益生菌是指服用足够量时能对人体产生有益作用的一类活的微生物[1]。益生菌具有调节肠道菌群、改善肠道环境和抑制癌症因子的作用[2]。“益生元”一词最早由吉布森和罗伯弗里德创造，它被定义为“一种不可消化的食物成分，可以选择性地刺激结肠中一种或有限数量细菌的生长和活动，从而改善宿主健康[3]”。常见的益生元主要有低聚果糖、菊粉和低聚半乳糖等。益生菌和益生元的组合被称为合生元，具有增强内源性和外源性益生菌活性的双重作用，即它可以发挥益生菌的生理活性，也可以快速增加该菌株的数量，使其作用效果更加显著和持久[4]。作为新一代的微生态调节制剂，合生元使益生菌和益生元协同作用，共同对抗疾病，维护机体的微生态平衡[5]。
益生菌的功效对于人体健康有十分重要的作用，但其在加工、运输和储存的过程中会受到外界因素的影响，导致其活性降低或死亡。为了提高益生菌活性和存活率，已经有很多方法用于保护益生菌，避免其受到不利条件的影响。研究表明，微胶囊技术是保护菌体活力的有效的方法之一。微胶囊包埋为益生菌提供了抵御环境压力的物理屏障，最大限度地减少了益生菌在加工、储存和消化过程中的活性损失[6]，确保其在肠道中的靶向递送[7]。
目前，已有许多材料和方法用于益生菌的包埋保护，并取得了一定的进展，但是气体作为壁材一直被忽视。气体外壳可以完全阻隔芯材与外界环境的联系，并能通过触发实现快速释放[8]。基于此，以气体为壁材包埋益生菌，减缓益生菌的生长速度，提高其保存活性。反气泡利用气膜隔绝内外液体环境，是与气泡结构完全相反的一种物理现象[9]，反气泡中的气膜层不仅可以阻隔外界环境对内部物质的影响，还能快速触发释放，是一种益生菌或活性物质靶向递送的良好载体。研究人员利用反气泡包埋干酪乳杆菌，发现包埋后的干酪乳杆菌在低pH 值环境中的存活率比未包埋菌株高10~30 倍[10]。这一结果证实了气体壳层对益生菌的保护作用，表明可以利用反气泡提高益生菌活性。
本文通过益生元分数计算筛选低聚糖，并利用低聚糖与活性物质的复配探究益生元协同作用对发酵乳杆菌CECT 5716 活性的影响；同时探究质构分析、菌数测定等指标分析含有益生元反气泡微胶囊对冻干酸奶块品质和益生菌活性的影响，旨在为后续益生元在益生菌微胶囊的进一步应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大肠杆菌ATCC 25645：中国微生物菌种保藏中心；发酵乳杆菌CECT 5716：上海百施生物科技有限公司；低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、短链菊粉（聚合度10~12）、长链菊粉（聚合度32~34）、乳糖醇、阿拉伯半乳聚糖：上海源叶生物技术有限公司；疏水性气相二氧化硅（生化试剂）、麦芽糊精（食品级）：上海麦克林生化科技股份有限公司；脱脂乳粉（食品级）：恒天然合作社集团有限公司；酸奶、全脂灭菌乳：内蒙古蒙牛乳业股份有限公司；茶多酚（食品级）：安徽红星药业有限公司；没食子酸、槲皮素、大豆多肽（均为食品级）：天津希恩思生化科技有限公司；麦芽糖浆（食品级）：山东鑫旺达生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
真空冷冻干燥机（LGJ-10N/B）：北京亚星仪科科技发展有限公司；全自动凯氏定氮仪（K9840）：山东海能科学仪器有限公司；恒温磁力搅拌器（JR-2）：天津市欧诺仪器仪表有限公司；激光粒度分析仪（Bettersize2600）：丹东百特仪器有限公司；pH 计（FE20Mettler）：上海MERRLER TOLEDO 集团；全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C）：芬兰OY Growth Curves 公司；气相色谱质谱仪（GCMS-QP2010）：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基配制
