新疆维吾尔自治区深居亚欧大陆腹地，常年干旱少雨，沙漠地域辽阔，存在一些独特的地理生态环境。在新疆不同地区，分布着许多野生食药用菌资源。然而，大多数野生食药用资源未被深入研究和开发利用。
前期已有学者开展对新疆野生食药用菌资源的调查研究。卯晓岚[1]对新疆野生食用菌的种类组成、生态特点和分布规律进行了初步分析，将全区食用菌的分布大致划分为天山及阿尔泰林区、山地草原区、荒漠及半荒漠区3 个生态环境迥然不同的区。王俊燕[2]对新疆食药用菌资源进行调查，发现新疆境内的大型真菌有568 种，其中食用菌238 种，药用菌94 种。张小青[3]随真菌地衣科考队到新疆的北疆考察并采集标本，采集木材腐朽菌标本65 种。古丽·艾合买提等[4]对新疆阿勒泰地区喀纳斯山区大型真菌展开了系统、全面的调查研究，并进行分类鉴定，发现了一些食药用菌菌种。夏尤普·玉苏甫等[5]对新疆天山林区进行菌物资源调查中发现了一些新种。大部分研究是对真菌资源进行调查、分类、鉴定，而对一些具体食药用菌的生物学特性、生理特性、营养药用成分分析较少，研究还不够深入。
钉灰包属（Battarrea sp）微生物最早发现于1801 年，广泛分布于全世界64 个国家，其孢子体内包被在与菌柄的连接处，具有独特的弹丝，区别于其它真菌[6]。刘虹等[7]和范黎[8]分别进行钉灰包属菌株的分类学研究，描述了该菌株的分类学特征，但未对其营养和药用价值进行分析。Golubkina 等[9]发现鬼笔状钉灰包含有一些抗氧化药用成分，富含Cu、Fe、Mn 等元素。
新疆克拉玛依荒漠土壤中一种野生食用菌标本，每年6~8 月出现，被当地人挖掘食用，但对该菌株的分类学地位尚不明确，食药用价值也需进一步研究。因此，本研究采集新疆克拉玛依荒漠土壤中一种野生食用菌标本，对菌种进行鉴定，并对其子实体营养成分进行分析，以期为该菌的人工栽培驯化和进一步开发与利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生食药用菌：采集于新疆克拉玛依大农业开发区荒漠土，采集时间2022 年6~8 月份。
D-（+）-葡萄糖、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂：生工生物工程（上海）股份有限公司；KH2PO4、NaCl（均为分析纯）：天津晟永精细化工有限公司；MgSO4·7H2O（分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市北联精细化学品开发有限公司；维生素B 片：天津力生制药股份有限公司；Tween 20：上海源叶生物科技有限公司；Tris-HCl（纯度≥99.0%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（纯度≥99.5%）：天津市鑫铂特化工有限公司。
1.2 仪器与设备
K1100F 全自动凯式定氮仪：上海脉实科技有限公司；赛里安Artemis 6000 全自动氨基酸分析仪：天美仪拓实验室设备（上海）有限公司；20PR-520 型日立高速冷冻离心机：上海木森生物科技有限公司；ICPMS6880 电感耦合等离子体质谱仪：上海美析仪器有限公司；LB-ST-06 全自动六联索氏提取仪：青岛路博建业环保科技有限公司；S1000 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；DYY-2C 电泳仪：北京市六一仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种鉴定
1.3.1.1 基因组DNA 提取
Buffer A（0.1 mol/L NaOH，2% Tween 20）：称取0.4 g NaOH，2 mL Tween 20，用无菌水定容至100 mL，现用现配。
Buffer B（0.1 mol/L Tris-HCl，0.002 mol/L EDTA，pH2.0）：精密称取1.576 g Tris-HCl，0.0744 g EDTA，加入100 mL 容量瓶中，用无菌水定容至100 mL，后用浓盐酸调pH 值至2.0。
将食用菌置于自然光照下进行干燥后，粉碎，在1.5 mL EP 管中加入50µL 提取液，以8 000 r/min 离心10 min，取出上清液。加入50µL Buffer A，用封口膜封口95 ℃水浴10 min，每隔2 min 取出摇一摇。10 min后加50µL Buffer B，混匀，-20 ℃保存待用[10]。
