随着我国肉类食品产量的提高，人们对肉类食品安全的意识不断提高，同时对肉类食品的质量提出更高的要求[1]。肉类食品在加工中易因微生物而腐败[2]。目前，通常使用亚硝酸盐抑制肉中细菌的生长，然而亚硝酸盐使用不当会导致人体组织缺氧中毒，从而形成高铁血红蛋白症，这具备一定的安全隐患，因此人们寻找并开发更安全的物质代替[3]。壳聚糖作为防腐剂，在肉保鲜中具有减缓金属离子氧化及抑菌的效果[1]，其可以抑制羊肉香肠中细菌生长且保持肉品色泽度和肉质感[4]。壳聚糖具备提取容易、生物相容性好和抗菌能力强等优点[5]。因此，壳聚糖在肉类中的应用引起人们极大的关注。壳聚糖目前采取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为供试菌的研究较为丰富[6]，然而关于壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌效果及机制的研究鲜少报道。液化沙雷氏菌属于革兰氏阴性菌，能分解蛋白质引起肉制品腐败[7]。研究表明液化沙雷氏菌能够引起冷冻鸡肉蛋白中的亮氨酸分解而产生异味[8]。此外，液化沙雷氏菌是冷藏真空包装牛肉微生物组中常见的腐败生物[9]，还能引起绵宁火腿腐败[10]。
因此，本文研究壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌效果及机制，通过测定壳聚糖作用前后的液化沙雷氏菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）、细菌生长曲线、细胞壁及细胞膜完整性（电导率、胞外核酸含量、胞外蛋白含量、碱性磷酸酶活性）、细胞酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶）活性及电子显微镜观察液化沙雷氏菌细胞形态的变化，综合分析壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌效果，以期为壳聚糖在肉类食品中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
液化沙雷氏菌为本课题组微生物实验室提供；壳聚糖：郑州拜纳佛生物工程股份有限公司；营养琼脂培养基（nutrient agar medium，NA）、营养肉汤培养基（nutrient broth，NB）：广东环凯微生物科技有限公司；碱性磷酸酶测试盒、超氧化物歧化酶测试盒、过氧化氢酶测试盒、蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所；戊二醛（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LHS-160CL 电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技仪器有限公司；LDZW-40KCS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SHP-250 生化培养箱：广东环凯微生物科技有限公司；DDS-307 电导率仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；760CRT 紫外可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL80-2B 台式离心机：上海安亭科学仪器厂；HITACHI SU8010 扫描电子显微镜：日本Hitachi 株式会社。
1.3 试验方法
1.3.1 样液制备
采用NB 固体培养基于37 ℃培养菌种24 h，传代培养3~4 次[11]，而后将活化后的菌液以1%（体积分数）接种量接入，37 ℃培养12 h，得原菌液。将经过4 ℃、4 000×g 条件下离心10 min 的菌体用无菌磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS）溶液在OD600 nm 调整菌液浓度到107~108 CFU/mL，得菌悬液[12]。将壳聚糖制备成质量浓度为96 mg/mL 的溶液，得抑菌液原液。
1.3.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定
参考汪晓辉等[13]的方法，稍作修改。将壳聚糖溶液稀释成不同浓度（96、48、24、12、6、3、1.5、0.75、0.375 g/kg），然后于每管内加入菌悬液200µL。37 ℃培养24 h，观察浑浊程度，根据以下标准评判：观察管内的菌液清澈无浊，则有抑菌作用；菌液不清澈、有浑浊或沉淀或菌膜或有挂壁，则无抑菌作用。记录有抑菌作用的最低浓度，即为抑菌剂MIC。