MRS 液体培养基：将10 g 牛肉膏、10 g 蛋白胨、1 mL吐温80、4 g 酵母浸粉、20 g 葡萄糖、2 g 柠檬酸三铵、5 g醋酸钠、0.5 g 半胱氨酸、0.2 g 硫酸镁、0.05 g 硫酸锰、1.52 g 磷酸氢二钾溶于1 000 mL 蒸馏水中，调节pH值为6.2~6.4，于121 ℃高压灭菌15 min。固体培养基加入15 g 琼脂，其他与液体培养基一致。
改良MRS 液体培养基：将MRS 液体培养基中的葡萄糖分别用8 种低聚糖代替。同时蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉的添加量减半，其余同MRS 液体培养基一致。
1.3.2 菌株活化
取发酵乳杆菌CECT 5716 冻干粉适量，将其接种在5 mL 的MRS 液体培养基，于37 ℃下恒温培养16 h，然后在MRS 固体培养基上进行三区划线，于37 ℃的环境中倒置培养48 h，挑取单菌落接种至MRS 液体培养基，37 ℃培养16~18 h 后以2% 的接种量进行传代培养，收集菌液，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.3 活菌计数
取0.5 mL 菌液用生理盐水进行梯度稀释，振荡摇匀后吸取100 µL 菌液置于MRS 固体平板上，用涂布器均匀涂布，在37 ℃条件下进行厌氧倒置培养48 h，观察菌落生长情况并进行计数。
1.3.4 益生元活性测定
根据Mazzola 等[11]及Huebner 等[12]的方法适当修改后测定益生元的活性。具体测定方法：将培养的发酵乳杆菌CECT 5716 分别接种到含有不同益生元的改良培养基中，于37 ℃下培养48 h，使用全自动生长曲线分析仪每隔1 h 测量600 nm 处的吸光度。以不添加碳源的组别作为阴性对照，添加葡萄糖的组别作为阳性对照。
此外，将过夜培养的大肠杆菌ATCC 25645 作为主要致病菌株的肠溶混合物接种到添加益生元的改良MRS 培养基中，在37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，使用全自动生长曲线分析仪分别测量其0 h 和24 h 在600 nm 处的吸光度。以不添加碳源的组别作为阴性对照，添加葡萄糖的组别作为阳性对照。
1.3.5 益生元分数计算
根据Mazzola 等[11]和Huebner 等[12]的方法计算益生元分数（Y）。
式中：A24 为在含有益生元培养基中生长24 h 后乳酸菌的OD600 值；A0 为在含有益生元培养基中生长0 h 后乳酸菌的OD600 值；B24 为含有葡萄糖培养基中生长24 h 后乳酸菌的OD600 值；B0 为在含有葡萄糖培养基中生长0 h 后乳酸菌的OD600 值；C24 为在含有益生元培养基中生长24 h 后的肠溶混合物的OD600 值；C0 为在含有益生元培养基中生长0 h 后肠溶混合物的OD600 值；D24 为在含有葡萄糖培养基中生长24 h 后肠溶混合物的OD600 值；D0 为在含有葡萄糖培养基中生长0 h 后肠溶混合物的OD600 nm 值。
1.3.6 益生元与活性物质的协同作用
将发酵乳杆菌CECT 5716 接种到含有不同活性物质的培养基中，37 ℃培养，并于0、6、24、30、48 h 测定其在600 nm 的吸光度，绘制生长曲线，研究低聚糖与大豆多肽、酚类物质（没食子酸、槲皮素、茶多酚）、微量营养素（K+、Fe3+、Ca2+）的协同作用对发酵乳杆菌CECT 5716 的影响。
1.3.7 活性物质用量的确定
分别配制含有不同浓度活性物质（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L）的改良培养基，接种发酵乳杆菌CECT 5716 后于37 ℃培养，使用全自动生长曲线分析仪测量其在0、6、24、48 h 时在600 nm 处的吸光度。
1.3.8 反气泡微胶囊的制备