1.3.1.2 内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列扩增
按扩增体系加完样品，再按照扩增程序，将样品放到PCR 扩增仪里面进行扩增，扩增结束后进行电泳检测。
ITS 序列扩增采用50 µL 体系，即5 µL 10×EXtag PCR Buffer（Mg2＋Plus）、4 µL dNTP Mixture（各0.000 25 mol/L）、ITS-1 和ITS-2（0.01 mol/L）引物各1µL、基因组DNA 0.5µL、TaKaRa EX-Taq（5 U/µL）。扩增引物：上游引物ITS-1 为AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA，下游引物ITS-2 为GAGCTGCATTCCCAAACAACTC。
扩增条件：94 ℃、5 min，1 个循环；94 ℃、30 s，52 ℃、45 s，72 ℃、1 min，30 个循环；72 ℃、10 min，4 ℃保存30 min。扩增产物在1.0% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR 产物用试剂盒纯化后，进行测序分析。
1.3.1.3 系统进化树
ITS 序列提交GenBank 数据库，获得序列号Accession numbmer：OR563649。将ITS 序列与国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank数据库进行Blast 序列比对分析，下载与目标菌种同源性较高的菌种的ITS 序列，利用Clustal X 1.81 和MEAG 7.01 软件，采用邻近相接（neighbor-joining，N-J）法构建进化树，分析其亲缘关系。
1.3.2 子实体营养成分测定
将食用菌在自然光下烘干后，粉碎，备用，分析子实体蛋白质、粗脂肪、灰分、氨基酸、粗纤维、微量元素含量。蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定；粗脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的酸水解法进行测定；灰分含量参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中的第一法进行测定；氨基酸含量采用离子交换色谱法，参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》用氨基酸自动分析仪测定17 种氨基酸；粗纤维含量采用称量法，参照GB 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》进行测定；微量元素含量参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》中的电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法进行测定。
1.4 数据分析
将测定的序列提交至NCBI 数据库进行比对，查找同源相似性高的序列，利用Clustal X 1.81 和MEAG 7.01 软件构建系统发育树，比较菌种亲缘性[11]。
2 结果与分析
2.1 野生菌标本采集
采集到的克拉玛依市野生菌的子实体标本如图1所示。
图1 子实体野生形态
Fig.1 Wild form of fruiting body
由图1 可知，野生菌的子实体呈球形，埋于沙性土壤中，呈土灰色。子实体切开后可见红棕色孢子体包裹于半球形菌柄顶端，菌柄呈半球形，白色，包被于子实体内部。
2.2 野生菌菌种分离鉴定
提取野生菌菌株子实体基因组DNA，扩增得到1 400 bp 左右的ITS 序列，送至上海生物工程有限公司进行测序分析，将序列提交GenBank，获得序列号为OR563649。将子实体基因组扩增ITS 序列与Gen-Bank 进行序列比对，下载与子实体ITS 序列同源性较高的菌株序列，利用N-J 法构建进化树，分析其亲缘关系。野生菌菌株的系统进化树如图2 所示。
图2 野生菌菌株的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of wild strain
Fry 等[12]和Saini 等[13]研究表明序列相似性≥99%可鉴定为同种，相似性在90%~99%的鉴定为同属，相似性≤90% 的鉴定为同科。由图2 可知，菌株与Battarrea phalloides voucher 菌种的亲缘关系最近，相似度最高为92.98%，结合菌种形态特征，将该菌种鉴定为钉灰包属（Battarrea sp）微生物。
