金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在大自然 中有着广泛的分布，容易污染牛奶、蔬菜等食物，并可能导致人类和动物的广泛感染[1-2]。其与沙门氏菌和副溶血性弧菌构成三大食源性微生物病原体[3-4]。由于缺少高效、迅速和直观的检测手段，由金黄色葡萄球菌导致的食品安全问题时有发生[5]。
目前，已经研发出几种用于快速检测和识别食品样本中金黄色葡萄球菌的技术，例如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[6]、酶联免疫传感器[7]和基于核酸的分子生物学方法。但这些方法通常价格高昂，需要高精密的设备和专业的技术人员，不适合作为现场检测方法。目前，许多国家还没有统一的标准来进行食源性病原生物检测，这使得食源性疾病的预防工作难以开展。另外，在一些偏远的地方，由于试验设备的不足，使食源性病原体的检测受到了严重的制约。因此，亟需开发快速、灵敏并适用于大规模检测的检测方法。
内溶素是由噬菌体产生的细胞壁肽聚糖水解酶[8]。通过特异性结合宿主细菌细胞壁并裂解其肽聚糖来实现病毒的释放[9]。革兰氏阳性菌的噬菌体中的内溶素主要由酶活结构域（enzyme active domain，EAD）和细胞结合域（cell binding domain，CBD）构成。酶活结构域（EAD）用于裂解肽聚糖，细胞结合域（CBD）有着特异性结合识别寄主的作用[10-11]。据研究报道，细胞结合域（CBD）在细菌细胞壁上至少存在107 个结合位点，且分子量通常比抗体小很多[12-14]。因此CBD 是极具潜力的抗体替代品。
通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）寻找到噬菌体80α基因组序列，其结构域如图1 所示。
图1 80α 噬菌体内溶素结构域
Fig.1 Domains of endolysin 80α
由图1 可知，80α 噬菌体的内溶素（80α endolysin）由N 端有着裂解活性的催化结构域（cysteine histidinedependent amidohydrolase/peptidase，CHAP）、中心酰胺酶3 催化结构域（Amidase 3）和C 末端SH3b 细胞结合域（CBD）3 个结构域构成。研究表明，Amidase 3-CBD与单独的CBD 相比，有着更为出色的金黄色葡萄球菌的结合能力，这说明中心酰胺酶3 催化结构域可能对CBD 结构域的结合起到积极的作用[15]。因此，本研究选用酰胺酶细胞结合域（Amidase 3-CBD）作为特异性识别结合金黄色葡萄球菌的受体蛋白。
SpyTag/SpyCatcher 系统为快速、可靠、不可逆的肽-蛋白质偶联工具[16-19]，有研究人员利用SpyTag/Spy-Catcher 系统将抗体靶向固定在磁珠表面，使抗体具有方向性，大大提高了抗体的灵敏度[20]。因此，通过Spy-Tag/SpyCatcher 系统将酰胺酶细胞结合域（Amidase 3-CBD）靶向固定在Ni 磁珠表面，构建免疫磁珠，以用于快速捕获金黄色葡萄球菌。免疫磁珠示意图如图2所示。
图2 免疫磁珠示意图
Fig.2 Schematic diagram of immune magnetic beads
综合考虑，选择金黄色葡萄球菌特有的nuc 基因作为检测目标，利用重组蛋白构建的免疫磁珠，再结合等温扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）和CRISPR/Cas12a 技术[21-23]创建一种可在2 h 内完成的高灵敏性、高特异性、低成本的检测金黄色葡萄球菌的方法，以期为食品中金黄色葡萄球菌的检测提供新的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HisPur™Ni-NTA 磁珠：美国Thermo Scientific 公司；Bsu 酶（5 000 units/mL）：北京NEB 公司；聚乙烯二醇（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；醋酸钾、醋酸镁、DTT、dNTP、ATP、Transcription buffer（5×）、Ribonuclease inhibitor（40 U/µL）；上海碧云天生物技术有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、RNA 纯化试剂盒：傲锐赛思生物科技（成都）有限公司；牛奶、橙汁、奶茶：市售；大肠杆菌BL21（DE3）、DH5α 感受态细胞：生工生物工程（上海）股份有限公司；金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）：成都大学四川抗菌素工业研究所；Cas12a 蛋白、Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）、LB 液体培养基：成都大学基础医学院分子生物学实验室制备保存；crRNA：北京擎科生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
