTA，而黑曲霉3.316 则不产毒的结果。
黑曲霉的OTA 的生物合成途径中主要包含PKS、NRPS、P450、bZIP 转录因子和HAL。通过与参考基因组黑曲霉CBS 513.88 比对，在黑曲霉3.316 中检测到的变异基因比黑曲霉CICC 41702 大大增加，对这些变异基因进行GO 和KEGG 分析，推测黑曲霉的OTA 生物合成可能主要集中在氧化还原，细胞代谢和生物合成等途径，与聚酮合成酶，非核糖体肽合成酶，细胞色素P450，黄素卤化酶，苯丙氨酸等通路相关。在黑曲霉3.316 中检测到在编码PKS 的An1507920 基因存在大量的非同义突变，并显示在外显子区域的1 854 501位到1 878 100 位缺失了23 600 bp，这一结果与Andersen 等[28]研究在黑曲霉的非致毒性菌株ATCC 1015和ATCC 9029 中，通过与产毒菌株CBS 513.88 中的假定的OTA 合成基因簇对比，鉴定出PKS 基因存在一个21 kb 的残基缺失的结果相近。相比黑曲霉CICC 41702，黑曲霉3.316 中基因的高突变率也可能是导致OTA 合成受阻因素之一，这一结果与Cabañes 等[29]探究碳曲霉菌株的OTA 合成差异的结果相近。
另一方面，OTA 的生物合成是复杂多样的，受多种因素的调控。研究发现，veA 基因既能正向又能负向调控OTA 的产生[30-31]。碳源、氮源、温度、水分活度、pH 值等环境因素也会显著影响OTA 的合成。有研究表明25 ℃和0.98~0.99 水分活度是黑曲霉的最适产毒条件，而水分活度在0.90 aw 时则无OTA 产生，最适产毒的碳源为阿拉伯糖，其次是蔗糖和葡萄糖，而蛋白胨抑制OTA 的产生[32-33]。因此，可通过转录水平，进一步探究黑曲霉中OTA 生物合成的调控机制。
在本研究中，利用超高效液相色谱质谱联用在黑曲霉3.316 中未检测到OTA，而在黑曲霉CICC 41702中检出了OTA。利用Illumina 技术对两株黑曲霉进行全基因组重测序，结果显示黑曲霉菌株的基因组多样性。黑曲霉3.316 比黑曲霉CICC 41702 有着更高的突变，且在An15g07920 基因上存在大量的非同义突变并缺失了23 600 bp。本研究可以为探究不同黑曲霉的OTA 生物合成差异并进行毒素的防控及去除，为提高黑曲霉在工业应用的安全性及规范化提供理论基础。
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