γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）具有改善睡眠[1]、降血压[2]、调节新陈代谢[3]、增强免疫力[4]、抑制癌症[5]、改善甲状腺功能和氧化应激[6]等多种生理功能。我国食品安全标准与监测评估司2009 年第12 号公告已批准GABA 为新资源食品，推荐食用量≤500 mg/d。
利用植物源食材富集GABA 而直接开发为GABA功能性食品，可以免除GABA 的提取、纯化等生产工艺过程，降低生产成本，因此利用植物及其内源酶富集GABA 已引起研究人员极大关注。研究表明，通过应激反应（如机械损伤、热激、冷激、高盐、缺氧等），可以显著增加发芽糙米[7]、大豆[8]、蚕豆[9]、豌豆[10]、芸豆[11]、桑叶[12]和咖啡叶[13]的GABA 含量。但利用胁迫应激反应富集的植物性食材的GABA 含量仍偏低，且风味易劣化。
番茄（Solanum lycopersicum L.）营养物质丰富、风味独特[13]、富含具有强抗氧化活性[14]并可调控肠道菌群[15]的番茄红素。Saito 等[15]对日本2005 年和2006 年61 个商业品种、野生物种和野生衍生物种的番茄GABA 含量进行评估，结果表明番茄果实GABA 含量在试验品种之间差异很大，仅有部分品种的番茄含有GABA，并且在试验年份之间的重现性较差，其中通过盐胁迫筛选得到的新品种DG03-9 含量最高，2005 年和2006 年番茄鲜果GABA 含量分别为（189.7±30.0）mg/100 g 和（102.5±9.9）mg/100 g。谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）可专性催化L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）的α-羧基发生脱羧作用而生成GABA[16]，Nonaka 等[17]采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对番茄GAD 的基因进行改造，结果发现番茄GABA 含量提高了7~15 倍。虽然通过基因编辑技术可显著增加番茄GABA 含量，但基因工程食品的安全性仍有待评估。郑焕焕[18]研究表明，对绿熟期番茄果实采用短波紫外线辐照可显著增加GABA 含量，GABA 含量增加了138%，但富集后的番茄GABA 含量也仅为0.57µg/kg，说明该试验所用番茄品种的GABA 含量较低。
乳酸菌是一种食品级的安全菌株，其GAD 活力较高，应用乳酸菌生物合成GABA 已得到极大关注[19]。番茄经乳酸菌发酵后风味浓郁、酸爽解腻，深受消费者喜爱[20]。
普罗旺斯番茄是目前市场上流行的番茄品种，熟果汁多味美、深受消费者喜爱，但目前关于普罗旺斯番茄GABA 含量情况尚未见报道。戊糖片球菌具有改善肠道菌群、降低胆固醇、提高免疫力等多种作用[21]，已被国家卫生和计划生育委员会（2014 年第6 号公告）批准为新食品原料。戊糖片球菌具有较高GAD 活力，可用于生物合成GABA[22]。本文在分析普罗旺斯番茄天然GABA 含量的基础上，利用戊糖片球菌作为发酵剂对普罗旺斯番茄发酵富集GABA 的工艺条件进行优化，以期为富含GABA 的发酵番茄功能性食品的研发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）LL1、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）PP1：保藏于岭南师范学院绿色生物制造研究室。
普罗旺斯红熟番茄（产地为新疆）：市售。
MRS 液体培养基：参照文献[23]进行配制，分装于250 mL 三角瓶，100 mL/瓶；脱脂乳培养基：参照文献[22]进行配制，分装于试管中，10 mL/支。
1 号新华滤纸：杭州沃华滤纸有限公司；乙腈、三乙胺、乙酸（均为色谱纯）：美国TEDIA 公司；异硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）、γ-氨基丁酸（均≥99%）：美国Sigma-Aldrich 公司；732 强酸型阳离子交换树脂：廊坊沃恒化工有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-MS 8030 液相色谱-质谱（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）联用仪、AUW120 电子分析天平：日本Shimadzu 公司；FE28 pH 计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；P1201 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：大连依利特分析仪器有限公司；TGL16M 台式高速冷冻离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司；VX-200 涡旋混合仪：美国Labnet 公司；ZMGZ-J5 便携果汁机：西安臻米电子科技有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：常州荣华仪器制造有限公司；LRH-250F 生化培养箱：深圳市联翔电机有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鲜番茄GABA 的纯化与鉴定
