小米谷糠是谷子去皮加工的产物，是碾磨小米的主要副产品，由于其高纤维含量和有益的健康功能而受到越来越多的关注。小米谷糠是一种全谷物食品，富含多种活性物质，如蛋白质、多糖、矿物质等。多糖是小米谷糠的主要成分之一，是一种重要的天然大分子。多糖在抗氧化、免疫调节、抗菌抑菌、吸湿保湿等方面具有显著效果[1]，还被作为无毒成分用于农业、保健食品、化妆品行业的功能性产品[2]。
超声辅助法提取多糖能够产生水动力，进而增强渗透和毛细效应，减小颗粒尺寸，从而提高多糖提取率并缩短提取时间[3]。酶法提取可以使细胞壁和各种膜快速降解，使多糖成分可以快速流出[4]。宝力道等[5]采用超声辅助法、酶法、碱提取法3 种提取方法提取了广枣多糖，结果表明酶法、超声辅助法提取多糖的得率高于碱提取法。马永强等[6]发现超声辅助复合酶法提取黄精多糖的得率高于其他提取方法。
为克服一些天然多糖生物活性弱的缺陷，采用化学修饰的方法进一步提高多糖的生物活性。羧甲基化修饰通过将活性基团引入到多糖链中，使其分子量变大，溶解度提高，从而增强多糖的生物活性[7]。与其他修饰方法相比，羧甲基化修饰具有试剂少、操作简便、转化安全、无毒等优点。田数等[8]利用有机溶剂碱化法提取裙带菜多糖，并对其进行羧甲基化修饰，证明了羧甲基化裙带菜多糖生物活性强于未修饰的多糖。灵芝多糖也因羧基甲基的引入减少了氢键，抗氧化活性得到增强[9]。
目前，国内外关于小米谷糠多糖的研究鲜有报道，大多集中在蛋白质[10]、脂肪[11]、多酚[12]等方面。本研究以小米谷糠为原料，通过超声辅助酶法提取小米谷糠多糖，并对提取的多糖进行羧甲基化修饰，进一步通过测定小米谷糠多糖及羧甲基化小米谷糠多糖的加工特性和抗氧化性试验评估其功能特性，以期为小米谷糠的有效利用及其工业化应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米谷糠：市售；氯仿、无水乙醇、过氧化氢（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；氯乙酸、冰乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；丙酮、石油醚、异丙醇、正丁醇（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；淀粉酶（20 000 U/g）、木瓜蛋白酶（10 000 U/g）（均为食品级）：天津市众联化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、吡咯酸、硫酸亚铁、水杨酸（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
台式高速冷冻离心机（H2500R）、真空冷冻干燥机（LGJ-18C）：湘潭湘仪仪器有限公司；超声波清洗机（KQ2200）：昆山超声仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet iS50）：美国赛默飞世尔科技公司；三孔电热恒温水槽（DK-8D）：上海一恒科学仪器有限公司；酶标仪（SPX-250B-Z）：美国伯腾仪器有限公司；打发器（OES）：上海力辰邦西仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 小米谷糠多糖的提取
将小米谷糠研磨、过筛（100 目）后依次用丙酮、石油醚、无水乙醇浸泡过夜，烘干得到小米谷糠粉末，加入蒸馏水搅拌均匀后进行超声处理[13]。95 ℃水浴反应3 h，冷却后离心10 min（10 000 r/min），在上清液中添加质量分数为0.8%的淀粉酶和木瓜蛋白酶[14]，60 ℃水解1 h。加入Sevag 试剂（正丁醇∶氯仿=1∶4，体积比），剧烈振荡30 min，10 000 r/min 离心10 min 后取上清液，重复此操作6~7 次后，用4 倍体积的无水乙醇进行醇沉，10 000 r/min 离心10 min 后将沉淀的多糖复溶于水，置于透析袋（500 Da）中透析2 d，冷冻干燥得到小米谷糠多糖[15]。多糖得率（D，%）计算公式如下。
式中：m 为多糖质量，g；M 为小米谷糠质量，g。
1.3.2 单因素试验设计
根据预试验，固定小米谷糠多糖提取条件：小米谷糠粉末3 g、提取温度95 ℃、提取时间180 min、超声时间30 min、超声功率100 W。以上述参数为基础条件，考察各因素对小米谷糠多糖得率影响，试验设计见表1。
表1 单因素试验设计
Table 1 Single factor experiment design