2.3 子实体营养成分分析
2.3.1 基本营养成分
鬼笔状钉灰包子实体基本营养成分含量见表1。
表1 野生菌基本营养成分含量
Table 1 Basic nutrient component contents of wild fungus%
名称野生菌巴楚蘑菇[14]香菇[15]蛋白质含量18.80 22.25 17.53粗脂肪含量2.68 3.17 1.81粗纤维含量9.40 37.80 6.01灰分含量5.07 7.81 4.47
由表1 可知，野生菌蛋白质含量为18.80%，粗脂肪含量为2.68%，粗纤维含量为9.40%，灰分含量为5.07%。其蛋白质含量处于常见的8 种食用菌（香菇、平菇、金针菇、双孢菇、阿魏菇、杏鲍菇、茶树菇、黑木耳）蛋白质含量范围8%~24% 内，略高于香菇[15-16]。其粗脂肪含量在一般的食用菌脂肪含量范围之间（2%~4%）[17]，高于香菇，低于另外一种新疆野生食用菌巴楚蘑菇。野生食用菌中的粗灰分由无机盐和重金属等构成，其含量高低可以反映出野生食用菌生长地土壤重金属含量情况[18]。测得野生菌灰分含量介于平菇、香菇、金针菇、茶树菇间（4.47%~7.28%），高于香菇，低于巴楚蘑菇。巴楚蘑菇是一种土生野生食用菌，有泥土、砂粒、灰等成分，测定结果可能存在一定误差[14，16]。鬼笔状钉灰包粗纤维含量高于香菇，低于巴楚蘑菇，不同食用菌间的粗纤维含量存在较大差异[16]。
2.3.2 氨基酸成分分析
菌株氨基酸组成分析见表2。
表2 野生菌子实体的氨基酸组成分析
Table 2 Amino acid composition analysis of fruiting body of wild fungus g/100 g
注：*表示必需氨基酸；-表示未检出或微量（低于目前应用的检测方法的检出限）。
氨基酸天门冬氨酸（Asp）谷氨酸（Glu）丝氨酸（Ser）组氨酸（His）*甘氨酸（Giy）苏氨酸（Thr）*精氨酸（Arg）丙氨酸（Ala）酪氨酸（Tyr）半胱氨酸（Cys）缬氨酸（Val）*甲硫氨酸（Met）*苯丙氨酸（Phe）*异亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）赖氨酸（Lys）*脯氨酸（Pro）总氨基酸（total amino acids，TAA）必需氨基酸总含量（total essential amino acids，EAA）非必需氨基酸总含量（total non-essential amino acids，NEAA）（EAA/TAA）/%（EAA/NEAA）/%野生菌1.99 5.07 0.66 0.27 0.70 0.69 1.35 1.64 0.28 0.03 0.97 0.26 0.50 0.59 0.84 0.74 3.81 20.39 4.59 15.80 22.50 29.10巴楚蘑菇[14]1.48-0.79 0.33 0.68 0.38 0.70 0.81 0.87-0.89 0.91 0.56 0.59 0.93 0.71 0.68 11.31 4.06 7.25 35.90 56.00香菇[15]2.43 5.42 1.26 0.52 1.19 1.28 1.24 1.42 0.04 0.23 1.39 0.32 1.07 1.01 1.65 1.39 0.99 22.85 7.24 13.70 35.60 55.40
由表2 可知，野生菌子实体含有17 种氨基酸，该菌种的非必需氨基酸和必需氨基酸种类齐全。必需氨基酸与总氨基酸比值为22.50%，必需氨基酸与非必需氨基酸比值为29.10%，明显低于香菇和巴楚蘑菇。氨基酸尤其是必需氨基酸的组成与比例是评价蛋白质营养价值的重要指标，理想蛋白质模式必需氨基酸与总氨基酸比值为0.40，必需氨基酸与非必需氨基酸比值为0.60[19]。
子实体氨基酸成分分析发现，子实体中的谷氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、精氨酸含量较高，半胱氨酸含量较低。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸与寿命延长相关[20]。谷氨酸可解除阻止代谢过程中产生的氨毒害作用，并参与脑组织代谢，促使脑机能活跃，也可以用来防治肝性昏迷以及辅助治疗脑震荡等功效[20]。脯氨酸含量高于香菇和巴楚蘑菇。脯氨酸是一种人体非必需氨基酸，对于健康具有重要的作用，可以促进肌肉生长、改善免疫功能、促进能量代谢等[21]。丙氨酸、精氨酸含量高于香菇和巴楚蘑菇，天门冬氨酸含量明显高于巴楚蘑菇，低于香菇，这3 种氨基酸是蘑菇鲜味的关键[22-23]，具有良好的风味和口感。半胱氨酸含量较低，半胱氨酸是一种含硫氨基酸，有很好的抗氧化作用，参与肝脏的磷脂代谢以及细胞的还原，具有保护肝细胞的作用[22]。表明该野生菌具有一定的药用价值。