将去梗剥皮的番茄对半切开，去籽并回收汁液，用便携果汁机将番茄块与汁液混合物搅打制成番茄浆。称取番茄浆500 g，加入蒸馏水250 mL，混匀，90 ℃间歇搅拌30 min，冷却，滤布压滤，滤液于8 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集上清液，采用1 mol/L NaOH 或HCl 溶液将滤液调节至pH4.5，即为番茄GABA 粗提取液。参考文献[24]利用732 强酸型阳离子交换树脂对番茄GABA 进行固相萃取和纯化，并略作修改：取125 mL 番茄GABA 粗提取液，加入已再生的732 强酸型阳离子交换树脂100 g，间歇搅拌混合20 min，滤布过滤，收集树脂与另125 mL 番茄GABA 粗提取液混合，如此重复用同一树脂分批交换和浓缩番茄GABA粗提取液中的GABA，然后用400 mL 蒸馏水分批淋洗树脂去除未交换物，再将树脂于100 mL 0.15 mol/L Na2CO3 溶液浸泡5 min，并间歇搅拌，以碱置换并中和树脂残余H+，滤布过滤，弃去滤液（pH<7，无GABA检出），收集树脂。将树脂用50 mL 0.15 mol/L Na2CO3溶液浸泡洗脱GABA，室温间歇搅拌5 min，滤布过滤并收集滤液，树脂再用另50 mL 0.15 mol/L Na2CO3 溶液按同样操作洗脱GABA，合并2 次滤液即为GABA 纯化液。采用纸层析和LC-MS 定性分析GABA 纯化液，采用HPLC 定量分析番茄GABA 含量。
1.3.2 发酵番茄工艺流程
1.3.2.1 发酵流程
番茄→挑选→去表皮和果梗→切分→去籽→打浆→调节→分装→灭菌→冷却→接发酵剂→发酵。
1.3.2.2 操作要点
1）挑选：选择新鲜、没有虫孔的番茄。
2）去表皮和果梗：开水热烫番茄1~1.5 min，冷水浸泡冷却，去梗剥皮。
3）切分：用刀对半切开番茄，去籽，用滤布回收汁液。
4）打浆：将番茄块与汁液混合，用打浆机制成浆状，得到未发酵番茄浆。
5）调节：调整番茄浆L-谷氨酸一钠（L-monosodium glutamate，MSG）添加量和pH 值。
6）分装：番茄浆分装于250 mL 三角烧瓶，100 g/瓶。
7）灭菌：番茄浆于121 ℃灭菌20 min。
8）接发酵剂、发酵：在无菌条件下操作，在番茄浆中接入发酵剂，混合均匀，生化培养箱中静置发酵，得到发酵番茄浆。
1.3.3 发酵剂的制备
分别将4 ℃脱脂乳培养基保存的戊糖片球菌PP1、乳酸乳球菌LL1 用涡旋混合仪混匀，按1%（体积分数）接种量接入MRS 液体培养基（100 mL/瓶），37 ℃静置培养24 h，作为菌种活化液。分别按2%（体积分数）的接种量将菌种活化液转接到MRS 液体培养基（100 mL/瓶），37 ℃静置培养24 h，于4 ℃、8 000 r/min离心15 min，弃去上清液，用无菌生理盐水清洗菌体，再次于4 ℃、8 000 r/min 离心15 min，收集菌体，然后按料液比1∶100（g/mL）将菌体均匀分散于无菌生理盐水作为发酵剂。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 发酵剂对番茄GABA 富集的影响
分装已添加MSG 10 g/kg、pH7.0 的番茄浆100 g于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，分别接入2 mL 发酵剂（戊糖片球菌PP1、乳酸乳球菌LL1），37 ℃静置发酵48 h，测定GABA 含量。以-20 ℃冻藏的未发酵番茄浆作为空白对照组（CK）。
1.3.4.2 发酵温度对番茄GABA 富集的影响
分装已添加MSG 10 g/kg、pH7.0 的番茄浆100 g于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，各接入2 mL 戊糖片球菌PP1 发酵剂，分别于31、34、37、40、43 ℃静置发酵48 h，测定GABA 含量。
1.3.4.3 初始pH 值对番茄GABA 富集的影响
