补骨脂为豆科植物（Psoralea corylifolia L.）的干燥 成熟果实，是一种药食同源的中草药，味苦、辛、温，归肾、脾经。目前，豆科类植物是植物糖蛋白中研究最多的植物种类之一，但对补骨脂中糖蛋白的氨基酸、单糖种类等研究较少[1-2]。糖蛋白是一种蛋白质与糖以共价键结合的复合物，目前在细菌、病毒、人体中均有发现，它也是细胞膜、酶、激素等结构成分[3-4]。研究表明，糖蛋白具有免疫调节、抑制肿瘤生长、抗氧化、抑菌、防衰老等作用，在食品、药品中有较高的开发利用价值[5-6]。
目前，植物蛋白提取主要采取水提法、酶法、酸碱浸提法等。此外，糖蛋白属于大分子物质，在植物体中主要以胶体或黏液的形式存在[7]。因此，根据蛋白质及糖的性质，结合国内外对大豆、花生等植物蛋白的提取方法以及酶本身具有的专一性、高效性，本文采用碱性蛋白酶对补骨脂中糖蛋白进行提取。碱性蛋白酶是由地衣芽孢杆菌发酵、精制而成的一种天然的酶制剂，具有较强的蛋白分解能力，在高温或碱性条件下都有较好优良性能，在动物、植物中广泛存在，对人体无害[8-9]。本文以补骨脂糖蛋白（Psoralea corylifolia glycoprotein，PCG）提取率为指标，采用响应面优化碱性蛋白酶对PCG 的提取工艺并对其成分进行研究，以期为PCG 的开发提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
补骨脂：贵阳济仁堂药业有限公司；碱性蛋白酶（20 万U/g）、中性蛋白酶（5 万U/g）、木瓜蛋白酶（80万U/g）、纤维素酶（5 万U/g）、改良型Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；石油醚（分析纯）、三氟乙酸（纯度>79.2%）：国药集团化学试剂有限公司；鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、盐酸氨基葡萄糖、氨基半乳糖盐酸盐单糖、岩藻糖：青岛博智汇力生物科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
pH 计（PHS-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司；紫外分光光度计（TU-1810）：北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平（AL204）：美国梅特勒托利多公司；冷冻干燥机（FD）：南京金实仪器设备有限公司；高效液相色谱仪（UltiMate3000）：美国Thermo 公司；超高速全自动氨基酸测定分析仪（LA8080）：日本HITACHI公司；旋转蒸发仪（RE100-Pro）：北京大龙兴创试验仪器股份公司；红外光谱仪（Tracer-1000）：日本岛津公司。
2 方法
2.1 补骨脂脱脂处理
取补骨脂60 ℃烘干，粉碎，过24 目筛，取适量加入5 倍质量石油醚，浸渍30 min 并不断搅拌，5 000 r/min离心5 min，弃上清液，重复3 次，旋转蒸发仪挥干，粉碎，过80 目筛，备用。
2.2 PCG 提取及测定
取3 g 脱脂烘干补骨脂细粉，精密称定，固定酶解pH 值为10.5，酶解温度为45 ℃，调节至适宜料液比、酶解时间及加酶量，待底物与酶反应后，于沸水浴中灭酶3 min，过滤，静置1 h，取上清液，加入0.1 mol/L 盐酸调节pH 值至4.5，5 000 r/min 离心10 min，倾去上清液，加水复溶，冷冻干燥，得PCG，按公式（1）计算提取率（X，%）。
式中：M 为冻干补骨脂糖蛋白质量，g；M1 为补骨脂细粉质量，g。
2.3 酶种类的筛选
酶的催化效率与底物有密切关系，不同的酶对底物的结合、催化效率等也不同。为筛选出具有最佳PCG 提取率的酶，以提取率为指标，选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶进行酶解试验，参照每种酶的使用说明确定加酶量、酶解pH 值，固定料液比为1∶20（g/mL），对酶的种类进行筛选[10-11]。
2.4 单因素试验
参照文献[12-13]，固定酶解pH 值为10.5、酶解温度为45 ℃，以PCG 提取率为指标，考察酶解时间、料液比、加酶量对提取率的影响。
2.4.1 料液比对PCG 提取率的影响
固定加酶量为3 000 U/g，酶解时间为2.5 h，考察料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）对PCG 提取率的影响。
2.4.2 酶解时间对PCG 提取率的影响
固定加酶量为3 000 U/g，料液比为1∶30（g/mL），考察酶解时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 对PCG提取率的影响。
2.4.3 加酶量对PCG 提取率的影响
固定料液比为1∶30（g/mL），酶解时间为2.5 h，考察加酶量为1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g 对PCG 提取率的影响。
2.5 响应面优化试验
以料液比（A）、酶解时间（B）、加酶量（C）为独立变量，PCG 提取率为响应变量，采用Design Export 8.0.6的Box-Behnken 响应面试验优化PCG 提取条件。因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平-1 0 1 A 料液比/（g/mL）1∶25 1∶30 1∶35 B 酶解时间/h 2.0 2.5 3.0 C 加酶量/（U/g）2 500 3 000 3 500
