小球藻是一种细胞内富含多种活性物质的微藻，2012 年被联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）列为21 世纪人类的绿色营养源健康食品。小球藻生长因子（chlorella growth factor，CGF）又名小球藻热水提取物或小球藻精，是由新鲜优质的小球藻细胞经过多次离析浓缩和萃取得到的产品。小球藻生长因子溶液含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、多糖、维生素、微量元素和一些生物活性物质等，其中的活性物质具有抗肿瘤、降血压、抑制癌细胞等活性[1-4]。但由于小球藻生长因子具有特殊的藻腥味，大众接受度不高，所以将小球藻生长因子应用于食品开发时去除或遮蔽藻腥味是关键步骤，因此，分析小球藻生长因子的挥发性风味物质并确定其关键风味物质已成为研究热点。
目前，气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析方法已广泛应用于风味物质的检测，食品中风味物质的提取方法需要根据食品本身的性质选择。本研究根据小球藻生长因子的产品特性，采用顶空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和溶剂辅助风味蒸发（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）两种提取方法对小球藻生长因子的风味物质进行提取，比较提取结果后，选择更合适的方法进行挥发性风味物质的提取，结合嗅闻检测技术对小球藻生长因子中挥发性风味物质进行鉴定[5-8]，并通过相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）[7]和气味阈值[9]确定影响样品整体风味的关键性挥发成分。以期为小球藻生长因子风味形成机理及小球藻食品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小球藻生长因子（液体产品）：广西生巴达生物科技有限公司；二氯甲烷（分析纯）：上海沃化化工有限公司；C6~C33 烷烃标准品：美国Sigma-Aldrich 公司。
1.2 仪器与设备
7890B 型GC 仪、5977A 型MS 仪：美国安捷伦公司；65µm57310-U 型DVB 萃取头：美国Supelco 公司；ODP3 嗅闻检测器：德国Gerstel 公司；溶剂辅助风味蒸发萃取装置：广西大学轻工与食品过程学院水产品加工实验室自制设备；R205B 型旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 HS-SPME 法萃取小球藻生长因子挥发性风味物质
参照文献[5，8，10-13]方法并略作修改，将样品装入10 mL SPME 专用瓶中，旋紧瓶盖密封，在40 ℃下磁力搅拌30 min，然后将57310-U 型65µm DVB 萃取头在260 ℃老化20 min，迅速插入到顶空瓶中，距离液面1 cm 处，萃取20 min，结束后立即将萃取头插入230 ℃进样口解吸5 min。
1.3.2 SAFE 法萃取小球藻生长因子挥发性风味物质
参考文献[13-14]方法并稍作修改，取200 mL 样品，加入200 mL 二氯甲烷，在具有磁力搅拌的恒温水浴锅（40 ℃）中冷凝回流萃取60 min。然后在4 ℃下离心（8 000 r/min、5 min），并收集有机相。重复萃取3 次，合并有机相（约600 mL），使用溶剂辅助风味蒸发（SAFE）设备在高真空（10-5~10-4 MPa），40 ℃下分离提取液中的挥发物。加入无水硫酸钠干燥馏出物，使用旋转蒸发仪将馏出物浓缩至5 mL，最后氮吹浓缩到1 mL。将SAFE 馏出物储存在-80 ℃环境中，待测。
1.3.3 GC-MS 分析方法
1.3.3.1 GC-MS 条件
GC-MS 的仪器参数见表1。
表1 仪器参数
Table 1 Instrument parameters
条件色谱柱进样口温度载气电喷雾电离电子能量离子阱温度传输线温度溶剂延迟质量扫描范围升温程序HS-SPME 法的型号或参数HP-Innowax 柱（型号60 m×0.25 mm，0.25µm）230 ℃高纯度氦气（99.999%），不分流70 eV 150 ℃250 ℃无45~550 U开始柱温40 ℃，保持3 min；再以4 ℃/min 升至150 ℃后，保持1 min；最后以8 ℃/min 升至250 ℃后，保持6 min SAFE 法的型号或参数HP-Innowax 柱（型号60 m×0.25 mm，0.25µm）230 ℃高纯度氦气（99.999%），1.0 mL/min 70 eV 150 ℃250 ℃3 min 45~550 U