收集发酵乳杆菌CECT 5716，重悬于等体积低聚果糖（2.5 g/L）和没食子酸（2.0 g/L）的混合溶液中，作为内水相（W1）。用超声处理含有疏水气相二氧化硅（质量分数1%）的正己烷，制备有机油相（O）。混合内水相与有机油相（质量比1∶3），剪切制备包埋益生菌的单层W1/O 乳液。在含有低聚果糖（2.5 g/L）和没食子酸（2.0 g/L）的混合溶液中加入疏水气相二氧化硅（质量分数2.5%），超声制备外水相（W2）。随后，将制备的单层W1/O 乳液与外水相等体积，剪切制备W1/O/W2 乳液。
将制备的W1/O/W2 乳液进行冷冻干燥移除油相，得到反气泡微胶囊粉。将其在含有益生元和活性物质的水相中复溶得到具有气体保护层的益生菌微胶囊，即反气泡微胶囊（W1/G/W2）。
1.3.9 反气泡微胶囊特性分析
1.3.9.1 粒径分析
将0.1 g 反气泡微胶囊粉重悬于20 mL 外水相（不含气相二氧化硅），形成反气泡结构，静置10 min后用激光粒度分析仪测定气泡微胶囊的平均粒径。
1.3.9.2 包埋率测定
将0.1 g 反气泡微胶囊粉重悬于20 mL 外水相（不含气相二氧化硅），形成反气泡结构。静置10 min后取1 mL 反气泡下的上清液，进行梯度稀释，并涂布于MRS 固体平板，于37 ℃培养48 h，计数未被包埋的益生菌数。对于游离发酵乳杆菌CECT 5716，取0.01 g 冻干乳酸菌粉加入到20 mL 相同的外水相溶液中，根据1.3.2 的方法进行计数。反气泡微胶囊的包埋率（B，%）计算公式如下。
式中：X 为游离发酵乳杆菌CECT 5716 的活菌总数，CFU/g；Y 为反气泡微胶囊粉中未包埋的活菌数，CFU/g。
1.3.9.3 正己烷检测
使用顶空固相微萃取气相色谱测定乳液中正己烷的残留量。根据李子琰等[13]的方法并作调整。取5 mL 反气泡微胶囊加入顶空进样瓶中，封闭后将顶空瓶立即放到恒温磁力搅拌器上加热搅拌，加热温度55 ℃，加热时间35 min，转子转速600 r/min。平衡和萃取温度均为55 ℃，平衡5 min，然后插入固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）纤维头，顶空萃取15 min。萃取完毕后，立即将SPME 纤维头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，于250 ℃解吸5 min。
气相色谱（gas chromatography，GC）条件：起始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升温到180 ℃，保持1 min，7 ℃/min 升温到250 ℃，保持5 min；进样口温度为250 ℃，传输线为230 ℃；载气为He 气，流速2.0 mL/min；不分流进样[14]。
质谱（mass spectrometry，MS）条件：离子源温度为220 ℃，接口温度：220 ℃。电离方式为离子源（electron impact，EI），电 子 能 量70 eV，扫描范围m/z 30.01~500.00。发射电流100µA，检测电压1.4 kV[15]。
1.3.10 反气泡微胶囊在冻干酸奶块中应用
1.3.10.1 反气泡微胶囊冻干酸奶块的配方及其工艺流程
将酸奶与反气泡微胶囊混合，制备新型冻干酸奶块，工艺流程如下。
反气泡微胶囊冻干酸奶块配方如表1 所示。
表1 反气泡微胶囊冻干酸奶块配方（以每100 g 样品计）
Table 1 Ingredients of freeze-dried yogurt blocks with antibubble microcapsules
配料酸奶白砂糖脱脂乳粉麦芽糖浆麦芽糊精果胶添加量/g 28 20 25 15 11 1
1.3.10.2 反气泡微胶囊冻干酸奶块的基础成分测定
蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[16]测定，脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[17]测定，水分含量参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[18]、碳水化合物参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》[19]测定，以含有游离菌株的冻干酸奶块为对照。
1.3.10.3 反气泡微胶囊冻干酸奶块的复水时间
参考Ismall 等[20]的研究方法，将30 g 样品在70 g水中进行复水，观察计时。
1.3.10.4 反气泡微胶囊冻干酸奶块的质构分析
在室温下保存24 h 后用质构分析仪测定样品的硬度和脆度。测试前后速度分别为4.0 mm/s 和1.0 mm/s，测试后探头回程速度为1.0 mm/s，下压变形50%，触发力10 g，探头类型为HDP/3 PB。硬度和脆度分别定义为最大峰值力（kg）和梯度（kg/s），测试温度为20 ℃。
1.3.10.5 反气泡微胶囊冻干酸奶块的益生菌计数
分别取1 g 冻干前后的样品加入9 mL 的蒸馏水，充分搅拌混合后根据1.3.2 中描述的方法进行发酵乳杆菌CECT 5716 计数。
1.4 数据处理
所有试验均平行重复3 次，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 22.0 软件进行误差分析及显著性分析，使用Origin 2019 软件作图。
2 结果与分析
2.1 益生元筛选
以葡萄糖为阳性对照，比较8 种常用商业益生元对发酵乳杆菌CECT 5716 活性的促进效果，结果如图1所示。
图1 发酵乳杆菌CECT 5716 在不同益生元培养基中的生长情况
Fig.1 Growth of Lactobacillus fermentum CECT 5716 in the media supplemented with different prebiotics
由图1 可知，不同种类的益生元对发酵乳杆菌CECT 5716 的生长具有不同程度的促进作用。在对照组中，发酵乳杆菌CECT 5716 的生长基本停滞，说明葡萄糖或其他低聚糖对乳酸菌的生长起到了一定的促进作用，这也证实了益生元可以作为碳源促进益生菌的生长。在37 ℃下培养48 h 后，发酵乳杆菌CECT 5716 在添加低聚果糖、低聚半乳糖和低聚异麦芽糖的培养基中OD600 nm 分别增加了0.585、0.499 和0.550，表明这3 种益生元对于发酵乳杆菌CECT 5716 活性的促进作用较好，均优于葡萄糖。而乳糖醇对发酵乳杆菌CECT 5716 的生长促进效果最弱，其OD600 nm 的增加量仅为0.018。
2.2 益生元分数计算
在相同益生元存在情况下，益生菌和有害菌存在竞争关系，会根据自身的特异性选择对自身有益的益生元组别[21]。发酵乳杆菌CECT 5716 的益生元分数如图2 所示。
图2 发酵乳杆菌CECT 5716 的益生元分数
Fig.2 Prebiotic fractions obtained with Lactobacillus fermentum CECT5716
由图2 可知，在以低聚果糖、低聚半乳糖和低聚异麦芽糖为底物时，其益生元分数为正值，其中低聚果糖的益生元分数最高，为0.231；低聚半乳糖的益生元分数次之，为0.101。Mishra 等[22]研究发现低聚果糖相比于菊粉等其他益生元可以更好地为益生菌的增殖提供营养支持。低聚果糖可以选择性地刺激益生菌生长，尤其是双歧杆菌属和乳酸杆菌属，这与本试验结果相符[23]。而其它益生元的益生元分数均为负值，以阿拉伯半乳聚糖作为碳源时的益生菌分数最少，为-1.912。从试验结果可以看出，同一菌株在含有不同益生元的培养基培养时，所得到的益生元分数差异很大。由于乳酸菌及相关菌群有效利用不同类型的益生元需要有相应的水解及转运体系，由此推测不同细菌中可能有/无编码上述代谢体系的基因，造成了益生元分数的差异。根据上述结果选择低聚果糖作为后续试验的益生元。研究不同浓度低聚果糖对发酵乳杆菌CECT 5716生长的促进作用，确定低聚果糖的添加量为2.5 g/L。