ZWY-211C 恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-2D 超净工作台：广州瑞智净化设备有限公司；LDZM-80L 立式高温高压蒸汽灭菌器：上海申安有限公司；Step OnePlus 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，real-time qPCR）仪、Pro Flex 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Thermo 公司；H H-4 恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；JYZy5 垂直蛋白电泳槽：北京君意东方电泳设备有限公司；AI 680 化学发光成像系统、AKTE pure 25L1 高效蛋白液相色谱仪：美国通用电气公司；SCIENTZ-ⅡD 细胞破碎机：宁波新芝生物科技有限公司；SYNERGY H1多功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；HC-3018R 高速冷冻离心机：中佳仪器有限公司；PB10 pH 计：德国赛多利斯集团。
1.3 方法
1.3.1 pET28a-SpyTag-Amidase 3-CBD 和pET28a-Spy-Catcher 载体构建及表达
80α endolysin 基因、SpyTag 基因、SpyCatcher 基因由NCBI 获取并送擎科生物公司合成，构建载体pET28a（nohistag）-SpyTag-Amidase 3-CBD 和pET28a-Spy-Catcher，并转入大肠杆菌中表达。
1.3.2 Ni-NTA-SpyCatcher- SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠的制备
取1 mg Ni 磁珠至离心管中，用500µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）洗涤3 次，最后重悬于100µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）中。取100 µL（1 mg/mL）SpyCatcher 蛋白加入磁珠中并旋转孵育20 min，弃上清液，再加入200µL 的SpyTag-Amidase 3-CBD 的表达上清液，混合20 min，去除上清液。后用500 µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）清洗2 次，在100µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）中于4 ℃保存。
1.3.3 细菌培养与计数
将保存的金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）接种于LB 液体培养基中在恒温摇床中37 ℃过夜培养，向无抗生素的LB 液体培养基中按照体积比100∶1 加入过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液，于37 ℃恒温摇床中培养4 h。取5 mL 培养后的菌液于离心管中，10 000 r/min离心1 min。弃去上清液，加入5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4）重悬菌液，10 000 r/min 离心1 min。吸除上清液，加入1.25 mL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）重悬菌液，将菌液全部转移至比色皿中，用50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）将600 nm 波长下测量的吸光度（A600）稀释为0.6，此时金黄色葡萄球菌菌液浓度大概为1.7×107 CFU/mL。取1 mL 浓度为1.7×107 CFU/mL 的菌液加入700 µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4），即得到浓度为1×107 CFU/mL 的菌液。
1.3.4 免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌的检测能力验证
1.3.4.1 PCR 验证免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌
取浓度为1×107 CFU/mL 的新鲜金黄色葡萄球菌菌液100 µL 与磁珠混合孵育1 h，磁吸富集后用50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）清洗3 次，重悬于50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）中。通过PCR 体系（20µL）即5µL 模板、1µL 引物nuc R、1µL 引物nuc F、10 µL 2×PrimeStar Mix、3 µL 无菌重蒸水（double distilled water，ddH2O）来验证捕获结果。
1.3.4.2 免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌灵敏度测定