将已添加MSG 10 g/kg 的番茄浆的pH 值分别调节为自然、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，分装番茄浆100 g 于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，各接入2 mL戊糖片球菌PP1 发酵剂，37 ℃静置发酵48 h，测定GABA 含量。
1.3.4.4 葡萄糖添加量对番茄GABA 富集的影响
在已添加MSG 10 g/kg、pH6.5 的番茄浆中，分别添加葡萄糖0、5、10、15、20 g/kg，分装番茄浆100 g 于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，各接入2 mL戊糖片球菌PP1 发酵剂，37 ℃静置发酵48 h，测定GABA 含量。
1.3.4.5 MSG 添加量对番茄GABA 富集的影响
在pH6.5 的番茄浆中分别添加MSG 5、10、15、20、25 g/kg，分装番茄浆100 g 于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，各接入2 mL 戊糖片球菌PP1 发酵剂，37 ℃静置发酵48 h，测定GABA 含量。
1.3.4.6 发酵时间对番茄GABA 富集的影响
分装已添加MSG 15 g/kg、pH6.5 的番茄浆100 g于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，各接入2 mL 戊糖片球菌PP1 发酵剂，37 ℃分别静置发酵24、48、72、96、120 h，测定GABA 含量。
1.3.4.7 接种量对番茄GABA 富集的影响
分装已添加MSG 15 g/kg 、pH6.5 的番茄浆100 g于250 mL 三角瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却，分别按接种量为10、20、30、40、50 mL/kg 接入戊糖片球菌PP1发酵剂，37 ℃静置发酵96 h，测定GABA 含量。
1.3.5 正交试验
根据单因素试验结果选择发酵温度、发酵时间、初始pH 值、接种量、MSG 添加量5 个因素进行L8（27）正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 L8（27）正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of L8（27）orthogonal design
水平1 2因素A 发酵温度/℃37 40 B 发酵时间/h 96 108 C 初始pH 值6.5 7.0 D 接种量/（mL/kg）40 50 E MSG 添加量/（g/kg）15 20
1.3.6 番茄GABA 分析前处理
称取未发酵或已发酵的番茄浆20 g，加入蒸馏水60 mL，混匀，常温（大于30 ℃）间歇搅拌30 min，用蒸馏水定容至100 mL，于4 ℃、8 000 r/min 离心15 min，收集上清液即为GABA 待测样品。
1.3.7 LC-MS 条件
色谱条件：Waters Atlantis T3（3.0 mm×150 mm，3 µm）色谱柱，柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量10.0µL；流动相A 为0.5 g 乙酸铵+0.1%（体积分数）甲酸水溶液；流动相B 为甲醇。洗脱方式为梯度洗脱，洗脱梯度见表2。
表2 LC-MS 分析的洗脱梯度
Table 2 Elution gradient of LC-MS
时间/min 0.01 3.00 6.00 6.10 10.00流动相A/%30.0 95.0 95.0 30.0 30.0流动相B/%70.0 5.0 5.0 70.0 70.0
质谱条件：采用电喷雾离子源（electrospray ioniation，ESI）正离子模式（ESI+）电离，多重反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析；干燥气流量15 L/min；脱溶剂管（desolvation line，DL）温度250 ℃；加热块温度400 ℃；碰撞气压17 kPa。
1.3.8 纸层析
展开剂为正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5（体积比），展开剂含茚三酮3 g/L，展程16 cm。发色条件为90 ℃保温5 min。
1.3.9 GABA 定量测定
将待测样品进行适当稀释，然后参照文献[25]采用HPLC 测定样品中GABA 含量。番茄样品GABA 含量（mg/g）均以湿质量（wet mass，WM）计。GABA 含量（G，mg/g WM）按下列公式进行计算。