2.3.3 微量元素分析
矿物质元素对人体的生命活动、代谢及生理功能有着十分重要的作用。体内除了需要大量C、K、P、Na等元素维持正常生理功能之外，还需要Se、Cu、Mn 等微量元素。微量元素是各种激素、维生素、酶及核酸的重要组成部分，是许多酶系统的活化剂或辅助因子，参与生命物质的代谢[14，19，24-27]。
菌株矿物质元素含量见表3。
表3 野生菌子实体矿物质元素含量
Table 3 Mineral element contents of fruiting body of wild fungus mg/kg
注：-表示未检出或微量（低于目前应用的检测方法的检出限）。
金属离子锌（Zn）铁（Fe）磷（P）钾（K）铜（Cu）锰（Mn）钠（Na）镁（Mg）硒（Se）钙（Ca）铅（Pb）镉（Cd）野生菌31.20 98.70 6.29×103 1.54×104 47.10 9.93 2.65×103 7.14×102 3.68 1.34×103 0.56 0.26巴楚蘑菇（菌盖）[14]7.16×102 3.92×102 3.57×103 4.74×103 23.20 8.90 1.24×103 1.41×103-4.17×103 8.00 0.5香菇[15]50.27 27.42-1.99×104 4.75-55.68 1.17×103 0.10 1.13×102- -
由表3 可知，野生菌子实体中Na、K、Ca、P、Fe、Cu、Mg 和Se 的含量相对比较丰富。其中P 含量是巴楚蘑菇的1.76 倍。P 是细胞膜的主要成分，与Ca 协同作用于骨骼，对骨骼发育非常重要。Fe 是血液中血红蛋白的构成要素，缺Fe 会导致贫血。Cu 元素在红细胞的生长过程中起到重要作用，甚至微量元素不足将会影响免疫功能[24-28]。Cu 和Fe 含量分别是香菇的9.92 倍和3.60 倍，非常适合贫血人群食用。野生菌子实体中Se含量较为丰富，是香菇的36.8 倍。Se 是谷胱甘肽过氧化酶的组成成分，对于清除自由基、保护细胞膜、抗衰老、修复DNA 等分子损伤、提高机体免疫力、抗癌，维持正常血压、拮抗重金属对机体毒害具有十分重要的生理功能[26-29]，并且Alehagen 等[30]指出Se 水平与肾功能息息相关。该菌株具有富硒功能，对于开发富Se 相关功能性产品具有十分重要意义。
野生菌子实体重金属分析表明，子实体Pb 含量为0.56 mg/kg，略高于GB 2762—2022《食品安全国家标准食品中污染物限量》的限量标准0.5 mg/kg；重金属Cd 的含量为0.26 mg/kg，略高于限量标准0.2 mg/kg。部分野生食药用菌对重金属有一定的富集作用，可能与其生长的土壤环境有关[19]。
3 讨论与结论
对采集的野生菌子实体基因组ITS 序列分析研究表明，该菌株鉴定为钉灰包属（Battarrea sp）微生物。钉灰包广泛分布于64 个国家，生长于排水良好的沙性土壤，在新西兰和印度等国家均有被发现[6，29，31]。本研究采集菌种的生长环境与报道的基本一致。刘虹等[7]和范黎[8]研究了我国钉灰包属菌种发现和分类依据。对于该菌株的生理特性、食药用价值研究较少。
本研究对野生菌子实体基本营养成分进行分析，其蛋白质含量为18.80%，粗脂肪含量为2.68%，粗纤维含量为9.40%，灰分含量为5.07%，与常见8 种食用菌差异不大，粗纤维含量高于香菇[15-16，19]。矿质元素分析发现，野生菌子实体中P、Fe、Cu、Mg 和Se 的含量相对比较丰富，特别是P、Fe、Cu、Se 的含量明显高于其他食用菌，与Golubkina 等[9]和Ručová 等[32]的研究结果一致。该菌生长于克拉玛依的沙漠地区，土壤偏碱性，对土壤中的P、Fe、Cu、Se 元素吸收转化富集较高，特别是硒含量较高。因此，该菌有望被开发成为新型功能性食品。
本研究对新疆克拉玛依地区的这一野生菌菌种进行了分离鉴定，对其营养成分进行分析研究。该研究对于人工栽培驯化以及进一步开发研制功能性食品和医药用品、资源的深度发掘利用具有重要意义。
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