牛乳的营养价值丰富，具有蛋白质、脂肪、乳糖等多种生物活性物质[1-2]。近年来，随着人们生活品质的提升，国人对牛乳质量的要求也在不断提高。2018 年，国家奶业科技创新联盟正式公布了《中国优质乳工程技术规范》，这标志着中国的液态奶将进入巴氏杀菌乳的时代。巴氏杀菌是一种热处理强度较低的杀菌方法。这种杀菌方式对牛乳原有的营养物质破坏较小，可以更多地保留牛乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白及乳铁蛋白等活性物质，并能丰富巴氏杀菌乳的风味和口感[3]。同时，低加热强度的巴氏杀菌减弱了牛乳中的美拉德反应，产生较低含量的糠氨酸及其他美拉德反应产物，进一步提高牛奶的品质。所以巴氏杀菌乳因其新鲜、营养、安全等特点广受消费者的欢迎[4]。
巴氏杀菌乳虽然有着广阔的市场前景，但也因热处理强度较低导致货架期较短、产品变质较快等现象[5]。巴氏杀菌乳属于低温乳制品，需要保证全程冷链运输，致使巴氏杀菌乳不能远距离销售。上述因素制约了巴氏杀菌乳的品质，亟待解决或改善[6]。研究表明原料奶的品质与巴氏杀菌乳的质量密切相关。而原料奶品质主要受奶牛自身和外界环境的影响，其中包括季节、饲料、泌乳期等的外界因素又居首要地位。随着季节的更替，奶牛所处的环境温度发生改变[7]。夏季高温环境会增加奶牛皮表的散热并使得消化道内血液减少，影响食物的消化速度，从而导致奶牛出现消化道充盈与食欲下降的现象，最终表现为牛奶营养成分的降低[8]。不同季节饲料的结构也有一定的变化，如夏秋季节含有天然牧草的青绿饲料供应较多，影响了牛奶中的脂肪和蛋白质含量。因此根据季节对环境和饲料进行适当调整可以提高原料奶的品质[9]。本试验对不同季节不同来源的原料奶指标进行分析，探讨其变化规律，旨在为筛选优质巴氏杀菌乳的原料奶提供依据与指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料奶：A、B、C、D、E、F 奶牛养殖场提供；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（纯度均不小于99.0%）：天津市光复科技发展有限公司；氯化钠、三氟乙酸（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸（36%~38%，优级纯）：天津市化学试剂供销公司；乙腈（色谱纯）：德国默克股份有限公司。
磷酸盐缓冲液Ⅰ：磷酸氢二钠23.85 g，磷酸二氢钠4.99 g，加适量水溶解后用氢氧化钠溶液调节pH 值至7.50，定容至1 L。
磷酸盐缓冲液Ⅱ：磷酸氢二钠5.96 g，磷酸二氢钠0.96 g，氯化钠5.84 g，加适量水溶解后用氢氧化钠溶液调节pH 值至7.50，定容至1 L。
磷酸盐缓冲液Ⅲ：磷酸氢二钠5.96 g，磷酸二氢钠2.50 g，氯化钠119.30 g，加适量水溶解后用氢氧化钠溶液调节pH 值至7.50，定容至1 L。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Agilent 1260 型）：美国安捷伦公司；XBridge Protein BEH C4 色谱柱（4.6 mm×250 mm，3.5 µm）：美国沃特世公司；乳品检测仪（FOSS FT120型）、体细胞细菌一体机（Bacsomitic 型）：丹麦福斯分析仪器公司；冰点仪（Cryo Touch 1 型）：意大利ASTORI公司；PH 计（PHS-25 型）：上海仪电科学仪器股份有限公司；电子天平（CPAD225D 型）：德国赛多利斯公司；高速台式冷冻离心机（H1750R 型）：湖南湘仪离心机仪器有限公司；肝素亲和柱（HiTrap Heparin HP 型）：美国思拓凡公司。
1.3 方法
1.3.1 乳成分检测
采用乳品检测仪对6 种原料奶脂肪和蛋白质的含量进行测定。
1.3.2 微生物检测
用体细胞细菌一体机测定原料奶中的体细胞数和菌落总数。
1.3.3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的检测