2.3 益生元与活性物质的协同作用
通过活力测定考察低聚果糖与大豆多肽、酚类物质（没食子酸、槲皮素、茶多酚）和微量营养素（K+、Fe3+、Ca2+）的协同作用对发酵乳杆菌CECT 5716 生长繁殖的促进作用，结果如图3 所示。
图3 低聚果糖与活性物质协同作用对发酵乳杆菌CECT 5716 生长的促进效果
Fig.3 Promoting effects of oligofructose combined with active substances on the growth of Lactobacillus fermentum CECT 5716
由图3 可知，低聚果糖和没食子酸的协同作用最好，其OD600 nm 增加了0.523。在培养基中加入槲皮素后，溶液整体颜色发生明显变化，影响OD 值的测定，同时其OD600 nm 的增量低于没食子酸。因此，对于发酵乳杆菌CECT 5716 的生长促进效果最好的组合是没食子酸与低聚果糖。这可能是由于益生菌可以将复杂的多酚转化为低分子量化合物，使其更容易吸收并发挥与益生元类似的作用[24]。
将不同浓度的没食子酸添加到含有低聚果糖的改良MRS 培养基中，研究没食子酸的添加量对发酵乳杆菌CECT 5716 生长的促进作用，结果如图4 所示。
图4 不同浓度没食子酸与低聚果糖的协同作用对于发酵乳杆菌CECT 5716 的生长促进效果
Fig.4 Promoting effects of different concentrations of gallic acid combined with oligofructose on the growth of Lactobacillus fermentum CECT 5716
由图4 可知，当没食子酸的浓度为2.0 g/L 时，其与低聚果糖的协同作用对于益生菌的生长促进效果最好，此时发酵乳杆菌CECT 5716 的OD 600 nm 增加了0.668。没食子酸与益生菌的生长促进效果呈浓度依赖性增强，因为没食子酸本身具有抗菌活性，其氧化代谢产物的毒性会加速益生菌的死亡。Wu 等[25]研究发现当没食子酸的添加量大于2.5 g/L 时，会降低菌株生物膜中的胞外多糖水平，起到抑制菌株生长的作用。多酚类化合物与菌株的细胞膜相互作用可溶解磷脂双分子层，促使脂肪酸链间排列对齐，在物理结构上的改变可使菌株的细胞膜呈现不稳定的状态，增加其流动性和被动渗透性，从而降低菌株的生存活性[26]。综上，反气泡微胶囊选择水相组分为2.5 g/L 低聚果糖和2.0 g/L活性物质没食子酸。
2.4 反气泡微胶囊特性分析
微胶囊的大小不但影响益生菌的活力，还对食物的质构和感官有一定的影响。通常，微小的微胶囊无法起有效的保护作用，而体积大的微胶囊虽能起到一定的防护功能，但其在产品中的分散性较差，易产生颗粒感，影响食品的质构和感官[27]。食品中当微胶囊的粒径小于100µm 时，一般不会对其感官造成影响[28]。正己烷一般以溶剂的形式存在，并且会随着柱温的升高而缩短出峰时间。当柱温为40 ℃时，正己烷的出峰时间在4.66 min 左右[29]，因此对前6 min 出峰的物质进行分析。反气泡微胶囊的GC-MS 分析结果如图5 所示。
图5 反气泡微胶囊的GC-MS 分析
Fig.5 GC-MS results of anti-bubble microcapsules
本试验制备的反气泡微胶囊的包埋率为（66.71±0.85）%，平均粒径为（42.18±0.27）µm，适于在食品中应用。由图5 可知，前6 min 出现的6 个峰所代表的物质分别是C6H10O3、CHCl3、C5H11NO2、C18H37NO、C4H10O、C9H20O2，并未检测到正己烷。因此，反气泡益生菌微胶囊可应用于食品中。
2.5 反气泡微胶囊在冻干酸奶块中的应用
2.5.1 基础成分测
反气泡微胶囊冻干酸奶块的成品如图6 所示，产品基础成分测定结果如表2 所示。