为探索免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌的灵敏度，将金黄色葡萄球菌培养于无抗生素LB 液体培养基，37 ℃摇床中培养12 h。各取1 mL 1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101 CFU/mL 浓度的金黄色葡萄球菌菌液于离心管中，向各离心管中加入100µL免疫磁珠进行40 min 的孵育。用磁力去除菌液，使用500 µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）清洗3 次，免疫磁珠最终重悬于50 µL ddH2O 中，利用水煮沸10 min 来提取金黄色葡萄球菌基因组DNA。取5µL的上清液作为real-time qPCR 模板进行反应后通过核酸电泳进行验证。
1.3.5 RPA 体系构建
1.3.5.1 RPA 体系的确立
设计RPA 反应使用的引物：RPA-nuc R 为CGTATTGCCCTTTCGAAACATT，RPA-nuc F 为GGCATATGTATGGCAATTGTTTC；其RPA 体系[23]为5% 聚乙二醇、2 mmol/L DTT、200 µmol/L dNTPs、200 mmol/L ATP、0.25µmol/L RPA-nuc R、0.25µmol/L RPA-nuc F、100 mmol/L 乙 酸 钾、14 mmol/L 乙 酸 镁、120 ng/µL Uvsx、30 ng/µL Uvsy、900 ng/µL GP32、3 mmol/L Bsu 酶、5µL 模板。
1.3.5.2 RPA 特异性验证
为验证RPA 反应的特异性，水煮法煮沸10 min提取浓度为1×104 CFU/mL 大肠杆菌BL21（DE3）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）的基因组DNA。利用定制合成好的RPA 引物对这两种细菌的基因组DNA 进行等温扩增。由于引物针对金黄色葡萄球菌一段特有的nuc 基因序列进行设计，而大肠杆菌不含有这段序列，因此在RPA 反应中，只有金黄色葡萄球菌才能被有效识别。
1.3.5.3 RPA 灵敏性测定
以金黄色葡萄球菌基因组DNA 为模板，通过梯度稀释成107、106、105、104、103、102、101、100 amol/L 的浓度加入RPA 反应体系中，将产物进行核酸电泳，以此确定RPA 的灵敏性。
1.3.5.4 免疫磁珠法结合等温扩增（RPA）在食品中的应用
将新鲜的金黄色葡萄球菌菌液稀释成1×104 CFU/mL。分别吸取500µL 加入4.5 mL 牛奶、橙汁、奶茶、ddH2O样本中混合均匀，从而模拟被污染的食品样品。
将污染的食品样品各取1 mL 于离心管中，加入100 µL Ni-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠，室温下反应40 min。使用磁性分离去除剩余菌液，用50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）清洗免疫磁珠3 次，重悬在50µL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.4）中。水煮法煮沸10 min，磁分离后取5 µL 上清液为DNA 模板，加入RPA 反应体系中。
1.3.6 CRISPR/Cas12 检测方法
1.3.6.1 crRNA 制备
在CRISPR/Cas12 切割反应中，crRNA 引导Cas12a蛋白对目标序列进行特异识别，从而激活Cas12a 蛋白进行切割反应，通过SnapGene 与文献[24-27]设计crRNA（5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUUGAAGUUGCACUAUAUAC-3′）。
1.3.6.2 ssDNA 报告系统
设计一段在其5′端修饰FAM 荧光基团和3′端修饰BHQ1 猝灭基团的TTATT 的单链DNA，由北京擎科生物科技股份有限公司定制合成。
1.3.6.3 Cas12a 检测体系
CRISPR 反应体系[28]（20µL）：50 nmol/L Cas12a 蛋白、50 nmol/L crRNA、100 nmol/L ssDNA-FQ reporter 探针、2µL NEB buffer 3.1、2µL RPA 扩增产物，无酶水补充至20µL。在real-time qPCR 仪上37 ℃反应40 min，记录荧光曲线。
1.3.6.4 不同组分的荧光定量测定
将CRISPR/Cas12a 的反应体系（crRNA、Cas12a 蛋白、荧光探针ssDNA、NEB buffer 3.1、RPA 扩增产物）按照单变量的方法，分析体系中不同组分对CRISPR/Cas12a 的反应体系的影响。该反应在real-time qPCR仪上37 ℃反应40 min，并读取荧光曲线。
1.3.7 免疫磁珠+RPA-CRISPR/Cas12a 检测在食品中应用
1.3.7.1 免疫磁珠+RPA-CRISPR/Cas12a 特异性测定
用1×104 CFU/mL 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌污染并经过灭菌处理后的牛奶，使用制备的免疫磁珠与模拟被污染的牛奶样品进行孵育后，水煮沸10 min 提取免疫磁珠上的细菌基因组DNA，在利用其作为模板进行等温扩增（RPA）金黄色葡萄球菌基因组nuc 片段，进行CRISPR/Cas12a 切割检测，验证该检测方法对金黄色葡萄球菌的特异性。
1.3.7.2 免疫磁珠+RPA-CRISPR/Cas12a 灵敏性测定