称取乳样5 g，置于容量瓶，加水定容至25.0 mL 并混匀，加入0.1 mol/L 乙酸溶液调节pH 值至4.6，混匀静置1 h。于12 000 r/min、4 ℃下离心15 min 后，吸取1 mL上清液用超纯水稀释5 倍，过0.22µm 滤膜后待测。高效液相色谱的条件和程序参考陈美霞[10]的方法。
1.3.4 乳铁蛋白的检测
称取乳样5 g，加入磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至25 mL并混匀，于12 000 r/min、4 ℃下离心15 min 后，吸取15 mL 上清液用玻璃纤维滤纸过滤，用于后续的纯化。将肝素亲和柱用磷酸盐缓冲液Ⅱ以1 mL/min 的流速活化10 min 待用。上样量10 mL，上样后用磷酸盐缓冲液Ⅱ（1 mL/min）冲洗10 min。随后用磷酸盐缓冲液Ⅲ（1 mL/min）洗脱4.5 min，收集洗脱液后用磷酸盐缓冲液Ⅲ定容至5 mL，过0.22µm 滤膜后待测。高效液相色谱的条件和程序参考李梦凡等[11]的方法。
1.3.5 原料奶的冰点检测
用冰点仪分析原料奶的冰点。
1.4 数据分析
所有试验数据均进行3 次重复测定，采用Microsoft Excel 2019 和SPSS 26 进行数据分析并利用Origin 2021 进行绘图处理。
2 结果与分析
2.1 乳成分季节变化趋势
不同季节不同来源原料奶的脂肪与蛋白质含量如图1 所示。
图1 不同季节不同来源原料奶的脂肪与蛋白质含量
Fig.1 Fat and protein content of in raw milk from different sources in different seasons
由图1 可知，原料奶的脂肪和蛋白质含量随季节变化趋势一致，均呈现先下降后上升的趋势，两种成分含量整体上在夏季达到最低，冬季含量最高，这与王新妍[12]和杨大明等[13]的研究结果一致。奶牛是一种在自然界中对外界环境温度敏感的动物。由于炎热高温会使奶牛自身的散热能力加强，营养物质的消化吸收能力受到影响，导致原料奶的脂肪含量下降。同时，夏季的高温也会影响奶牛的代谢和营养需求。夏季主要以含水量高的青绿饲料为主，这种饲料相比于冬季的干草粗饲料脂肪含量更低、能量较少，造成夏季原料奶脂肪含量最低[14]。炎热湿润的夏季会导致奶牛出现热应激及食欲下降的情况。奶牛的热应激会使奶牛出现体温升高、呼吸频率增加、产奶量和乳品质下降的现象[15]。此外，冬季的干草粗饲料具有较多的粗纤维与矿物质，可以维持奶牛的机体需求，使蛋白质含量维持在较高的水平。所以，原料奶脂肪与蛋白质含量都在一年内呈现先降低后升高的趋势并在夏季为最低。由图1 可知，不同来源原料乳脂肪含量为7.0%~10.1%，这说明不同来源的原料乳脂肪含量受季节更替的影响相近且均满足特优级生乳脂肪含量3.40 g/100 g 的要求。不同来源原料奶的蛋白质含量虽然有明显差异，但整体波动较小，也均满足特优级生乳蛋白质含量3.10 g/100 g 的要求。
2.2 微生物情况分析
2.2.1 体细胞数原料奶的体细胞数是反映奶牛健康与原料奶品质的重要指标，也直接反映奶牛乳腺的感染程度以及奶牛养殖场的管理水平[16]。如果原料奶的体细胞数过高，说明奶牛患有乳房炎症等疾病的发病率较高，导致原料奶损失量的增加及品质的下降[17]。有研究显示，在体细胞数高于2×105 个/mL 的原料奶中，体细胞数每升高1×105 个/mL 就会造成产奶量下降2.5%。过高的体细胞数也会使原料奶中乳糖的含量下降并提高钠元素的含量。目前《中国优质乳工程技术规范》要求特优级生乳的体细胞数不得高于3×105 个/mL。不同季节奶牛养殖场原料奶的体细胞数如表1 所示。
表1 不同季节不同来源原料奶的体细胞数
Table 1 Somatic cell counts of raw milk from different sources in different seasons
注：不同小写字母表示同行数据有显著差异，P<0.05；不同大写字母表示同列数据有显著差异，P<0.05。