2.6 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）检测
参照文献[14]，取适量PCG 加水溶解，装入透析袋透析72 h，将透析后的PCG 液体冷冻干燥。再参照文献[15]的方法，以浓缩胶浓度为4.5%，分离胶浓度为12.5% 进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250 染色，再脱色至条带清晰。
2.7 PCG 成分分析
2.7.1 氨基酸组分分析
参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法[16]对PCG 中氨基酸进行分析。
2.7.2 PCG 中单糖种类分析
2.7.2.1 标准曲线的绘制
精 密称 取 鼠李 糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯 糖（arabinose，Ara）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，Gal-UA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，Glc-UA）、盐酸氨基葡萄糖（D-glucosamine hydrochloride，GlcN）、氨基半乳糖盐酸盐单糖（Dgalactosamine HCl，GalN）各5 mg，岩藻糖（fucose，Fuc）20 mg 至10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。稀释至适宜浓度梯度，过0.22 μm 微孔滤膜，进样。
2.7.2.2 样品溶液的制备
参照文献[17]方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化对PCG 中单糖进行测定。精确称取冻干PCG 样品约5 mg，加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸溶液，121 ℃加热2 h，氮气吹干。再加入3 mL 甲醇润洗2~3 次，吹干，加水5 mL使其溶解，备用。精密量取已制备溶液0.2 mL 于离心管中，加入0.2 mL 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液和0.5 mL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，涡旋混匀后于70 ℃水浴中反应1 h，再加入0.2 mL 0.5 mol/L盐酸、氯仿1 mL，萃取3 次，弃去氯仿层，取0.6 mL 加水定容至2 mL，即得样品溶液。
2.7.2.3 色谱条件
参照文献[18]的方法，色谱柱为ZORBAX EclipseXDBC18，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾12 g/L，2 mol/L NaOH 调整pH 值至pH6.8）等度洗脱，乙腈和磷酸盐缓冲液的体积比为17∶83，流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃，检测波长250 nm，进样量10µL。
2.7.3 红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）分析
参照文献[19]的方法，取适量PCG 至玛瑙研钵中与溴化钾混匀，采用溴化钾压片法进行压片。在全波段（4 000~4 00 cm-1）条件下对PCG 进行扫描分析。
2.8 数据分析
所有试验均重复3 次，数据以平均值±标准差表示，数据使用Excel 2020 进行分析处理；Design Expert 8.0.6 进行响应面优化，Origin 2019 绘图。
3 结果与分析
3.1 酶种类筛选结果
酶种类筛选结果见图1。
图1 酶种类筛选结果
Fig.1 Screening results of enzyme types
从图1 可以得出，通过对中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、碱性蛋白酶4 种酶的筛选，在相同条件下，4 种酶对PCG 的提取率有较大差别。当酶解时间为2.5 h 时，碱性蛋白酶的提取率最大，为（3.03±0.08）%，因此选择碱性蛋白酶对PCG 进行提取。
3.2 单因素试验结果
加酶量、料液比、酶解时间对PCG 提取率的影响见图2。
图2 加酶量、料液比、酶解时间对PCG 提取率的影响
Fig.2 Effects of the amount of enzyme added，material liquid ratio，and enzymatic hydrolysis time on PCG extraction rate
由图2 可知，随着溶剂用量的增加，PCG 提取率呈现先增加后下降趋势。当料液比为1∶10~1∶30（g/mL）时，PCG 提取率增加，可能是随着溶剂用量增加，底物与酶的碰撞接触不断增加，酶解效率增大，提取率不断增加。料液比为1∶30（g/mL）时，PCG 的提取率达到最大，为（3.04±0.14）%。继续增加溶剂用量，PCG 提取率下降，可能是因为酶被稀释，与底物碰撞接触降低，导致提取率下降，同时溶剂的添加导致PCG 的浓度有降低，对提取率有一定的影响。因此选择料液比1∶25~1∶35（g/mL）进行响应面优化试验。
PCG 提取率随酶解时间的延长呈先升高后降低趋势。当酶解时间为0.5~2.5 h 时，PCG 提取率迅速增大，当酶解时间为2.5 h 时，PCG 提取率达到最高，为（2.95±0.04）%，此时底物与酶已基本反应完毕，因此选择2.0~3.0 h 进行响应面优化试验。