用新鲜的金黄色葡萄球菌污染牛奶模拟实际的食品样品，分为4 组，其金黄色葡萄球菌浓度分别为1×104、1×103、1×102、1×101 CFU/mL，然后加入100µL Ni-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠进行金黄色葡萄球菌的捕获，水煮沸10 min 提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA，并进行37 ℃、40 min 的RPA 反应扩增nuc 片段，最后利用real-time qPCR 仪于37 ℃下进行CRISPR/Cas12a 切割检测40 min，进行荧光测量，并在紫外照射下用肉眼观察。
1.4 数据分析
使用DNAman、SnapGene 软件进行引物设计、序列比对。数据通过GraphPad Prism 8 软件进行统计分析和绘图。
2 结果与讨论
2.1 pET28a-SpyTag-Amidase 3-CBD 和pET28a-Spy-Catcher 载体构建及表达
将pET28a-SpyCatcher 质粒转化进BL21（DE3）中，用Ni-NTA 进行亲和层析纯化，SpyCatcher 纯化结果如图3 所示。
图3 SpyCatcher 蛋白纯化结果
Fig.3 Purification results of SpyCatcher protein
由图3 可知，洗脱液中出现14.4 kDa 清晰干净的条带，说明纯化效果良好，得到浓度为0.5 mg/mL 后用超滤管进行浓缩，最终浓度达到1 mg/mL。
将pET28a -SpyTag-Amidase 3-CBD 质粒转化进BL21（DE3）中，在16 ℃与37 ℃条件下诱导，结果如图4所示。
图4 SpyTag-Amidase 3-CBD 蛋白表达结果
Fig.4 Expression of SpyTag-Amidase 3-CBD
由图4 可知，16 ℃可诱导表达出可溶的SpyTag-Amidase 3-CBD 蛋白，约为33 kDa。
2.2 Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠的构建
2.2.1 蛋白标记磁珠构建
用SpyCatcher 蛋白结合Ni 磁珠，而后将已结合SpyCatcher 蛋白的磁珠清洗后与表达SpyTag-Amidase 3-CBD 无histag 蛋白的菌液上清液共孵育，使其混合均匀，取磁珠样品进行电泳，结果如图5 所示。
图5 免疫磁珠构建电泳图
Fig.5 Preparation of immunomagnetic beads
由图5 可知，已结合SpyCatcher 蛋白的磁珠与Spy-Tag-Amidase 3-CBD 无histag 蛋白的菌液上清液共孵育后，SpyCatcher 与SpyTag 发生共价反应，生成了Spy-Catcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 融合蛋白，约为47 kDa。
2.2.2 Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌能力验证
用Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌（浓度为107 CFU/mL），并在沸水中煮10 min 得到基因组DNA，作为模板加入PCR 体系进行扩增后，进行核酸电泳验证，结果如图6A 所示。为验证其捕获金黄色葡萄球菌的灵敏度，用Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠分别捕获浓度为101~107 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌，并在沸水中煮10 min 得到基因组DNA，PCR 扩增后进行DNA 琼脂糖凝胶电泳验证，如图6B 所示。
图6 免疫磁珠捕获金黄色葡萄球菌能力验证
Fig.6 Verification of the ability of immunomagnetic beads to capture Staphylococcus aureus
由图6A 可知，在DNA 琼脂糖凝胶上250 bp 上方位置发现条带，为nuc 特异性条带。 Ni-NTA-Spy-Catcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠泳道有明显的条带，而无蛋白的磁珠组有些许非特异结合条带但远不及Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠，说明Ni-NTA-SpyCatcher- SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠能够成功捕获金黄色葡萄球菌。
由图6B 可知，Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠在捕获102 CFU/mL 浓度以下的金黄色葡萄球菌能扩增出nuc 条带。
2.2.3 RPA 性能分析
2.2.3.1 RPA 特异性结果
分别用大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的基因组DNA 作为模板，和基于nuc 基因序列设计的引物加入RPA 等温扩增体系进行反应，来验证RPA 等温扩增的特异性。
RPA 特异性如图7 所示。
图7 RPA 特异性
Fig.7 RPA specificity