1.3.3.2 小球藻生长因子挥发性风味物质定性与定量分析
综合质谱结果、保留指数（retention index，RI）值和嗅闻检测器得到的气味描述，对挥发性风味物质进行定性。质谱结果通过查找NIST14.0 谱库，选择匹配度>80 的化合物（其中最大值为100），保留指数值是依据C6~C33 的正构烷烃标准品来计算各个化合物的RI值，并与NIST Chemistry Web Book 上统计的风味化合物RI 值进行比对定性[15-16]。风味化合物的气味描述由评价员通过嗅闻并与已有文献报道的描述对比得到。通过峰面积归一化法计算每种成分的相对百分含量。
1.3.4 气味贡献程度评价方法
1.3.4.1 ROAV 计算
采用ROAV 能够得出不同风味物质成分对整体风味的贡献程度的差异[7，17]。其中对样品贡献程度最大的挥发性风味物质其ROAV 为100，按照下列公式计算其他挥发性物质成分的ROAV。
式中：Ri 为待测成分的相对气味活度值；100 代表换算系数；Crstan 为对整体风味贡献水平最大成分的相对百分含量；Tstan 为对整体风味贡献水平最大成分的感觉阈值；Cri 为待测成分相对百分含量；Ti 为待测成分感觉阈值。
1.3.4.2 气味强度
评价员经过食品感官评价专业学习和培训，在嗅觉检测器出口端进行嗅闻，描述和记录气味强度、特征及保留时间，将气味强度分为4 个等级，等级3 表示很强，等级2 表示较强，等级1 表示较弱，等级0 表示无。进行7 次重复性试验，以保证准确性。
1.4 数据处理
所有数据采用SPSS 26、Origin 9.0 软件对数据进行统计和绘图。挥发性风味物质通过GC-MS 自带的软件分析。
2 结果与分析
2.1 挥发性风味物质的两种提取方法的比较
不同提取方法小球藻生长因子挥发性风味物质韦恩图见图1，小球藻生长因子挥发性风味物质种类与相对含量见图2。
图1 不同提取方法小球藻生长因子挥发性风味物质韦恩图
Fig.1 Wayne diagram of volatile flavor substances in chlorella growth factor extracted by different methods
图2 两种提取方法小球藻生长因子挥发性风味物质种类与相对含量
Fig.2 Types and relative contents of volatile flavor substances in chlorella growth factor extracted by two different extraction methods
由图1 可知，两种提取方法中HS-SPME 法鉴定出50 种挥发性风味物质，SAFE 法鉴定出40 种挥发性风味物质，共同鉴定出的挥发性风味物质有11 种。
由图2 可知，HS-SPME 法鉴定出的挥发性风味物质有6 种醛类、8 种酮类、20 种杂环类、4 种醇类、3 种酚类、3 种含硫化合物及6 种其他类化合物。SAFE 法鉴定出的挥发性风味物质有4 种醛类、11 种酮类、9 种杂环类、7 种醇类、5 种酚类及4 种其他类化合物。
小球藻生长因子挥发性风味物质见表2。
表2 小球藻生长因子挥发性风味物质
Table 2 Volatile flavor substances in chlorella growth factor
编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10化合物名称醛类异戊醛三聚甲醛新戊醛肟4-乙基苯甲醛2-吡咯甲醛正己醛壬醛糠醛苯甲醛2，5-二甲基苯甲醛小计气味描述有苹果香味有轻微的甲醛气味#苦杏仁气味#有刺激性气味存在于香料烟烟叶中、有强烈的油脂气息，稀释时则呈现出玫瑰和柑橘样的香气有杏仁样的气味有苦杏仁气味存在于主流烟气中HS-SPME 法RI 值914- - - -1 080 1 396 1 469 1 532 1 752相对含量/%0.18- - - -0.25 0.23 4.42 1.13 0.61 6.82 SAFE 法RI 值-1 138 1 182 1 501 1 583- - - - -相对含量/%-3.12 0.06 0.20 0.42- - - - -3.80