提取时间/min 90 120 150 180 210提取温度/℃80 85 90 95 100料液比/（g/mL）1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30超声时间/min 10 20 30 40 50
1.3.3 响应面试验设计
在1.3.2 的基础上，以小米谷糠多糖得率为响应值，以4 个试验因素为自变量进行响应面分析试验，响应面因素及水平见表2。
表2 响应面因素及水平
Table 2 Levels and factors of response surface
水平-1 0 1因素A 提取时间/min 150 180 210 B 提取温度/℃90 95 100 C 料液比/（g/mL）1∶15 1∶20 1∶25 D 超声时间/min 20 30 40
1.3.4 羧甲基化修饰
参照陈放[16]的方法，并加以改进。称取0.5 g 小米谷糠多糖于锥形瓶中，溶于40 mL NaOH 溶液中（质量分数为20%），充分搅拌1 h。缓慢加入7.5 mL 氯乙酸溶液（4 mol/L），60 ℃恒温水浴反应5 h。冷却至室温后，用冰乙酸调节溶液的pH 值至7，加入无水乙醇沉淀多糖。复溶后置于透析袋（500 Da）用蒸馏水透析2 d，冷冻干燥获得羧甲基化小米谷糠多糖。
1.3.5 小米谷糠多糖中总糖含量测定
采用蒽酮-硫酸法[17]测定小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖中总糖含量。
1.3.6 红外光谱分析
采用溴化钾压片法[18]，将小米谷糠多糖和羧甲基化小米谷糠多糖粉末分别与溴化钾进行混合均匀后，进行红外光谱扫描。
1.3.7 持水性、持油性测定
取一干燥离心管记录质量为m1，分别称取0.5 g小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖，将其质量标记为m。随后将多糖样品移至离心管中，并加入10 mL蒸馏水或食用油进行充分振荡混匀。静置2 h 后5 000 r/min 离心5 min 去除上清液，并记录此时离心管的质量m2。持水性、持油性（Y，g/g）计算公式如下。
式中：m 为多糖质量，g；m1 为离心管质量，g；m2 为离心后总质量。
1.3.8 乳化性及乳化稳定性测定
吸取10 mL10 mg/mL 小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖溶液与5.0 mL 食用油充分混匀后离心5 min（5 000 r/min），标记乳化层体积为V1；水浴加热30 min，5 000 r/min 离心5 min 后标记此时乳化层体积为V2。乳化性（E，%）及乳化稳定性（ES，%）计算公式如下。
式中：V1 为加热前乳化层体积，mL；V2 为加热后乳化层体积，mL；15 为溶液总体积，mL。
1.3.9 起泡性及泡沫稳定性测定
吸取15 mL 0.1 g/mL 的小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖溶液，标记初始体积V0，使用打发器高速搅拌10 min，标记体积V1。搅打停止30 min 后，标记体积V2，起泡性（F，%）和泡沫稳定性（FS，%）计算公式如下。
式中：V0 为初始体积，mL；V1 为泡沫打发体积，mL；V2 为泡沫保留体积，mL。
1.3.10 DPPH·清除能力测定
配制梯度浓度的小米谷糠多糖溶液和羧甲基化小米谷糠多糖溶液，逐一加入0.1 mmol/L DPPH 溶液，充分混匀测量515 nm 处反应体系的吸光度。
1.3.11 ·OH 清除能力测定
配制梯度浓度的小米谷糠多糖溶液和羧甲基化小米谷糠多糖溶液，逐一加入FeSO4、H2O2 以及水杨酸溶液（浓度为10 mmol/L），测量536 nm 处反应体系的吸光度[19]。
1.3.12 O2-·清除能力测定
配制梯度浓度的小米谷糠多糖溶液和羧甲基化小米谷糠多糖溶液，逐一加入Tris-Hcl 缓冲溶液（pH8.2）、吡咯酸溶液，测量325 nm 处反应体系的吸光度[20]。
1.4 数据处理
试验均进行3 次重复，采用Design-Expert 10.0.7进行数据分析，采用Origin Pro 9.1 软件作图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
单因素试验结果如图1~图4 所示。
图1 提取温度对小米谷糠多糖得率影响
Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide from millet bran
图2 提取时间对小米谷糠多糖得率影响
Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide from millet bran
图3 料液比对小米谷糠多糖得率影响