由图7 可知，除金黄色葡萄球菌以外的细菌无法激活RPA 反应，证明了RPA 反应的高特异性。
2.2.3.2 RPA 灵敏性结果为更加直观地验证RPA 反应的灵敏度，将所提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA 进行逐步稀释，获得了浓度为100~107 amol/L 的DNA 溶液，并在RPA 反应中进行试验，通过DNA 琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行验证，结果如图8 所示。
图8 RPA 灵敏度
Fig.8 RPA sensitivity
由图8 可知，当金黄色葡萄球菌基因组DNA 浓度低至10 amol/L 时，RPA 反应后的产物在DNA 琼脂糖凝胶电泳后仍然能够产生条带，说明该RPA 反应体系的高灵敏性。
2.2.4 Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠结合RPA 检测食品中的金黄色葡萄球菌
制备模拟被污染的食品样品牛奶、奶茶、橙汁，被污染样品中含有浓度为1×103 CFU/mL 金黄色葡萄球菌，Ni-NTA-SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠结合并捕获金黄色葡萄球菌，使用水煮沸10 min 提取基因组DNA，作为模板进行RPA 等温扩增，将产物进行核酸电泳，结果如图9 所示。
图9 免疫磁珠结合RPA 捕获不同食品中的金黄色葡萄球菌
Fig.9 Immunomagnetic beads combined with RPA for capturing Staphylococcus aureus in different food products
由图9 所示，在被污染的食品样品中都能扩增出条带亮度均匀的nuc 片段。结果表明，Ni-NTA-Spy-Catcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠结合捕获金黄色葡萄球菌并不受食品类型的影响。
2.2.5 CRISPR/Cas12a 不同组分的分析
将Cas12 反应体系中，按照单一变量的原则，分析不同组分对Cas12 切割体系的影响，结果如图10所示。
图10 CRISPR/Cas12a 不同组分的单一变量检测结果
Fig.10 Single variable detection of different components of CRISPR/Cas12a
由图10 可知，反应体系中的组分crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针ssDNA、NEB buffer 3.1、RPA 扩增产物都有其绝对作用，缺少其中任何一个都无法发出荧光。
2.2.6 免疫磁珠-RPA-CRISPR/Cas12a 检测在食品中的应用
2.2.6.1 特异性分析
CRISPR/Cas12a 特异性检测结果如图11 所示。
图11 CRISPR/Cas12a 特异性检测
Fig.11 Specific detection of Staphylococcus aureus by CRISPR/Cas12a
由图11 可知，只有金黄色葡萄球菌能够激活Cas12a 蛋白切割荧光探针发出荧光，说明其免疫磁珠-RPA-CRISPR/Cas12a 检测对金黄色葡萄球菌具有高特异性。
2.2.6.2 灵敏度分析
利用磁珠捕获结合RPA-CRISPR/Cas12a 切割的方法于37 ℃条件下检测被污染不同浓度金黄色葡萄球菌污染的牛奶，结果如图12 所示。
图12 免疫磁珠+RPA-CRISPR/Cas12a 灵敏性分析
Fig.12 Sensitivity of immunomagnetic beads+RPA-CRISPR/Cas12a
图12A 中曲线为real-time qPCR 仪显示37 ℃下CRISPR/Cas12a 的切割反应的荧光曲线，EP 管为对应的样品在37 ℃条件下切割40 min 后在紫外辐照下由相机所拍摄。由图12B 可知，Ni-NTA-SpyCatcher-Spy-Tag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠捕获结合PRA-CRISPR/Cas12a 针对金黄色葡萄球菌的最低检测限为1×102 CFU/mL。
3 结论
本研究将80α 噬菌体的细胞结合域和SpyCatcher-SpyTag 系统结合构建重组蛋白SpyCatcher- SpyTag-Amidase 3-CBD。重组蛋白与Ni 磁珠构建免疫磁珠用于特异性结合捕获金黄色葡萄球菌。免疫磁珠制备成功后，SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠能够捕获低至1×102 CFU/mL 浓度下的金黄色葡萄球菌。以金黄色葡萄球菌特有的nuc 基因片段为检测靶标，结合RPA-Cas12a/crRNA 切割显色可在2 h 内完成检测，其检测的最低限度为1×102 CFU/mL。表明本研究所构建制备的SpyCatcher-SpyTag-Amidase 3-CBD 免疫磁珠拥有良好的捕获金黄色葡萄球菌能力，结合RPACRISPR/Cas12a 构成了针对金黄色葡萄球菌的高效检测方法，其具有很高的发展潜力，对食品安全检测和食源性疾病的预防具有重要意义。
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