续表2 小球藻生长因子液挥发性风味物质
Continue table 2 Volatile flavor substances in chlorella growth factor liquid
编号11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52化合物名称酮类2-戊酮1-羟基-2-丁酮4-甲基-2-戊酮丙酮醇2-庚酮3-羟基-2-丁酮N-甲基吡咯烷酮2-哌啶酮甲基庚烯酮呋喃酮2-壬酮2，2，6-三甲基-1，4-环己二酮异佛尔酮甲基环戊烯醇酮间甲基苯乙酮2-乙酰基环戊酮α-紫罗兰酮2-吡咯烷酮小计杂环类2，4，5-三甲基恶唑2-甲基噻唑噻唑4-甲基噻唑5-甲基噻唑4，5-二甲基噻唑4-甲基-5-羟乙基噻唑4，5-二甲基-1，2-噻唑4，5-二甲基-2-异丙基噻唑2-乙基吡嗪2-甲基吡嗪2，5-二甲基吡嗪2，6-二甲基吡嗪2，3-二甲基吡嗪2-乙基-5-甲基吡嗪2-乙基-6-甲基吡嗪2，3，5-三甲基吡嗪2，3-二甲基-5-乙基吡嗪川芎嗪2-乙基-3，5，6-三甲基吡嗪2，5-二甲基呋喃5-甲基-2-乙酰基呋喃嘧啶3-甲基吡啶小计气味描述带有指甲油的气味、有丙酮气味存在于烟气中有令人愉快的酮样香味存在于烤烟烟叶、白肋烟烟叶、香料烟烟叶、主流烟气中有类似梨的水果香味有令人愉快的奶油香味带有一种胺的气味#具有柠檬草和乙酸异丁酯般的香气有草莓、菠萝香气，以及果糖焦糖香味呈水果、花、油脂和药草似香气#有类似樟脑的气味具有坚果样甜香味存在于烟气中#紫罗兰花香#水煮牛肉的芳香有恶臭气味##有坚果样香味和青香具有坚果香气、木香、甜果香、烘烤香和牛肉样香气###具有似牛肉加热时发生的香味和果仁及可可似香味#具有咖啡和炒花生的气味霉香、坚果皮、可可粉、烤土豆、咖啡和焙烤、奶油、肉类香气，有烤焦的蛋白质气味和可可果气味#带有一种烤马铃薯气味具有烤土豆、炒花生、核桃、坚果、壤香、发酵霉香的香气###存在于烤烟烟叶、烟气中存在于烤烟烟叶、白肋烟烟叶、香料烟烟叶、主流烟气中#有甜味，有不愉快的气味HS-SPME 法RI 值973-1 078-1 182- - -1 339-1 391-1 408-1 783-1 861-1 190 1 238 1 250 1 281 1 297 1 375-1 438 1 451-1 265-1 328 1 346-1 386 1 403 1 462 1 474 1 514 949 1 620 1 211 1 291相对含量/%0.69-0.31-2.35- - -1.09-0.48-21.83-0.05-0.64-27.44 0.44 0.55 4.55 0.21 1.30 0.46-0.55 0.69-3.08-2.13 0.58-4.51 1.66 0.77 0.48 0.65 0.27 0.48 1.06 0.15 24.57 SAFE 法RI 值-1 285-1 240-1 229 1 432 1 623-1 581-1 482 1 303 1 499-1 504-1 587-1 214 1 203- - -1 685- -1 260-1 252 1 256-1 293 1 290 1 300- - - - -1 173-相对含量/%-0.33-1.84-2.48 0.60 2.27-1.18-0.58 0.17 0.54-0.52-1.04 11.55-0.87 0.45- - -1.86- -0.15-1.23 0.62-0.05 0.42 0.29- - - - -0.31-6.25
续表2 小球藻生长因子液挥发性风味物质
Continue table 2 Volatile flavor substances in chlorella growth factor liquid
注：-表示未检测到此挥发性风味物质；#表示未找到气味描述。