Fig.3 Effect of material-liquid ratio on yield of polysaccharide from millet bran
图4 超声时间对小米谷糠多糖得率影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide from millet bran
由图1 可知，随提取温度的不断上升，小米谷糠在浸提液中溶解度升高，多糖得率随之增加，在95 ℃时多糖得率达到最高（7.94%）。当提取温度高于95 ℃时，淀粉糊化加快，固形物含量增加，不利于多糖浸提到体系中，从而得率下降[21]。因此，选择提取温度为90、95、100 ℃进行后续试验。
由图2 可知，在提取时间90~180 min 时，随提取时间延长，细胞膜吸水溶胀破裂，多糖溶出效率增加。在180 min 时，小米谷糠多糖得率达到最高（8.05%）；但提取时间超过180 min 后，多糖得率呈下降的趋势，可能是多糖长时间处于高温中会发生不同程度的水解[22]。因此，选择提取时间为150、180、210 min 进行后续试验。
由图3 可知，在料液比1∶10~1∶20（g/mL）时，小米谷糠粉末与浸提液接触面积逐渐增大，多糖得率也逐渐提高。当溶剂添加量大于1∶20（g/mL）时，浸提体系中多糖的浓度降低，从而导致溶出效率减缓，进而增加后续提取的难度和成本[23]。因此，选择料液比为1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）进行后续试验。
由图4 可知，当超声时间小于30 min 时，随超声时间延长，细胞破碎更充分，进而介质交换能力增强，多糖得率也随之增加，超声时间超过30 min 时，长时间的超声处理将对多糖部分官能团的结构组织造成损坏，从而导致多糖得率明显下降。因此，选择超声时间为20、30、40 min 进行后续试验。
2.2 响应面试验结果
响应面试验设计结果见表3，显著性和方差分析见表4。
表3 Box-Benhnken 试验设计与结果
Table 3 Box-Benhnken test design and results
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A 0 1 0 1 0 0-1 0 1 0 0 0-1 0 0-1 0 0 0 1 1 0 0-1 0-1 1-1 0 B 0 0 0 0-1-1 0-1-1 1 0 1-1 1 0 0 0-1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 C 1 1 1 0 0-1 1 0 0 0 0 1 0 0 0-1-1 1-1-1 0 0-1 0 0 0 0 0 0 D 1 0-1-1-1 0 0 1 0 1 0 0 0-1 0 0 1 0 0 0 0 0-1 0 0 1 1-1 0小米谷糠多糖得率/%7.43 7.62 6.70 7.26 6.21 5.64 5.81 6.62 5.56 6.93 7.99 7.03 5.84 6.98 8.07 5.82 6.02 6.32 5.88 5.49 6.98 8.24 6.73 5.76 8.31 7.65 6.94 5.89 8.17
表4 回归方差分析表
Table 4 Analysis of variance results
注：*表示影响显著，P<0.05；**表示影响极显著，P<0.01。
项模型A 提取时间B 提取温度C 料液比D 超声时间AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项净误差总和平方和22.13 0.79 0.95 2.37 0.28 0.56 1.14 1.08 0.055 0.053 0.52 6.02 7.46 6.23 0.89 0.68 0.62 0.066 22.81自由度14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28均方1.58 0.79 0.95 2.37 0.28 0.56 1.14 1.08 0.055 0.053 0.52 6.02 7.46 6.23 0.89 0.049 0.062 0.016 F 值32.34 16.17 19.36 48.44 5.65 11.51 22.43 22.13 1.13 1.08 10.61 123.18 152.56 127.37 18.26 3.75 P 值<0.000 1 0.001 3 0.000 6<0.000 1 0.032 3 0.004 4 0.000 3 0.000 3 0.305 8 0.315 8 0.005 7<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.000 8 0.107 1显著性*************************