PCG 提取率随加酶量增大呈先升高后降低趋势。当加酶量为1 000~3 000 U/g 时，PCG 提取率呈现上升趋势，这可能是随着酶浓度的增加，酶与底物碰撞接触增加且结合位点相当，故酶解效率增大，PCG 提取率升高，当加酶量为3 000 U/g 时，提取率达到最大，为（2.77±0.08）%。当加酶量大于3 000 U/g，提取率呈现下降趋势，可能是因为酶过度饱和，底物消耗不断增加且底物与酶的接触位点完全被占据。因此选择加酶量2 500~3 500 U/g 进行优化试验。
3.3 响应面优化提取工艺设计及结果
3.3.1 响应面试验结果分析
响应面试验结果如表2 所示。
表2 响应面设计方案及结果
Table 2 Response surface design scheme and results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 料液比0 1-1-1-1-1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 B 酶解时间-1 1-1 0 1 0 0 0-1 0 0 1-1 1 0 0 0 C 加酶量-1 0 0 -1 0 1 0 0 0 1 0-1 1 1 0-1 0 Y 提取率/%0.84 0.83 1.03 0.55 0.69 0.62 2.91 0.85 1.11 0.91 2.85 0.45 0.79 2.88 2.85 0.43 2.86
根据试验结果，采用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计结果分析。得到拟合方程为Y=2.87+0.15A+0.095B-0.042C+0.025AB+0.15AC-0.080BC-0.91A2-0.108B2-1.17C2。
3.3.2 响应面试验方差分析
方差分析见表3。
表3 响应面试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface experiment
注：**表示影响极显著，P<0.01。
方差来源模型A 料液比B 酶解时间C 加酶量AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和16.24 0.17 0.072 0.014 2.5×10-3 0.084 0.026 3.51 4.93 5.79 7.850×10-3 5.250×10-3 2.600×10-3 16.25自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方1.80 0.17 0.072 0.014 2.5×10-3 0.084 0.026 3.51 4.93 5.79 1.21×10-3 1.750×10-3 6.500×10-4 F 值1 609.52 149.99 64.38 12.89 2.23 74.99 22.83 3 126.30 4 399.67 5 161.67 2.69 P 值<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.008 9 0.179 1<0.000 1 0.002 0<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.181 3显著性******************
从表3 可以得出，模型P 值小于0.000 1，具有极显著性，失拟项P>0.05，不显著，表明该回归模型与实测值拟合度较好，适用性高，可以用该模型来分析和预测碱性蛋白酶对PCG 提取率的影响。A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2 对结果具有极显著影响（P<0.01），由F 值可知，3 个因素对PCG 提取率影响的主次顺序为料液比（A）>酶解时间（B）>加酶量（C），R2=0.999 5，R2Adj=0.998 9，表明该模型置信度较高，能够很好反映自变量与响应值之间的关系。
3.3.3 各因素交互作用分析
通过Design Expert 8.0.6 软件，对两因素间交互作用进行分析，得到等高线图和响应面图，结果见图3~图5。
图3 料液比与加酶量相互作用等高线图与响应面图
Fig.3 Contours and response surfaces of the interaction between material liquid ratio and the amount of enzyme added
图4 料液比与酶解时间相互作用等高线图与响应面图
Fig.4 Contours and response surfaces of the interaction between material liquid ratio and enzymatic hydrolysis time
图5 加酶量与酶解时间相互作用等高线图与响应面图
Fig.5 Contours and response surfaces of the interaction between the amount of enzyme added and enzymatic hydrolysis time
由图3~图5 可以得出，交互所得曲线比较陡，说明交互作用较强，与表3 分析结果一致。
3.4 验证试验