季节春季夏季秋季冬季体细胞数/（×104 个/mL）A 23.08±2.64Aa 24.27±3.79Aa 24.89±2.74Aa 21.92±2.67Ba B 16.52±2.33Cc 21.73±2.37Ab 21.28±2.47Ab 18.94±2.50Bb C 23.59±2.69ABa 25.54±2.49Aa 22.56±2.51ABa 21.36±2.38Ba D 20.70±2.32ABb 22.10±2.80Ab 18.85±2.89Bc 18.95±2.65Bb E 18.05±2.27Abc 19.40±2.59Ac 19.51±2.53Ac 17.89±2.58Ab F 14.48±2.40Bd 17.37±2.91Ad 18.20±2.68Ac 13.65±1.39Bc
由表1 可知，不同来源原料奶的体细胞数在夏季整体偏高，体细胞数最低的F 组也达到1.74×105 个/mL。这主要是由于原料奶产地夏秋两季常受到热带气旋影响，带来积水的同时可能会污染下水道[18]。如果将被污染的水用于奶牛的日常饲喂，很可能会引起奶牛的疾病，导致体细胞数大量增加。此外，若夏季温度高、湿度大，则可能会通过病原微生物的增长间接影响原料奶的体细胞数。虽然6 个原料奶样品都符合《中国优质乳工程技术规范》的要求，但体细胞数与酸度呈正相关，体细胞数越高，酸度越高，会产生不良风味[19]。原料奶的体细胞数升高意味着微生物含量的增加，既会影响乳的加工工艺，又会降低乳制品的安全性[20]。所以尽可能选择体细胞数较低的原料奶用于优质巴氏杀菌乳的生产。
2.2.2 菌落总数
原料奶的菌落总数是反映原料奶质量及卫生情况的重要指标，包括致病菌及有益菌[21]。如果菌落总数超标，致病菌超标的概率也会增加，所以原料奶菌落总数也是一个重要的微生物指标[22]，《中国优质乳工程技术规范》要求特优级生乳的菌落总数不得高于5×104 CFU/mL。不同季节不同来源原料奶的菌落总数结果见表2。
表2 不同季节不同来源原料奶的菌落总数
Table 2 Somatic cell counts of raw milk from different sources in different seasons
注：同行不同小写字母表示差异显著，P<0.05；同列不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
季节春季夏季秋季冬季菌落总数/（104 CFU/mL）A 2.84±0.21Ba 3.33±0.40Ab 2.46±0.17Cc 2.74±0.21Bc B 2.35±0.16Bb 3.89±0.41Aa 3.71±0.30Aa 4.01±0.38Aa C 2.50±0.33Bb 3.38±0.24Ab 3.31±0.23Ab 2.54±0.25Bd D 3.08±0.31Ba 3.86±0.35Aa 3.46±0.28Ab 2.96±0.27Bb E 2.40±0.27Cb 3.63±0.53Aab 3.52±0.38Ab 3.07±0.35Bb F 1.33±0.06Cc 2.87±0.25Ac 2.27±0.23Bc 2.07±0.11Be
由表2 可知，不同季节原料奶菌落总数的变化与体细胞数的变化情况相近，除B 组外，其他组原料奶的菌落总数均在夏季达到最高值，冬春两季的菌落总数相对较低。奶牛最适宜生活及产奶的环境为15~22 ℃，夏季持续性高温高湿的天气是微生物大量增长繁殖的必需条件，从而导致原料奶菌落总数的增加。因此，需要及时对奶牛养殖场进行清理，尽量减慢微生物增长繁殖的速度。由于巴氏杀菌乳杀菌方法的热处理强度较低，不能与超高温灭菌乳一样几乎完全杀灭细菌，就需要原料奶的菌落总数保持在一个相对较低的数量。原料奶的菌落总数越低，巴氏杀菌乳产品的初始菌落总数越低，这样才能更好地保证货架期内巴氏杀菌乳的品质。
2.3 活性物质分析
由于奶牛养殖春冬季和夏秋季的饲料和温度有一定的相似性，所以对活性物质的分析仅集中在这两个季节区间。
2.3.1 α-乳白蛋白与β-乳球蛋白
α-乳白蛋白是牛乳中的一种小分子量（14 kDa）的乳清蛋白，较容易被人体消化吸收。Matsumoto 等[23]研究发现含有25% α-乳白蛋白的乳清蛋白分离物对胃黏膜具有一定的保护作用。同时，α-乳白蛋白也可作为生物活性肽的前体，具有抗血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性的作用[24]。虽然《中国优质乳工程技术规范》中没有对α-乳白蛋白的含量提出要求，但适当保留α-乳白蛋白也会增加巴氏杀菌乳的风味及品质。不同季节不同来源原料奶α-乳白蛋白的含量如图2a 所示。