1.3.3 细菌生长曲线的绘制
将已制备的菌悬液以1% 接种量分别加入MIC、2 MIC（2 倍MIC）的壳聚糖溶液中，37 ℃培养24 h，每2 h 取样一次，测定OD600 nm，绘制生长曲线，以未添加壳聚糖为对照（CK）组。
1.3.4 细胞壁及细胞膜完整性的测定
参照1.3.3 接种于壳聚糖溶液，37 ℃培养12 h，每2 h 取样一次，于4 000 r/min 离心10 min 后的样品取上清液制备4 组，1 组用电导率仪测定其电导率值；2 组用以测定OD260 nm，即为胞外核酸含量；3 组采用蛋白定量测试盒处理后，测定OD595 nm，即为胞外蛋白含量；4 组采用碱性磷酸酶试剂盒处理后，测定OD520 nm，即为碱性磷酸酶活性。以上均另以未添加壳聚糖作为对照（CK）组。
1.3.5 细胞酶活性的测定
参照1.3.3 接种于壳聚糖溶液，37 ℃培养12 h，每2 h 取样一次，采用超氧化物歧化酶测试盒处理，测定OD550 nm，即为超氧化物歧化酶活性。另取样采用过氧化氢酶试剂盒处理，测定OD405 nm，即为过氧化氢酶活性。以上均以未添加壳聚糖为对照（CK）组。
1.3.6 扫描电子显微镜对细胞形态的观察
于振荡培养24 h 的液化沙雷氏菌液中加入壳聚糖溶液，振荡培养12 h，4 ℃、8 000 r/min 离心5 min。将细胞沉淀置于2.5%戊二醛溶液后以4 ℃固定12 h。用磷酸缓冲盐溶液（0.1 mol/L，pH7.0）漂洗细胞沉淀15 min，反复3 次后再用锇酸溶液（1%）固定1~2 h；反复上述操作洗脱3 次，采用乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%、95%）梯度洗脱样品，然后用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（1∶1，体积比）处理样品30 min，放置过夜后干燥，镀膜，使用扫描电子显微镜观察[14]。
1.4 数据分析与处理
试验均采取3 次平行测定，采用Excel 2021 进行试验数据分析，Origin 2021 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖对液化沙雷氏菌的MIC
最小抑菌浓度（MIC）能够评价物质抑菌能力，MIC 值越小，即壳聚糖抑制微生物生长的能力越好[15]。因此通过壳聚糖对液化沙雷氏菌的菌悬液澄清度变化，判断壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌能力。壳聚糖对液化沙雷氏菌菌悬液澄清度变化见图1，壳聚糖对液化沙雷氏菌的MIC 见表1。
表1 壳聚糖对液化沙雷氏菌的MIC
Table 1 MIC of chitosan against Serratia liquefaciens
注：+表示有菌生长，-表示无菌生长。
抑菌剂浓度/（mg/mL）0 0.375 0.75 1.5 3 6 12 24 48 96壳聚糖+++++-----
图1 壳聚糖对液化沙雷氏菌菌悬液澄清度变化
Fig.1 Changes in clarity of Serratia liquefaciens suspensions influenced by chitosan
由图1 可知，随着壳聚糖的浓度逐渐增加，液化沙雷氏菌的菌悬液逐渐澄清，表明壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌能力呈浓度效应，此外空白对照组、低浓度（0、0.375、0.75、1.5、3.0 mg/mL）的壳聚糖抑制的菌悬液较为混浊，表明液化沙雷氏菌代谢产物在积累。综上，壳聚糖对液化沙雷氏菌MIC 为6 mg/mL。
2.2 壳聚糖对液化沙雷氏菌生长的影响
壳聚糖对液化沙雷氏菌生长的影响见图2。
图2 壳聚糖对液化沙雷氏菌生长的影响
Fig.2 Effect of chitosan on the growth of Serratia liquefaciens
在一定的波长范围内，细菌悬液的浓度与吸光度成正比，吸光度反映不同浓度的壳聚糖溶液对液化沙雷氏菌的作用[16]。由图2 可知，CK 组的液化沙雷氏菌的对数生长期为2~6 h，该阶段细菌生长旺盛。6 h 后细菌生长速度减缓；与CK 组相比，MIC 和2 MIC 组无对数生长期，OD600 nm 值均低于CK 组。因此，经MIC和2 MIC 的壳聚糖溶液处理后，液化沙雷氏菌的生长受到明显抑制。
2.3 壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞壁及细胞膜完整性的影响