式中：C 为HPLC 测定浓度，mg/L；D 为未发酵或已发酵的番茄浆GABA 提取液的稀释倍数；V 为未发酵或已发酵的番茄浆提取液的体积，mL；m 为用于提取GABA 的未发酵或已发酵的番茄浆质量，g。
1.4 数据处理
结果以平均值±标准差表示，采用软件IBM SPSS Statistics 19.0 通过独立样本t 检验或单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）的Duncan 法进行统计分析。采用Microsoft excel 2010 软件绘图。以标注于图表的数据点的不同字母表示两组间差异显著（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 鲜番茄GABA 纯化、鉴定与分析
纸层析及LC-MS 结果见图1、图2。
图1 番茄GABA 纯化液纸层析图
Fig.1 Paper chromatography of purified GABA extract of tomatoes
图2 番茄GABA 纯化液LC-MS 反应监测总离子流图
Fig.2 Total ion chromatogram of purified GABA extract of tomatoes in LC-MS
由图1 可知，经树脂纯化的番茄纯化液存在与GABA 标准品迁移距离一致的氨基酸斑点。由图2 可知，番茄纯化液中存在GABA，两种不同的色谱方法定性分析结果一致。结果表明，普罗旺斯红熟番茄含有GABA。经HPLC 测定，普罗旺斯红熟番茄GABA 含量为（0.41±0.01）mg/g WM。
Okada 等[26]研究表明每天口服摄入26.4 mg GABA，老年初期精神障碍和妇女更年期综合症的总改善率为75%。按此剂量推算，摄入普罗旺斯红熟番茄64.6 g 即可满足需要，然而番茄品种、种植方式、时间等均会影响番茄GABA 含量[15]，因此食用天然番茄尚难以保障摄入GABA 的剂量。按我国推荐GABA 食用量上限值500 mg/d 计，则每天需要食用1.22 kg 番茄，在正常情况下不可能达到此摄入量。作为功能性食品，需要长时间规律性食用，才能充分发挥功能性因子的效价，然而按照饮食习惯，长时间大量食用同种食物极易产生厌腻反应。此外，一些番茄产品的开发需要加入其他辅料，这样也会稀释GABA 含量。由此可见，无论是从直接食用还是功能性番茄食品的开发的角度而言，以天然番茄作为GABA 补充食材，其GABA 含量仍偏低，亟需通过富集而提高其GABA 含量。
732 阳离子交换树脂对GABA 具有很好的交换吸附作用，已用于GABA 的精制工艺[24]。本试验利用732 阳离子交换树脂作为固相萃取剂，对GABA 进行初步纯化和浓缩，可增加样品的GABA 纯度和浓度，更有利于对微量GABA 的定性和定量分析，提高分析的灵敏度。
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 发酵剂对番茄GABA 富集的影响
发酵剂对番茄GABA 富集的影响见图3。
图3 发酵剂对番茄GABA 富集的影响
Fig.3 Effect of fermentation starter on GABA enrichment in tomatoes
戊糖片球菌和乳酸乳球菌已被作为发酵剂用于富集椰子汁[27]和奶酪[28]的GABA。分别以戊糖片球菌PP1 和乳酸乳球菌LL1 对番茄浆进行发酵，由图3 可知，番茄GABA 含量分别为（3.18±0.14）mg/g WM 和（1.69±0.23）mg/g WM，GABA 含量较未发酵番茄（CK）均显著提高（P<0.05），与文献报道一致，其中戊糖片球菌PP1 对GABA 的富集效果最佳，因此选择戊糖片球菌PP1 作为发酵菌剂。
2.2.2 发酵温度对番茄GABA 富集的影响
发酵温度对番茄GABA 富集的影响见图4。
图4 发酵温度对番茄GABA 富集的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on GABA enrichment in tomatoes
由图4 可知，发酵温度对戊糖片球菌发酵富集番茄GABA 有较大影响，番茄GABA 含量随着发酵温度的升高呈现先增后降的趋势，当发酵温度为37 ℃时，番茄GABA 含量最高，为（3.39±0.07）mg/g WM，与40 ℃发酵差异不显著（P>0.05），但与其他温度发酵时差异显著（P<0.05）。因此，选择发酵温度为37、40 ℃进行正交试验。