采用响应面软件得到酶法催化提取PCG 的最佳工艺为料液比1∶30（g/mL）、酶解时间2.52 h、加酶量2 992.55 U/g，提取率为2.88%，结合实际试验可操作性，将工艺参数调整为料液比1∶30（g/mL）、酶解时间2.5 h、加酶量3 000 U/g，在上述条件下进行试验，PCG提取率为（3.04±0.05）%，与预测值相差不大，表明所得模型可以用于PCG 的提取。
3.5 SDS-PAGE 分析
SDS-PAGE 是鉴定蛋白最常用的方法，谢丹等[20]采用SDS-PAGE 得出川芎蛋白分子量为17~48 kDa。而不同种类的糖蛋白，在机体内具有不同的功能，如转运、酶促反应等[21]。PCG 的SDS-PAGE 图见图6。
图6 PCG 的SDS-PAGE 图
Fig.6 SDS-PAGE diagram of PCG
如图6 所示，通过酶法催化提取的PCG 中蛋白质分子量在17~75 kDa 之间。
3.6 FTIR 分析
目前，针对糖蛋白的结构，主要采用FTIR、核磁共振等方法对糖蛋白中糖苷键位置、基团等进行分析，为糖蛋白的解析提供一定参考。PCG 红外谱结果见图7。
图7 PCG 红外扫描
Fig.7 PCG infrared scanning
由图7 可知，PCG 在3 205.68、2 928.01、2 853.29、1 636.58、1 405.68、1 073.06、611.25 cm-1 附近都有吸收峰，这些区域的吸收峰是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。其中在3 205.68 cm-1 处较弱的吸收峰是O—H 的伸缩振动引起；2 928.01 cm-1 左右较弱的吸收峰是糖的C—H 伸缩振动所引起；在1 636.58 cm-1附近出现的吸收峰是
（羧基或酰胺羰基）伸缩振动和N—H 变角振动引起，也是蛋白类典型的特征吸收峰；1 405.68 cm-1处吸收峰是C—H 变角振动吸收；1 073.06 cm-1 处有吸收峰，说明该多糖的糖环构型是吡喃型[22]。
3.7 PCG 氨基酸含量结果
氨基酸含量测定结果见表4、图8~图9。
图8 氨基酸对照品
Fig.8 Amino acid reference substances
图9 样品中氨基酸成分
Fig.9 Amino acid composition in the sample
表4 PCG 中16 种氨基酸含量测定结果
Table 4 Determination results of 16 amino acids in PCG
氨基酸谷氨酸（Glu）天门冬氨酸（Asp）亮氨酸（Leu）苏氨酸（Thr）丝氨酸（Ser）甘氨酸（Gly）丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）蛋氨酸（Met）异亮氨酸（Ile）酪氨酸（Tyr）笨丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）组氨酸（His）精氨酸（Arg）脯氨酸（Pro）含量/%5.13 3.02 2.69 1.07 1.39 1.17 1.37 1.52 0.32 1.52 1.59 1.63 1.40 1.32 2.29 1.41
由表4、图9 可知，PCG 中共含有16 种氨基酸，其中含量较多的为谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸，含量最少的是蛋氨酸。与已有研究的五指毛桃根中氨基酸种类基本一致，Glu 含量均比其他氨基酸含量高[23]。
3.8 PCG 中单糖组成结果
3.8.1 标准曲线绘制
采用外标法，通过配制不同浓度单糖对照品来制定标准曲线，线性关系见表5。
表5 标准曲线拟合结果
Table 5 Standard curve fitting results
标样名称Man GlcN Rha Glc-UA Gal-UA GalN Glc Gal Xyl Ara Fuc出峰时间/min 17.722 21.798 24.942 25.762 29.317 33.908 36.393 41.273 43.945 45.523 53.518标准曲线方程Y=97.23x-0.296 Y=91.42x-0.210 Y=33.10x+0.252 Y=65.52x-0.242 Y=67.14x-0.08 Y=84.24x-0.184 Y=79.60x+0.294 Y=94.36x+0.033 Y=64.02x+0.726 Y=87.59x+0.550 Y=77.47x+1.44 R2 0.999 0.999 0.995 0.998 0.997 0.999 0.999 0.999 0.995 0.995 0.982
3.8.2 PCG 中单糖种类的测定
单糖对照品和PCG 中单糖测定结果见图10~图11。
图10 单糖对照品HPLC 图
Fig.10 HPLC diagram of monosaccharides reference substances
图11 PCG 中单糖HPLC 图
Fig.11 HPLC diagram of monosaccharides in PCG
柱前衍生法是测定多糖中的单糖最普遍方法之一[24]。由图11 可知，PCG 中含有Man、Glcn、Glc、Gal、Ara 5 种单糖，其中Man 为44.43%，Glcn 为7.15%，Glc为29.80%，Gal 为18.62%，Ara 因分离度较差，故未对占比进行计算。与同类糖蛋白中单糖相比，在众多糖蛋白中均含有Man 且含量远高于其他单糖。
4 结论