编号53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79化合物名称3-戊醇6-甲基-5-庚烯-2-醇2-噻吩甲醇2-乙基己醇1，3-二氯丙醇丙酮醇2，3-丁二醇2-（甲硫基）乙醇芳樟醇糠醇小计酚类香芹酚2，5-二甲基间苯二酚邻甲酚甲基麦芽酚苯酚小计含硫化合物烯丙基甲基硫醚二甲基二硫醚糠基甲基二硫醚小计其他类化合物1，3，5-三甲苯对二甲苯2，5-二甲氧基甲苯二氢猕猴桃内酯乙酸异丁酸丁酸4-甲氧基邻苯二胺2-噻吩甲胺小计气味描述#存在于主流烟气中#有甜味和淡淡的花香#存在于烤烟烟叶、白肋烟烟叶、香料烟烟叶、主流烟气中##存在于烤烟烟叶、白肋烟烟叶中有特殊的苦辣气味具有类似苯酚的刺激性气味#有芳香气味#有特殊气味。恶臭，存在于大蒜中有恶臭，强烈的洋葱、甘蓝、蔬菜香气土腥味带有一种特有的气味有类似甲苯的气味##有刺激性酸臭有刺激性气味有腐臭的酸味##HS-SPME 法RI 值-1 459-1 486- - - -1 545 1 660-1 640 2 008-2 012 952 1 074 1 820 1 342- - -1 471 1 584 1 644 1 357 1 737相对含量/%-0.19-37.95- - - -0.09 17.88 56.11-1.47 2.71-1.16 5.34 0.42 1.40 0.42 2.24 0.94- - -1.72 1.10 1.97 1.60 0.44 7.77 SAFE 法RI 值1 267-1 549-1 145 1 240 1 363 1 365-1 418 1 646-1 570 1 560 1 572- - - -1 110 1 359 1 726- - -1 357-相对含量/%0.40-0.85-0.81 1.84 0.43 1.22-57.76 63.31 1.08-1.29 2.04 1.61 6.02- - - 0 -1.31 1.35 6.69- - -0.68-10.03
结合图2 和表2 可知，两种提取方法中小球藻生长因子中醇类物质相对含量最高，HS-SPME 法鉴定出的2-乙基己醇相对含量最高，为37.95%；两种方法均鉴定出糠醇，其中SAFE 法鉴定出的糠醇相对含量较高，为57.76%，可能是赖氨酸与葡萄糖美拉德反应产生的产物[18]。有研究发现，在小球藻不同生长阶段中，醇类物质含量在不断增加[19]。醇类物质的风味包含令人愉快和不愉快，感觉阈值相对较大，所以对样品风味的贡献程度相对较低，但当其浓度较高或者以不饱和形式存在时，其影响不容忽视[7，9，20]。
酮类物质的气味阈值较低，因此对样品风味的贡献程度较高，其中2-庚酮、甲基庚烯酮、2-壬酮均对小球藻生长因子的风味有益。目前研究表明，部分酮类物质可能会使样品整体风味更容易令人接受，但也有一些酮类物质呈现不良风味[19]。
杂环类化合物主要为噻唑类、吡嗪类以及呋喃类化合物，呈现恶臭气味、坚果香、土豆香、霉味等。杂环类化合物相对含量虽不是很高，但阈值也较低[9]，因此对样品风味的不良影响不容忽视。其中吡嗪类化合物是食品中的游离氨基酸和多肽等和羰基化合物（尤其是还原糖）作为前体物质所产生的[21]，即美拉德反应过程中的斯特雷克反应生成的α-氨基酮，经过缩合，生成了不同种类的吡嗪类化合物。
含硫化合物只在HS-SPME 法中被鉴定出来，含硫化合物是一些海产品中的重要风味物质，由浮游植物转移到食物链中的其他生物体上，也可能来自蛋氨酸和半胱氨酸分解代谢[22]。有研究发现海藻中重要的挥发性成分是有机卤素、醛类物质和二甲基硫醚[23-24]。
由表2 可知，HS-SPME 法提取的风味物质种类更多，相对含量更高，能够比较完整地呈现小球藻生长因子的挥发性风味物质。有研究报道二甲基二硫醚是小球藻的主要风味物质[25]，但本研究使用SAFE 法并未鉴定出，故最终采用顶空固相微萃取气质联用（headspace-solid phase microextraction-chromatography-olfactory-mass spectrometry，HS-SPME-GC-O-MS），并结合ROAV 对小球藻生长因子中挥发性风味成分及关键风味物质进行研究。
2.2 小球藻生长因子挥发性风味物质ROAV 分析
根据文献[7，17，26-27]表明，所有风味物质的ROAV 均在0~100 之间，当ROAV 在0.1~1.0 时，说明该化合物对样品整体风味有一定的影响；ROAV 大于1 时，说明该化合物对样品整体风味有较大影响，对整体风味贡献程度大；ROAV 越高，化合物对样品的整体风味影响越大，贡献程度越大。根据阈值、ROAV 及气味强度从HS-SPME 法中鉴定的50 种化合物中鉴定出14 种小球藻的主要挥发性化合物，具体见表3。
表3 小球藻生长因子液挥发性风味物质ROVA 值分析结果
Table 3 ROVA value analysis results of volatile flavor substances in chlorella growth factor liquid
注：MS 表示经质谱而确定的组分；RI 表示经比对保留值而确定的组分；O 表示在ODP3 鉴定下的气味描述；相对含量由3 次平行试验计算得出。