Kantachote 等[27]以戊糖片球菌HN8 发酵成熟椰子汁富集GABA 的适宜发酵温度为33 ℃。李云等[22]研究表明，戊糖片球菌HS2 全细胞GAD 在35~40 ℃时活性差异不显著。本试验结果表明戊糖片球菌PP1发酵番茄富集GABA 发酵温度为37℃时的GABA 含量最高，这与戊糖片球菌HS2 全细胞转化反应温度基本一致，略高于戊糖片球菌HN8 的发酵温度。GAD是生物体催化L-Glu 发生α-羧基脱羧作用生成GABA的唯一酶[16]，发酵温度不仅是影响戊糖片球菌生长的重要因子，也是影响GAD 的合成量和催化反应活力的重要因子。因此，适宜的发酵温度是对菌体生长、GAD合成和GAD 催化活力的综合作用的反映。
2.2.3 初始pH 值对番茄GABA 富集的影响
初始pH 值对番茄GABA 富集的影响见图5。
图5 初始pH 值对番茄GABA 富集的影响
Fig.5 Effect of initial pH on GABA enrichment in tomatoes
由图5 可知，番茄初始pH 值对戊糖片球菌PP1发酵富集GABA 具有较大影响。当初始pH<6.5 时，番茄GABA 含量随着初始pH 值的升高而增加；当初始pH>6.5 时，番茄GABA 含量随着初始pH 值的升高而降低；当初始pH 值为6.5 时，番茄GABA 的含量最高，为（4.42±0.25）mg/g WM，与其他试验组差异显著（P<0.05）。因此，选择发酵初始pH 值为6.5、7.0 进行正交试验。
Kantachote 等[27]以戊糖片球菌HN8 发酵成熟椰子汁富集GABA 的适宜初始pH 值为5.92。李云等[22]研究表明，戊糖片球菌HS2 全细胞GAD 最适转化反应pH 值为4.5。本试验结果发现，发酵番茄富集GABA初始pH 值为6.5 时的GABA 含量最高，这与已有文献存在一定差异。微生物通过GAD 催化L-Glu 的α-羧基发生脱羧作用生成GABA，消耗H+，提高细胞微环境的pH 值，抵抗酸性环境对其生长繁殖的不利影响，这是微生物的耐酸机制之一[29]。戊糖片球菌为乳酸菌，其生长代谢过程中会产生乳酸，从而造成基质pH值下降，当pH 值达到戊糖片球菌GAD 催化反应pH值范围后，即可催化发酵基质中的L-Glu 转化为GABA，稳定细胞微环境pH 值，缓解自身代谢产生的乳酸的毒害。发酵基质的初始pH 值是戊糖片球菌生长的重要因子，戊糖片球菌生长代谢产生的乳酸将造成基质pH 值下降，从而抑制戊糖片球菌自身的生长，降低其细胞数，导致发酵基质中的L-Glu 转化率降低，GABA 产量减少。因此，发酵初始pH 值也是对菌体生长、GAD 合成和GAD 催化活力综合作用的反映。
2.2.4 葡萄糖添加量对番茄GABA 富集的影响
葡萄糖添加量对番茄GABA 富集的影响见图6。
图6 葡萄糖添加量对番茄GABA 富集的影响
Fig.6 Effect of glucose addition amount on GABA enrichment in tomatoes
由图6 可知，不同试验组的GABA 含量差异不显著（P>0.05）。碳源的种类和含量是影响微生物生长和代谢的重要因子，图6 表明是否添加葡萄糖，对戊糖片球菌发酵番茄产GABA 无显著影响，说明番茄所含的营养物质已经能满足戊糖片球菌PP1 对碳源的需要。因此，选择不添加葡萄糖。
2.2.5 MSG 添加量对番茄GABA 富集的影响
MSG 添加量对番茄GABA 富集的影响见图7。
图7 MSG 添加量对番茄GABA 富集的影响
Fig.7 Effect of MSG addition amount on GABA enrichment in tomatoes
由图7 可知，在MSG 添加量为5~25 g/kg 时，GABA含量随着MSG 添加量的增加而增加，而当MSG 添加量超过15 g/kg 时，GABA 含量变化差异不显著（P>0.05）。L-Glu 是GAD 催化生成GABA 的底物[16]，发酵基质中L-Glu 浓度对发酵合成GABA 具有重要影响。为保证具有足够的GAD 转化底物，选择MSG 添加量为15、20 g/kg 进行正交试验。
2.2.6 发酵时间对番茄GABA 富集的影响
发酵时间对番茄GABA 富集的影响见图8。
图8 发酵时间对番茄GABA 富集的影响
Fig.8 Effect of fermentation time on GABA enrichment in tomatoes
由图8 可知，发酵时间对GABA 富集影响较大，发酵时间为24~96 h 时，GABA 含量随发酵时间的延长显著增加（P<0.05）；当发酵时间超过96 h 时，GABA含量变化不显著（P>0.05）。
GAD 是催化L-Glu 转化为GABA 的唯一酶[16]，戊糖片球菌PP1 发酵番茄富集GABA 的实质是利用戊糖片球菌PP1 胞内GAD 催化L-Glu 转化为GABA。发酵时间不仅包含戊糖片球菌生长时间，也包含GAD催化反应时间。此外，当发酵基质pH 值到达催化GABA 分解代谢γ-氨基丁酸转氨酶和γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶偶联酶[30]的活性范围时，还应考虑发酵时间对GABA 分解的影响。因此，发酵时间是多因素综合效应评价的结果，虽然图8 显示发酵96 h 与120 h 无显著差异，但为了消除因其他因素的影响而造成发酵时间不足，因此选择发酵时间为96、108 h（96 h 与120 h 的中值）进行正交试验。