由小米谷糠多糖的得率与影响因素的各项数据得到回归方程：R=8.16+0.26A+0.28B+0.44C+0.15D+0.38AB+0.54AC-0.52AD+0.12BC-0.12BD+0.36CD-0.96A2-1.070B2-0.98C2-0.37D2。
由表4 可知，该模型的F 值较高、P 值小，说明差异极显著（F=32.34，P<0.000 1），失拟项P 为0.107 1>0.05 不显著。决定系数R2=0.970 0，R2Adj=0.940 0，表明模型与实际试验结果充分拟合，可以很好地反映各因素对小米谷糠多糖得率的影响，具有明显的统计学意义[24]。
图5~图10 为该模型的三维响应面图。
图5 提取时间和提取温度的交互作用
Fig.5 Interaction of extraction time and extraction temperature
图6 提取时间和料液比的交互作用
Fig.6 Interaction of extraction time and material-liquid ratio
图7 提取时间和超声时间的交互作用
Fig.7 Interaction of extraction time and ultrasonic time
图8 提取温度和料液比的交互作用
Fig.8 Interaction of extraction temperature and material-liquid ratio
图9 提取温度和超声时间的交互作用
Fig.9 Interaction of extraction temperature and ultrasonic time
图10 料液比和超声时间的交互作用
Fig.10 Interaction of material-liquid ratio and ultrasonic time
由图5~图10 可知，两因素之间的三维图曲线呈抛物线变化趋势，弯曲程度较大，等高线图为椭圆形状，交互作用显著，说明小米谷糠多糖得率与4 个因素之间有交叉作用影响[25]，在两因素水平范围内小米谷糠多糖的得率存在最大值。其中提取时间和料液比的交互作用对多糖得率影响最大，这与表4 结果一致。
最优提取条件和实际测得值如表5 所示。
表5 验证试验结果
Table 5 Experiment result verification
条件理论实际提取时间/min 186.217 186提取温度/℃95.875 96料液比/（g/mL）1∶21.647 1∶22超声时间/min 31.921 32多糖得率/%8.295 8.21
由表5 可知，小米谷糠多糖实际得率为8.21%，十分接近理论条件下的多糖得率8.295%，证明该模型可以可靠预测小米谷糠多糖得率。
2.3 多糖中总糖含量结果分析
葡萄糖标准曲线如图11 所示。
图11 葡萄糖标准曲线
Fig.11 Standard curve of glucose
由图11 可知，线性回归方程为y=0.360 9x+0.095 6。R2 为0.993，线性关系良好。小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖总糖含量为78.32%、80.57%，羧甲基化修饰后的小米谷糠多糖总糖含量增加。
2.4 红外光谱分析结果
由于羧甲基在红外光谱中具有明显的吸收特征峰，因此，红外光谱常被用来确定羧甲基是否被成功地引入到多糖链中[26]。小米谷糠多糖红外光谱分析结果如图12 所示。
图12 小米谷糠多糖红外光谱
Fig.12 Infrared spectrum of millet bran polysaccharide
由图12 可知，小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖分别在3 390、3 328 cm-1 处存在O—H 伸缩振动的吸收峰，在2 930、2 921 cm-1 附近的信号是C—H 拉伸振动，这是多糖的特征吸收峰。1 024 cm-1 处是醇羟基的角振动，表明多糖化合物中存在糖醛酸。小米谷糠多糖羧甲基化修饰后在1 596 cm-1 和1 322 cm-1 处产生了新的吸收峰。1 596 cm-1 是羧甲基中
的拉伸振动，在1 418、1 322 cm-1 左右的两个条带分别进行了不对称和对称的COO—拉伸振动，是羧甲基的特征吸收峰[27]；在990 cm-1 处为羧甲基化小米谷糠多糖分子中C—O—C 对称伸缩振动，是羧甲基化多糖羧甲基特征峰的振动加强[28]。由此说明，小米谷糠多糖羧甲基化修饰成功。
2.5 加工特性分析