表2 反气泡微胶囊冻干酸奶块的基本成分
Table 2 Basic components of freeze-dried yogurt blocks with antibubble microcapsules
注：*表示同列数据差异显著（P<0.05）。
样品游离菌株冻干酸奶块反气泡微胶囊冻干酸奶块碳水化合物含量/%55.82±0.03 60.03±0.01*蛋白质含量/%22.97±0.02 23.19±0.02*脂肪含量/%7.82±0.02 8.52±0.02*水分含量/%7.03±0.03*4.39±0.05复水时间/s 28.64±0.56*26.22±0.13
由表2 可知，两种样品的蛋白质和脂肪含量存在显著变化（P<0.05）。添加低聚果糖后，反气泡微胶囊冻干酸奶块的碳水化合物含量相比于对照样品增加了4.21%。相同冻干条件下，反气泡微胶囊冻干酸奶块的水分含量为4.39%，低于对照组（7.03%）。水分含量影响冻干酸奶块的保质期，所以反气泡微胶囊冻干酸奶块的保质期更长，品质更加稳定。反气泡微胶囊冻干酸奶块的复水时间为（26.22±0.13）s，低于游离菌株冻干酸奶块的复水时间（28.64±0.56）s。复水时间可能与冻干酸奶块的体积密度大小有关，与Lao 等[30]的研究结果类似。
2.5.2 质构分析及益生菌计数
冻干酸奶块的硬度和脆度在一定程度上反映了冻干酸奶块的品质。硬度越大，产品的酥脆性越好。硬度增加是由于结构崩塌，颗粒在黏性的作用下凝聚成烧结层，导致探头下压过程受到的阻力较大。脆度是冻干酸奶块的一个重要的质地特征，所有的酸奶零食均存在可接受的脆度[31]。反气泡微胶囊冻干酸奶块酸奶的质构分析及益生菌计数结果如表3 所示。
表3 反气泡微胶囊冻干酸奶块酸奶的质构分析及益生菌计数
Table 3 Textural properties and probiotic counts of freeze-dried yogurt blocks with and without anti-bubble microcapsules
注：*表示同列数据差异显著（P<0.05）。
样品游离菌株冻干酸奶块反气泡微胶囊冻干酸奶块硬度/kg 1 337.23±112.57 1 615.73±78.76*脆度/（kg/s）143.48±15.29 195.85±14.48*冻干前益生菌数量/[lg（CFU/g）]10.98±0.02 11.07±0.01*冻干后益生菌数量/[lg（CFU/g）]10.32±0.07 10.49±0.12*
由表3 可知，加入反气泡微胶囊的冻干酸奶块的硬度和脆度均高于游离菌株冻干酸奶块。反气泡微胶囊冻干酸奶块中存在低聚果糖，可能导致产品的硬度发生变化。活菌计数结果表明反气泡微胶囊的冻干酸奶块活菌数仅减少了0.58 lg（CFU/g），低于对照组的0.66 lg（CFU/g）。为对人体产生有益的影响，在产品中益生菌的有效浓度需大于106 CFU/g[32]。在冻干酸奶块中加入反气泡微胶囊后活菌数可以达到1×1010 CFU/g。但相较于反气泡微胶囊冻干酸奶块，游离菌株冻干酸奶块的活菌数损失较少，可能反气泡微胶囊在菌落计数的时候未解囊完全，不能使菌株全部释放出来，导致菌落计数不完全。
3 结论
通过益生元对发酵乳杆菌CECT 5716 活性的影响和益生元活性分数的进行计算，结果表明2.5 g/L 低聚果糖与2.0 g/L 没食子酸协同作用对于益生菌活性的促进效果最佳。基于此制备合生元反气泡微胶囊并应用于冻干酸奶块，发现微胶囊能够有效保护发酵乳杆菌CECT 5716 可在冻干酸奶块中的存活，并且反气泡微胶囊在冻干酸奶块中的添加提高了冻干酸奶块的水合能力以及硬度、脆度。综上，益生元与活性物质的协同作用对发酵乳杆菌的活性有一定的促进作用。本研究为益生元协同作用对益生菌活性的保护和微胶囊在食品中应用提供参考。
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