编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14化合物名称异戊醛2-庚酮异佛尔酮α-紫罗兰酮2，4，5-三甲基恶唑噻唑4-甲基噻唑2，3，5-三甲基吡嗪2-乙基己醇糠醇二甲基二硫醚糠基甲基二硫醚异丁酸1，3，5-三甲苯相对含量/%0.18 2.35 21.83 0.64 0.44 4.55 0.21 1.66 37.95 17.88 1.20 0.42 0.05 0.94阈值/（mg/kg）0.001 2 0.14 11 0.5 0.017 0.038 0.055 0.350 12 25.482 2 4.500 5 0.001 1 9.562 29 0.010 5 ROAV 13.75 1.54 0.18 0.12 2.38 10.98 0.35 0.43 0.14 0.36 100.00 0.004<0.001 8.21气味强度0 3 2 2 3 3 0 0 3 2 3 2 0 0鉴定方式MS、RI MS、RI、O MS、RI、O MS、RI、O MS、RI、O MS、RI、O MS、RI MS、RI MS、RI、O MS、RI、O MS、RI、O MS、RI、O MS、RI MS、RI气味特征有类似梨的水果香味类似樟脑的气味有花香香气，木香气息水煮牛肉的香气有恶臭气味具有烤土豆、炒花生、核桃、坚果、壤香、发酵霉香的香气有甜味和淡淡的花香有特殊的苦辣气味，香甜，干草芳香有恶臭，强烈的洋葱、甘蓝、蔬菜香气土腥味有刺激性气味带有一种特有的气味
由表3 可知，不饱和醇、酮类化合物、含硫化合物以及杂环类化合物对小球藻生长因子整体风味贡献较大，这几种化合物虽然相对含量不高，但阈值低，主要呈现恶臭味、干草香[28-29]。在鉴定出的50 种化合物中，有6 种化合物的ROAV 大于1，其中醛类物质1种、酮类物质1 种、杂环类物质2 种、含硫化合物1 种以及苯类衍生物1 种，分别为异戊醛、2-庚酮、2，4，5-三甲基恶唑、噻唑、二甲基二硫醚、1，3，5-三甲苯，对小球藻生长因子整体风味影响比较大。综上可知，杂环类、醛类、酮类、含硫化合物共同构成小球藻生长因子液的整体风味。
2.3 小球藻生长因子关键挥发性风味物质的筛选
ROAV 是对样品中复杂气味进行量化，而GC-OMS 则是将嗅闻感官评价与仪器相结合，两者起到互相补充的作用，需要综合考虑才能确定小球藻生长因子的关键性风味化合物。表3 中ROAV 大于1 的6 种物质中2-庚酮（有类似梨的水果香味）、2，4，5-三甲基恶唑（水煮牛肉的芳香）、噻唑（有恶臭气味）、二甲基二硫醚（有恶臭，强烈的洋葱、甘蓝、蔬菜香气）这4 种物质成分的ROAV 和气味强度均较高，对小球藻生长因子液整体气味贡献程度很大；异戊醛、1，3，5-三甲苯的ROAV 虽高，但相对含量小，且在嗅闻中并未嗅闻到其风味；2-乙基己醇（有甜味和淡淡的花香）的ROAV 虽小于1，但气味强度为3。
综合上述，可以确定2-庚酮、2，4，5-三甲基恶唑、噻唑、二甲基二硫醚和2-乙基己醇这5 种成分为小球藻生长因子的关键挥发性风味物质。虽然其中有些成分呈现令人愉快的风味，但二甲基二硫醚、噻唑均呈恶臭味且气味阈值低，可能是小球藻食品开发的主要限制因素。
3 结论
当前对小球藻及小球藻生长因子的主要功能成分研究较多，但关于其藻腥味成分及来源的研究报道却很少，为了充分利用这一具有良好营养价值和生物活性的食品资源，本研究探讨了小球藻生长因子中的关键挥发性风味物质，为产品开发中不愉快风味的去除或遮蔽提供理论基础。
本研究比较HS-SPME 法与SAFE 法鉴定出的挥发性风味物质，分析发现HS-SPME 法提取的挥发性风味物质种类更多，相对含量更高，能够比较完整地鉴定小球藻生长因子液的挥发性风味物质，故最终选择使用HS-SPME 法对小球藻生长因子液进行挥发性风味物质的提取。
本研究采用气质联用结合嗅闻检测技术（GC-OMS）对小球藻生长因子液中挥发性风味物质进行检测与分析，使用NIST 和WILEY 两谱库检索，共鉴定出50 种成分，分别为醛类6 种、酮类8 种、杂环类20 种、醇类4 种、酚类3 种、含硫化合物3 种、其他类化合物6 种。结合气味阈值和ROAV 确定5 种小球藻生长因子中的关键风味物质，分别为2-庚酮、2，4，5-三甲基恶唑、噻唑、二甲基二硫醚和2-乙基己醇。
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