小米谷糠多糖加工特性结果如表6 所示。
表6 小米谷糠多糖加工特性分析
Table 6 Processing characteristics of millet bran polysaccharide
多糖小米谷糠多糖羧甲基化小米谷糠多糖持水性/（g/g）1.78±0.12 3.13±0.27持油性/（g/g）3.43±0.17 5.64±0.36乳化性/%10.58±0.51 22.33±0.26乳化稳定性/%56.49±1.12 57.38±2.53起泡性/%53.75±3.43 50.87±2.94泡沫稳定性/%39.32±1.24 41.93±2.55
由表6 可知，小米谷糠多糖羧甲基化修饰前后都具有相应的持水性、持油性、乳化性和起泡性，且具有维持乳液稳定、泡沫稳定的能力。羧甲基化修饰后，多糖的分子量变大，结构紧密增强对水和油的束缚能力，从而增强多糖的持水性和持油性；分子向油水界面移动更加快速，增强亲水性，从而增强多糖的乳化性[29]。本试验结果说明羧甲基化修饰能提高小米谷糠多糖的加工特性。
2.6 DPPH·清除能力结果分析
小米谷糠多糖DPPH·清除能力如图13 所示。
图13 小米谷糠多糖DPPH·清除能力
Fig.13 DPPH·scavenging ability of millet bran polysaccharide
由图13 可知，小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖在0~5.0 mg/mL 的浓度范围内均表现出浓度依赖性。在质量浓度5.0 mg/mL 时，羧甲基化小米谷糠多糖最大清除率为78.21%，较修饰前提高了12.32%。多糖中存在大量的羟基，其可在氢原子和氮原子之间提供孤对电子配对，形成DPPH—H，羧甲基修饰后，多糖中氢供体的官能团数量增加，所以对DPPH 自由基的清除作用更加明显[30]。结果表明，羧甲基化修饰能增强小米谷糠多糖对DPPH·的清除能力。
2.7 ·OH 清除能力结果分析
小米谷糠多糖·OH 清除能力如图14 所示。
图14 小米谷糠多糖·OH 清除能力
Fig.14 ·OH scavenging capacity of millet bran polysaccharide
由图14 可知，小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖对·OH 清除能力在0~5.0 mg/mL 浓度范围内随浓度的增大而增强，在浓度达到5.0 mg/mL 时，·OH 清除率最大分别为47.18%、64.27%。羧甲基化修饰后小米谷糠多糖的·OH 清除能力明显提高，相比修饰前提高了17.09%。多糖还原基团中的还原氢能够与·OH 结合，从而达到清除·OH 作用。结果表明，羧甲基化修饰能增强小米谷糠多糖对·OH 的清除能力。
2.8 O2-·清除能力结果分析
小米谷糠多糖O2-·清除能力如图15 所示。
图15 小米谷糠多糖O2-·清除能力
Fig.15 O2-·scavenging ability of millet bran polysaccharide
由图15 可知，在0~5.0 mg/mL 范围内，多糖浓度与O2-·清除率呈正相关，当浓度达到5.0 mg/mL 时，小米谷糠多糖羧甲基化修饰前后的最大清除率分别为60.92%、70.27%。羧甲基化小米谷糠多糖O2-·清除能力明显优于小米谷糠多糖，清除率提高了9.35%。由于多糖结构含有醛基、羟基等亲电基团，可以释放—OH以稳定氢离子，从而稳定超氧阴离子自由基达到清除作用。结果表明，羧甲基化修饰能增强小米谷糠多糖对O2-·的清除能力。
3 结论
通过响应面优化超声辅助酶法提取小米谷糠多糖，得到最优提取工艺为超声时间32 min、提取温度96 ℃、提取时间186 min、料液比1∶22（g/mL），多糖得率8.21%接近预测值。采用氯乙酸法对小米谷糠多糖进行羧甲基化修饰，得到羧甲基化小米谷糠多糖。红外光谱结果显示COO—已成功引入，羧甲基化修饰成功。对羧甲基化修饰前后的多糖进一步作功能特性分析，结果表明，小米谷糠多糖、羧甲基化小米谷糠多糖都具有良好的持水性、持油性、起泡性和乳化性，且具有维持泡沫稳定、乳液稳定的能力，羧甲基化修饰后多糖的乳化性明显增强。通过对羧甲基修饰前后的小米谷糠多糖抗氧化活性进行评定，结果表明相同质量浓度下羧甲基化修饰后的小米谷糠多糖抗氧化活性更强，对DPPH·、·OH 和O2-·清除率分别达到78.21%、64.27% 和70.27%，具有良好的抗氧化活性。本试验优化了小米谷糠多糖的提取工艺，通过羧甲基化修饰提高了多糖的加工特性和抗氧化活性，为促进小米谷糠多糖的应用提供了新的理论见解和依据。
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