壳聚糖通过改善对细菌的渗透性，产生细胞絮凝反应，影响细菌正常的生物活力。此外，壳聚糖能够通过直接吸附于革兰氏阳性菌细胞表层，以阻挡营养物质的运输[17]。因此，探究壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞壁及细胞膜完整性的影响，结果见图3。
图3 壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞壁及细胞膜完整性的影响
Fig.3 Effect of chitosan on the cell wall and cell membrane integrity of Serratia liquefaciens
2.3.1 电导率
细胞膜是细菌的保护屏障，细胞内成分渗漏能够通过电导率的变化反映液化沙雷氏菌的细胞膜通透性的变化[18]。由图3A 可知，不同处理组菌液电导率在0~4 h 增加，4~6 h 下降，而后继续上升。结合生长曲线分析，这可能是因为液化沙雷氏菌在4~6 h 生长较快，吸收胞外电解质如K+、Na +、H +等小分子，因而导致电导率下降；处理组菌液的电导率均高于CK 组，表明MIC 和2 MIC 的壳聚糖溶液处理后的细菌细胞膜的通透性被改变，细胞的电解质泄漏。而CK 组菌液的电导率缓慢增加，这可能是细菌的自然老化和死亡，膜通透性变差。结果表明，MIC 和2 MIC 的壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌效果与壳聚糖的质量浓度成正比。然而王向阳等[19]研究中MIC 的电导率低于CK 组，这与本结果不同，可能是因为菌种的个体差异导致。
2.3.2 胞外核酸
细胞膜遭到较大破坏时，胞内大分子物质如核酸会从细胞内释放到细胞外，而核酸在波长260 nm 处有很强的紫外吸收，因此测定OD260 nm 能够判断菌体细胞膜破坏程度[20]。由图3B 可知，3 组菌液的OD260 nm 呈现缓慢增加趋势，MIC 组菌液的OD260 nm 高于CK 组，2 MIC 组菌液OD260 nm 高于MIC 组。此核酸物质释放趋势与王向阳等[19]研究中的不同浓度壳聚糖处理大肠杆菌OD260 nm 总体呈现上升趋势的结果类似。可见，壳聚糖对液化沙雷氏菌的细胞膜有破坏，导致其胞外核酸外泄于细胞外，且破坏强度与壳聚糖质量浓度呈正相关。
2.3.3 胞外蛋白含量
通过测定蛋白质的含量可以评判细胞结构的完整性[20]。由图3C 可知，3 组菌液的蛋白泄露趋势虽有一定程度的波动但最终趋于平稳，整体呈现上升趋势。相比较CK 组，MIC 组和2 MIC 组的胞外蛋白含量高于CK 组的胞外蛋白含量，且2 MIC 组高于MIC 组的胞外蛋白含量。此蛋白质释放趋势与Azi 等[21]的研究结果类似。表明细胞受到壳聚糖刺激后，细胞膜被破坏，胞内的蛋白泄漏，且高浓度的壳聚糖破坏效果更大。
2.3.4 碱性磷酸酶活性
碱性磷酸酶是一种在细胞内发现的酶，当细胞壁受损时，它会通过细胞壁泄漏到外部环境[22]。碱性磷酸酶活性可以反映细菌细胞壁的完整性。由图3D 可知，3 组菌液的碱性磷酸酶活性的趋势均有一定的波动，0~4 h 上升，4 h 后CK 组与MIC 组碱性磷酸酶活性略微降低后接近平稳，而2 MIC 组在4~8 h 持续上升，8 h 后降低，CK 组的碱性磷酸酶活性始终最低，其次为MIC 组，最后为2 MIC 组。这可能是壳聚糖所带的正电荷与液化沙雷氏菌所带的负电荷产生分子相互作用，从而破坏了细菌细胞膜的结构和完整性，导致碱性磷酸酶外泄。
通过综合电导率、核酸和蛋白质的渗漏、碱性磷酸酶活性，能够监测细胞壁和细胞膜的完整性。经过壳聚糖处理后的碱性磷酸酶、核酸、蛋白质及反映细胞膜通透性的电导率的趋势上升且高于CK 组，均表明了MIC 和2 MIC 的壳聚糖加剧了细胞壁及细胞膜的损伤，且2 MIC 的壳聚糖损伤力度更大，从而使液化沙雷氏菌生长受到抑制，加速其死亡。
2.4 壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞酶活性的影响
壳聚糖能够激发或过度表达某些细菌本身的几丁质蛋白酶活性，致使其降解微生物的自身细胞壁几丁质，从而达到抑菌作用[23]。测定壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞酶活性从而判定壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞酶活性的影响程度。壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞酶活性的影响见图4。