糖蛋白是寡糖与蛋白相结合的一种复合物，在食品、药品等研究中具有较高的研究价值。本研究以补骨脂为原料，采用酶法对PCG 进行提取，并对PCG 中成分进行分析。通过对料液比、酶解时间、加酶量进行考察，采用响应面法对提取工艺进行优化，得出PCG的最佳提取工艺为料液比1∶30（g/mL）、酶解时间2.5 h、加酶量3 000 U/g。在最佳提取工艺条件下，采用SDS-PAGE 对PCG 进行分析得出，PCG 分子量在17~75 kDa 之间。采用HPLC、超高速全自动氨基酸测定分析仪及FTIR 对提取纯化的PCG 成分进行综合分析，得出PCG 中共含有16 种氨基酸，其中含量最高的是谷氨酸，为5.13%。单糖种类为5 种，含量最高的是甘露糖，为44.43%。
[1] 王娟,周植星,杨莉,等.补骨脂药材UPLC 指纹图谱建立及12 种主要成分含量测定[J].中草药,2021,52(2):552-557.WANG Juan, ZHOU Zhixing, YANG Li, et al. Establishment of UHPLC fingerprint and determination of 12 main components in Psoraleae Fructus[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2021,52(2):552-557.
[2] 张莹,吕惠子.补骨脂的化学成分和药理作用研究进展[J].临床医药文献电子杂志,2020,7(30):195.ZHANG Ying, LV Huizi. Research progress on chemical composition and pharmacological effects of Fructus Psorale[J].Electronic Journal of Clinical Medical Literature,2020,7(30):195.
[3] NYRA R. Conjugated proteins with irregular heterosaccharide side chains:Glycoproteins[J].Journal of Glycobiology,2021,10(2):1-2.
[4] CHEN G T,YUAN B,WANG H X,et al.Characterization and antioxidant activity of polysaccharides obtained from ginger pomace using two different extraction processes[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,139:801-809.
[5] TU A B,ZHAO X,SHAN Y Y,et al.Potential role of ovomucin and its peptides in modulation of intestinal health: A review[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2020,162:385-393.
[6] IGLESIAS-FIGUEROA B F, ESPINOZA-SÁNCHEZ E A, SIQUEIROS-CENDÓN T S, et al. Lactoferrin as a nutraceutical protein from milk, an overview[J]. International Dairy Journal, 2019, 89:37-41.
[7] KIM J Y, LEE Y M, PARK J P, et al. Phytoglycoprotein isolated from Dioscorea batatas Decne promotes intestinal epithelial wound healing[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2020,18(10):738-748.
[8] 钟敏,常方圆,赵谋明,等.碱性蛋白酶控制酶解诱导大豆分离蛋白纳米颗粒的形成机制[J].食品科学,2022,43(14):93-101.ZHONG Min, CHANG Fangyuan, ZHAO Mouming, et al. Formation and underlying mechanism of soy protein nanoparticles via controlled alcalase hydrolysis[J]. Food Science, 2022, 43(14): 93-101.
[9] 齐兴宇,闫小娟,张海悦.卵白蛋白肽复合酶法制备工艺优化及解酒效果[J].食品与机械,2022,38(5):166-172.QI Xingyu,YAN Xiaojuan,ZHANG Haiyue.Optimization of preparation technology of ovalbumin-peptide by complex enzyme and its antialcoholic effect[J].Food&Machinery,2022,38(5):166-172.
[10] 杨军楠,栾俊家,崔方超,等.不同蛋白酶海参酶解液的制备及其体外免疫调节活性[J].食品研究与开发,2023,44(11):43-52.YANG Junnan, LUAN Junjia, CUI Fangchao, et al. Preparation of hydrolysates of sea cucumber with different proteases and the in vitro immunomodulatory activities[J]. Food Research and Development,2023,44(11):43-52.