2.2.7 接种量对番茄GABA 富集的影响
接种量对番茄GABA 富集的影响见图9。
图9 接种量对番茄GABA 富集的影响
Fig.9 Effect of inoculation amount on GABA enrichment in tomatoes
从图9 可知，GABA 的含量随着接种量的增加呈升高的趋势，但接种量为50 mL/kg 时，GABA 含量与接种量分别为30 mL/kg 和40 mL/kg 的试验组差异不显著（P>0.05），而与接种量分别为10 mL/kg 和20 mL/kg的试验组差异显著（P<0.05）。接种量大小不仅会影响戊糖片球菌生长的延滞期长短，而且作为种子的戊糖片球菌细胞本身还具有催化番茄中的L-Glu 转化为GABA 的作用，接种量越大则参与发酵前期转化反应的细胞也越多，这可能是GABA 含量随着接种量增加呈升高变化趋势的原因之一。因此，选择接种量为40、50 mL/kg 进行正交试验。
2.3 正交试验结果分析
2.3.1 正交试验结果
正交试验结果见表3。
表3 L8（27）正交试验设计及结果
Table 3 L8（27）orthogonal design and experimental results
注：肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 K1 K2 k1 k2 R A 1 1 1 1 2 2 2 2 18.13 17.75 4.53 3.94 0.59 B 1 1 2 2 1 1 2 2 15.97 17.91 3.99 4.48 0.49 A×B 1 1 2 2 2 2 1 1 16.44 17.44 4.11 4.36 0.25 B×D 1 2 1 2 1 2 1 2 17.36 16.52 4.34 4.13 0.21 C 1 2 1 2 2 1 2 1 18.57 15.31 4.64 3.83 0.81 D 1 2 2 1 1 2 2 1 15.93 17.95 3.98 4.49 0.51 E 1 2 2 1 2 1 1 2 16.32 17.56 4.08 4.39 0.31 GABA 含量/（mg/g WM）4.27±0.17b 4.06±0.11bc 5.82±0.36a 3.98±0.09bc 3.42±0.13d 4.22±0.16b 3.85±0.07c 4.26±0.19b
由表3 可知，因素交互作用A×B、B×D 的空列极差分别为0.25 和0.21，均小于A、B、C、D、E 因素的极差，说明各因素的水平存在效应差异。各因素极差大小表明影响戊糖片球菌PP1 发酵富集番茄GABA 的因素主次顺序为C（初始pH 值）>A（发酵温度）>D（接种量>B（发酵时间）>E（MSG 添加量），最优水平为A1B2C1D2E2，即发酵温度37 ℃、发酵时间108 h、初始pH6.5、戊糖片球菌PP1 发酵剂接种量50 mL/kg、MSG 添加量20 g/kg。3 号试验组的因素水平与优化的最优水平A1B2C1D2E2一致，在该条件下发酵的番茄GABA 含量为（5.82±0.36）mg/g WM，与其他处理组差异显著（P<0.05）。
2.3.2 验证试验
采用正交试验优化的最优水平A1B2C1D2E2 进行验证试验，番茄GABA 含量为（5.91±0.24）mg/g WM，与正交试验3 号试验组结果（5.82±0.36）mg/g WM 无显著差异（P>0.05），较未经发酵的番茄GABA 含量（0.41±0.01）mg/g WM 提高了13.41 倍。
3 结论
基于番茄的丰富营养价值和独特风味特性以及GABA 的多种生理功能，开发富GABA 番茄食品，可提升番茄的附加值。试验结果表明，普罗旺斯红熟番茄含有（0.41±0.01）mg/g WM 天然GABA。戊糖片球菌PP1 较乳酸乳球菌LL1 更适宜作为发酵富集番茄GABA 的发酵剂，其最适发酵条件为MSG 添加量20 g/kg、发酵初始pH6.5、接种量50 mL/kg、发酵温度37 ℃、发酵时间108 h。在该条件下发酵的番茄GABA含量为（5.91±0.24）mg/g WM，较未发酵番茄提高了13.41 倍。戊糖片球菌PP1 为益生菌，可直接在食品中应用，发酵富集的GABA 无需提取纯化，发酵的番茄浆料可直接作为原料开发功能性食品。本试验的富集方法简单、工艺条件容易满足，在富GABA 番茄功能性食品的开发方面具有很好的应用前景。
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