图2 不同季节不同来源原料奶中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量
Fig.2 Contents of α-lactalbumin and β-lactoglobulin in raw milk from different sources in different seasons
由图2a 可知，6 组原料奶中α-乳白蛋白在冬春两季与夏秋两季有显著性差异。在冬春两季，A 原料奶的α-乳白蛋白含量最高，为（1 389.36±37.81）mg/L，其次是F 原料奶，为（1 349.85±40.26）mg/L。在夏秋两季，A 与F 原料奶的α-乳白蛋白的含量相近，分别为（1 209.77±25.23）mg/L 与（1 210.18±18.73）mg/L，且均高于其他组原料奶。这可能是因为夏秋两季温度较高，活性物质含量降低造成季节间α-乳白蛋白含量的差异。
β-乳球蛋白是一种通过乳腺上皮细胞合成的乳蛋白，是牛乳中主要的乳清蛋白成分之一。由于它具有多个结合位点，对多种维生素及脂肪酸有亲和性，可以与之结合并具有抗氧化功能[25-26]。《中国优质乳工程技术规范》要求巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白含量不得低于2 200 mg/L，所以原料奶β-乳球蛋白的含量也需保持较高的含量。不同季节不同来源原料奶β-乳球蛋白含量如图2b 所示。
由图2b 可知，在全年内，虽然6 组原料奶的β-乳球蛋白都保持较高的含量，但它们受季节影响差异明显，冬春两季和夏秋两季β-乳球蛋白的最高浓度分别为（3 866.72±31.81）mg/L 与（3 643.11±34.31）mg/L。β-乳球蛋白随季节的变化规律可能是由于夏秋两季会经历高温多雨的气候，高温环境会造成奶牛体内酸碱平衡紊乱，打破内环境稳态，造成奶牛生产性能下降，所以原料奶的生物活性物质也会有所降低[27]。
2.3.2 乳铁蛋白
乳铁蛋白是一种球状多功能糖蛋白，广泛存在于各种分泌液中。乳铁蛋白具有广谱抗菌作用，可以抑制微生物的生长[28]。同时，乳铁蛋白还有参与体内铁代谢的功能。Chen 等[29]研究发现将适量的乳铁蛋白加入到婴儿配方奶粉中可以促进肠道对铁的吸收。牛乳铁蛋白类似于人乳铁蛋白，所以更容易被人体消化吸收[30]。《中国优质乳工程技术规范》要求巴氏杀菌乳中乳铁蛋白的含量不得低于25 mg/L，所以应把乳铁蛋白的含量当作优质原料奶筛选指标之一。不同季节不同来源原料奶乳铁蛋白含量如图3 所示。
图3 不同季节不同来源原料奶中乳铁蛋白的含量
Fig.3 Content of lactoferrin in raw milk from different sources in different seasons
由图3 可知，原料奶乳铁蛋白的含量变化与α-乳白蛋白及β-乳球蛋白相似，均在冬春两季达到最高浓度且与夏秋两季存在明显差异。这主要与气候及温度变化相关，温度升高会导致奶牛的热应激程度增加，降低奶牛的食欲，使原料奶的蛋白质及活性物质含量有所降低[8]。全年F 原料乳的乳铁蛋白含量最高，冬春及夏秋分别为（134.00±2.41）mg/L 与（117.54±1.24）mg/L。研究发现虽然巴氏杀菌乳的热处理强度很低，但乳铁蛋白的浓度会随着杀菌温度的提高而大幅降低[31]。所以，在原料奶的筛选中，需尽量选择原始乳铁蛋白浓度较高的原料奶。
3 结论
通过对不同季节不同来源原料奶的指标进行检测和分析，原料奶的营养物质随季节的变化呈现出先降低后升高的规律性波动。原料奶营养成分在冬春季含量最高夏秋季含量最低；但体细胞数及菌落总数呈现相反趋势，在夏秋季达到最高冬春季最低；α-乳白蛋白、β-乳球蛋白及乳铁蛋白等活性物质在冬春两季的含量也相对较高。因此，原料奶的品质受季节的影响变化明显。
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