[11] 薛南南,房康,张玥辉,等.核桃粕蛋白提取工艺优化及其酶解产物活性研究[J].天津中医药,2019,36(1):87-92.XUE Nannan, FANG Kang, ZHANG Yuehui, et al. Optimization of extraction process of walnut meal protein and activity of enzymatic hydrolysate[J]. Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,2019,36(1):87-92.
[12] 宋吉鹏,孙银玲,丁纯洁,等.参豉糖蛋白提取工艺优化及纤溶活性研究[J].安徽农业科学,2023,51(12):147-153.SONG Jipeng, SUN Yinling, DING Chunjie, et al. Study on extraction process optimization and fibrinolytic activity of glycoprotein from ginseng-Douchi[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences,2023,51(12):147-153.
[13] 王映斌,张煜,李星,等.黑木耳糖蛋白的提取及单糖、氨基酸组成分析[J].食品工业科技,2023,44(7):198-205.WANG Yingbin, ZHANG Yu, LI Xing, et al. Extraction of black fungus glycoprotein and analysis of monosaccharide and amino acid composition[J]. Science and Technology of Food Industry,2023,44(7):198-205.
[14] QIN G,XU W,LIU J P,et al.Purification,characterization and hypoglycemic activity of glycoproteins obtained from pea (Pisum sativum L.)[J]. Food Science and Human Wellness, 2021, 10(3): 297-307.
[15] ZHOU Y H, MA Y L, LI R L, et al. Purification,characterization,and functional properties of a novel glycoprotein from tartary buckwheat (Fagopyrum tartaricum)seed[J]. Food Chemistry,2020,309:125671.
[16] 国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中氨基酸的测定:GB 5009.124—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.National Health and Family Planning Commission of the People′s Republic of China, State Food and Drug Administration of the People′s Republic of China.National food safety standard Determination of amino acids in foods: GB 5009.124—2016[S]. Beijing:Standards Press of China,2017.
[17] LIU D, TANG W, YIN J Y, et al. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development[J]. Food Hydrocolloids,2021,116:106641.
[18] LI T T, WU C E, MENG X Y, et al. Structural characterization and antioxidant activity of a glycoprotein isolated from Camellia oleifera Abel seeds against D-galactose-induced oxidative stress in mice[J].Journal of Functional Foods,2020,64:103594.
[19] HU S,HUO L L,HE J,et al.Ginseng glycoprotein and ginsenoside facilitate anti UV damage effects in diabetic rats[J]. Frontiers in Pharmacology,2022,13:1075594.
[20] 谢丹,鲁延杰,李佳璇,等.响应面法优化川芎蛋白提取工艺及抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2021,42(21):213-220.XIE Dan, LU Yanjie, LI Jiaxuan, et al. Optimization of extraction process and antioxidant activity of Ligusticum chuanxiong protein by response surface methodology[J]. Science and Technology of Food Industry,2021,42(21):213-220.
[21] XU S H, XU X, WU R H. Deciphering the properties and functions of glycoproteins using quantitative proteomics[J]. Journal of Proteome Research,2023,22(6):1571-1588.
[22] 李敏,高丽,岳晓华,等.黄芪糖蛋白的分离纯化及其理化性质、组成成分分析[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(13):48-51.LI Min, GAO Li, YUE Xiaohua, et al. Isolation and purification of astragali Radix glycoprotein and analysis of its physicochemical properties and composition[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2014,20(13):48-51.
[23] 陈荣珠,王小平,高伟城,等.柱前衍生-HPLC 法测定五指毛桃中16 种游离氨基酸含量[J].食品工业科技,2022,43(17):306-315.CHEN Rongzhu, WANG Xiaoping, GAO Weicheng, et al. Determination of 16 free amino acids of Ficus hirta by pre-column derivatization-high performance liquid chromatography[J].Science and Technology of Food Industry,2022,43(17):306-315.
[24] 王小燕,郭常润,常军民,等.怀牛膝多糖的柱前衍生化-HPLC指纹图谱建立及单糖成分含量测定[J]. 中国药房, 2021, 32(3):294-300.WANG Xiaoyan,GUO Changrun,CHANG Junmin,et al.Establishment of pre-column derivatization-HPLC fingerprint and content determination of monosaccharide composition from Achyranthes bidentata polysaccharides[J].China Pharmacy,2021,32(3):294-300.