图4 壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞酶的影响
Fig.4 Effect of chitosan on the cell enzyme of Serratia liquefaciens
2.4.1 过氧化氢酶
细胞正常生理代谢时，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和消除处于动态平衡状态，不会对细胞本身造成损害[24]。当细胞膜被损伤时，产生ROS，其可以通过细胞成分的氧化分解引起细胞损伤[25]。
ROS 产生和清除的动态平衡主要由超氧化物歧化酶和过氧化氢酶维持[19]。过氧化氢酶的生理功能是将H2O2 分解为H2O 与O2，即清除过量活性氧基团，保护机体内的细胞不被过氧化所伤，维持正常的新陈代谢[26]。因此，根据过氧化氢酶的活性评判菌体的活性。由图4A 可知，CK 组的过氧化氢酶活性始终高MIC 组和2 MIC 组，过氧化氢酶从0 h 开始逐渐上升，在6 h 达到最大值，8 h 后有波动，但相比6 h，依旧呈现下降趋势。而经过MIC 与2 MIC 处理的菌液过氧化氢酶活性总体呈现下降趋势，在0~2 h 时，降低较快，而后在2~12 h，缓慢降低至平缓，这表明壳聚糖对菌体处理作用明显，过氧化氢酶活性降低，清除过量活性氧基团的能力受损导致菌体受到氧化损伤。此过氧化氢酶活性的变化趋势与蓝蔚青等[27]的研究结果一致。
2.4.2 超氧化物歧化酶
细胞内的超氧化物歧化酶活性降低，细菌易受到损伤，影响菌体氧化应激系统的动态平衡，从而达到抑菌效果[28]。由图4B 可知，CK 组的超氧化物歧化酶活性总体趋势均高于MIC 组和2 MIC 组，在0~6 h，CK组的超氧化物歧化酶活性明显增加，6 h 后增长趋于稳定。而MIC 组和2 MIC 组超氧化物歧化酶活性总体趋势在逐渐降低至平稳。经过壳聚糖处理后，降低了液化沙雷氏菌的超氧化物歧化酶活性。这可能是液化沙雷氏菌的正常氧化应激系统平衡受到壳聚糖的刺激后被影响，从而导致液化沙雷氏菌被损伤。超氧化物歧化酶活性降低的结果与Hu 等[29]的研究结果类似。细胞酶活性（过氧化氢酶活性及超氧化物歧化酶活性）的结果表明，壳聚糖能够通过损伤细胞膜而影响液化沙雷氏菌的正常生理代谢，达到抑制其生长的效果。
2.5 壳聚糖对液化沙雷氏菌细胞形态变化的影响
利用扫描电子显微镜可以观察细菌细胞形态变化[27]。 壳聚糖对液化沙雷氏菌处理前后扫描电子显微镜图见图5。
图5 壳聚糖对液化沙雷氏菌处理前后扫描电子显微镜图
Fig.5 Scanning electron microscope images of Serratia liquefaciens before and after chitosan treatment
由图5 可知，CK 组菌体表面光滑、轮廓均匀。经过MIC 处理后，细胞膜表面变糙，细胞皱缩。2 MIC 处理后的细菌形态变形以及细胞表面可见泄漏的细胞内容物，表明壳聚糖能够破坏细胞壁和细胞膜，导致内部物质外泄，菌体死亡。此结果符合上述指标的结果，此结果与Hu 等[29]观察被破坏的液化沙雷氏菌的细胞形态的结果一致。壳聚糖能够通过破坏细菌细胞膜的完整性并导致细胞内容物泄漏来抑制液化沙雷氏菌的生长。
3 讨论与结论
壳聚糖的抑菌机制包括壳聚糖分子中的-NH3+可吸附到带负电荷的细菌上，从而破坏细胞膜通透性；壳聚糖可影响细菌DNA 复制和蛋白质合成从而破坏其正常生理功能；壳聚糖中的氨基和羟基可以螯合金属离子而使菌体生长繁殖受到抑制。目前国内外学者对壳聚糖抑菌机制的研究存在许多不同的观点，很大程度上限制了壳聚糖的应用[30]。壳聚糖对液化沙雷氏菌的MIC 为6 mg/mL，经MIC 和2 MIC 壳聚糖处理后生长曲线反映生长被抑制，细胞壁及细胞膜完整性（电导率、胞外核酸含量、胞外蛋白含量、碱性磷酸酶活性上升且比CK 组高）被破坏，膜通透性变差，细胞内容物外泄。细胞酶活性（过氧化氢酶活性和超氧化物歧化酶活性）下降，菌体氧化应激系统的动态平衡被破坏，菌体受损，生长受到抑制。扫描电子显微镜观察菌体细胞皱缩，破裂，胞内物质外泄。综上，初步证实壳聚糖能够通过破坏液化沙雷氏菌细胞结构从而抑制其生长，但基于目前的壳聚糖抑菌机制研究的观点不一致使得壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌机制显得不够明确，因此针对壳聚糖对液化沙雷氏菌的抑菌机制仍需更深入、更全面、更系统的研究，以便更进一步的推动壳聚糖在肉类工业应用的发展。
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